粉防己碱对转化生长因子-β1诱导的人近端小管上皮细胞转分化的干预作用及机制

目的探讨粉防己碱(tetrandrine,Tet)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)转分化的拮抗效应及其机制。方法体外培养的HK-2随机分为正常对照组、Tet组(100ng/ml)、TGF-β1(5ng/ml)组和TGF-β1(5ng/ml)+Tet(100ng/ml)组。Westernblot法检测细胞中TβRI蛋白、SnoN蛋白水平、Smad7蛋白水平和Smad2/3磷酸化水平的改变;半定量反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法观察细胞中TβRI mRNA、Smad7 mRNA、SnoN mRNA表达的改变。免疫荧光检测间充质细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果 Tet能抑制TGF-β1诱导α-SMA的表达,显著上调SnoN mRNA和蛋白的表达(P<0.01);Tet对TβRI表达、Smad2/3的磷酸化及Smad7的表达没有影响。结论 Tet能抑制人近端小管上皮细胞转分化,其机制与Tet上调SnoN表达有关。     

基于TGF-β1/AKT信号通路的西格列汀对人肾小管上皮细胞转化的干预及机制

目的:观察西格列汀(sitagliptin,SIT)对高糖诱导的肾小管上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的干预效应及对AKT信号通路的影响,探讨西格列汀防治早期糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的作用机制。方法:将体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)分为正常组(NG,5.56 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,60 mmol/L葡萄糖)、西格列汀组(SIT组,60 mmol/L葡萄糖+1,5,10μmol/L西格列汀)、TGF-β1抑制剂组(60 mmol/L葡萄糖+5μmol/L SB-431542)。MTT法检测细胞活力;ELISA法检测细胞中TGF-β1蛋白分泌;蛋白质印迹法检测细胞中Akt蛋白磷酸化水平及EMT指标蛋白质变化。结果:高糖提高了肾小管上皮细胞的活力,促进TGF-β1蛋白分泌,激活AKT蛋白磷酸化,降低细胞中上皮表型蛋白质E-cadherin的表达,并增加间质表型蛋白质α-SMA的表达。西格列汀显著降低HK-2细胞的活力,降低高糖环境下TGF-β1蛋白分泌,降低AKT蛋白磷酸化水平,改善E-cadherin表达的减少及α-SMA表达的增加。结论:西格列汀可以改善高糖诱导的HK-2细胞上皮-间充质转分化,此效应可能与抑制TGF-β1/AKT信号通路有关。     

TGF-β1诱导体外培养人肾小管上皮细胞的表型转化

目的观察TGF-β1诱导体外培养人肾小管上皮细胞系HK-2细胞的表型转化。方法免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测TGF-β1诱导培养HK-2细胞,其上皮细胞标记物和间充质细胞标记物表达的改变。结果在TGF-β1浓度分别为1μg/L、5μg/L和10μg/L条件下,诱导培养HK-2细胞48h,免疫细胞化学染色显示各诱导组细胞均出现了间充质细胞标记物α-平滑肌动蛋白(α-SMA)的可疑阳性表达;继续诱导72h,细胞α-SMA阳性表达明确;同时上皮细胞标记物E-钙粘连蛋白表达明显降低甚至消失,广谱角蛋白阳性表达未见明显改变。在TGF-β1浓度为5μg/L诱导组,α-SMA阳性表达为最强。RT-PCR结果也显示TGF-β1诱导42h,HK-2细胞出现了间质细胞标记物α-SMA和波形蛋白mRNA表达的增高,间充质细胞标记物mRNA表达的增高也是以5μg/L TGF-β1组为最明显,上皮细胞标记物细胞角蛋白-19mRNA的阳性表达未见明显改变。结论 TGF-β1可诱导体外培养HK-2细胞出现上皮向间充质细胞的表型转化,表型转化能力与TGF-β1剂量相关。     

HPIP基因siRNA对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞上皮-间充质转化及凋亡的影响

目的:探讨抑制HPIP基因表达对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及凋亡的影响。方法:10ng/mL的TGF-β1刺激HK-2细胞24,48h,Western印迹法检测HPIP蛋白表达。将HK-2细胞随机分为空白组、TGF-β1组和TGF-β1+si-HPIP组,处理24 h后,Western印迹法检测HPIP,E-cadherin,α-SMA,N-cadherin,Snail,Twist,t-AKT,p-AKT和Ba x蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:TGF-β1刺激HK-2细胞24,48h后HPIP蛋白表达均显著高于对照组(0h)(P0.05)。TGF-β1组E-cadherin蛋白表达显著低于空白组,α-SMA,N-cadherin,Snail,Twist,p-AKT和Bax蛋白表达及细胞凋亡率均显著高于空白组(P0.05),而TGF-β1+si-HPIP组E-cadherin蛋白表达显著高于TGF-β1组,α-SMA,N-cadherin,Snail, Tw i st, p-A KT和Ba x蛋白表达及细胞凋亡率均显著低于TG F-β1组(P 0. 0 5)。结论:抑制HPIP基因表达可延缓肾小管上皮细胞EMT进程和降低细胞凋亡率,机制可能与下调PI3K/AKT信号有关。     

DDK1阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制百草枯诱导的肺成纤维细胞转分化北大核心CSCD

目的探讨抑制Wnt/β-catenin信号通路对百草枯(paraquat,PQ)诱导的人胚肺成纤维细胞(MRC-5)转分化的影响及相关分子机制。方法将MRC-5细胞分为三组,对照组(Control组):不加药物处理;PQ组:以50μmol/L的PQ刺激MRC-5细胞72 h诱导建立转分化模型;PQ+DKK1组:以50μmol/L的PQ和10 ng/mL的DKK1同时处理细胞72 h。收集细胞,采用细胞免疫荧光和Western Blot分别检测三组细胞转分化标记物α-SMA、Vimentin和Collagen I的表达水平;同时,应用Western Blot、细胞免疫荧光和实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测转分化过程中Wnt通路相关信号分子β-catenin、Cyclin D1和WISP1的表达变化情况;进一步采用Wnt/β-catenin通路抑制剂Dickkopf-1(DKK1)阻断该信号途径,Western Blot检测β-catenin、Cyclin D1和WISP1表达变化情况,以验证干预效果并分析干扰Wnt/β-catenin信号传递对转分化标记分子α-SMA、Vimentin和Collagen I表达的影响。结果处理72 h后,与对照组细胞相比,PQ组MRC-5细胞α-SMA、Vimentin和Collagen I的表达水平均显著增加(P<0.05);同时,在PQ诱导MRC-5转分化过程中β-catenin、Cyclin D1和WISP1表达水平显著上调(P<0.05);采用DKK1干扰Wnt/β-catenin信号通路能够抑制PQ诱导MRC-5细胞转分化过程中α-SMA、Vimentin和Collagen I的高表达(P<0.05)。结论DKK1能够通过干扰Wnt/β-catenin信号的激活抑制PQ诱导的成纤维细胞转分化,有望进一步抑制PQ中毒引起的肺纤维化的发生。     

整合素连接激酶在肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的探讨整合素连接激酶（ILK）在转化生长因子β1（TGF-β1）介导的肾小管上皮细胞转分化（EMT）中的表达及作用。方法采用不同浓度的TGF-β1刺激体外培养的人肾小管上皮细胞（HKC）,观察HKC形态学改变,并应用Western blotting方法检测其ILK、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,实时RT-PCR法测定ILK、α-SMA、纤维连接蛋白（FN）、E钙黏蛋白（E-cadherin）mRNA的表达。结果（1）细胞形态学改变：在TGF-β1刺激下HKC细胞由正常状态下的圆形或卵圆形变为梭形,且随着孵育时间的延长,梭形细胞比例增大。（2）Western blotting和实时RT-PCR检测结果：在TGF-β1刺激下,ILK和α-SMA的蛋白表达量显著增加;ILK、α-SMA和FN的mRNA表达量也明显升高,而E-cadherin mRNA表达量明显减少。TGF-β1呈时间和剂量依赖性刺激HKC表达ILK蛋白和mRNA。（3）相关分析：ILK蛋白表达量与α-SMA蛋白表达量呈正相关（r=0.940,P〈0.01）;ILK mRNA表达量与α-SMA mRNA、FN mRNA表达量呈正相关（r=0.926,r=0.915,P〈0.01）,与E-cadherin mRNA表达量呈负相关（r=-0.820,P〈0.01）。结论ILK参与TGF-β1诱导的肾小管EMT,并在其中发挥关键作用。     

肝细胞生长因子对肾小管上皮细胞转分化及整合素连接激酶表达的影响

目的探讨肝细胞生长因子（HGF）在转化生长因子β1（TGF-β1）介导的肾小管上皮细胞转分化中的作用及对整合素连接激酶（ILK）表达的影响。方法将体外培养人肾小管上皮细胞（HKC）分为正常对照组、TGF-β1刺激组和HGF干预组。应用Western blotting方法检测ILK、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的蛋白表达,实时RT-PCR法测定ILK、α-SMA、纤维连接蛋白（Fn）、E钙黏蛋白（E-cadherin）的mRNA表达。结果在TGF-β1刺激组,ILK和α-SMA的蛋白表达量显著增加,ILK、α-SMA和Fn的mRNA表达量也明显升高,E-cad-herin mRNA表达量则明显降低（与正常对照组比较,P〈0.001）。而在HGF干预组,ILK、α-SMA的蛋白表达量以及ILK、α-SMA、Fn的mRNA表达量均较TGF-β1刺激组显著降低,E-cadherin mRNA表达量则明显升高（与TGF-β1刺激组比较,P〈0.01）。结论HGF能抑制TGF-β1介导的肾小管上皮细胞转分化,并可降低ILK蛋白和mRNA表达水平。     

转化生长因子β1介导的Smad信号通路对人腹膜间皮细胞外基质的调控

目的探讨TGF-β1介导的Smad信号通路对人腹膜间皮细胞(HPMCs)细胞外基质(ECM)的调控机制.方法原代培养的第三代HPMCs分成对照组与5ng/mlTGF-β1刺激组,采用免疫组织化学染色和Western印迹法观察细胞内磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)的表达以及在细胞内的迁移,Western印迹、ELISA和RT-PCR法观察Smad7、结缔组织生长因子(CTGF)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、纤维连接蛋白(FN)和Ⅰ型胶原(COL1)的mRNA及蛋白表达.结果①对照组细胞内几乎不表达p-Smad22/3,在刺激后15 min蛋白表达增加,主要分散在细胞质中,1h达高峰,主要集中在细胞核及周边,2h明显回落,又分散至细胞质中;②刺激组细胞内Smad7、CTGF、α-SMA和COL1的蛋白表达与对照组比均增加,其中Smad7、CTGF和α-SMA在48h最明显,COL1呈时间依从性;刺激组上清液PAI-1的蛋白含量与对照组比均增加,其中24h最高,FN呈时间依从性;刺激组Smad7的mRNA表达与对照组比呈时间依从性增加,CTGF、α-SMA、PM-1、FN和COL1均增加,其中CTGF和α-SMA在48h最高,PAI-1在24h最高,FN和COL1呈时间依从性.结论TGF-β1能特异性激活HPMCs内Smad信号通路,并可通过诱导该通路下游靶基因Smad7、CTGF、α-SMA、PAI-1、FN和COL1的转录与表达参与对ECM的调控.     

PI3K/Akt信号通路对转化生长因子β1诱导的人肺上皮-间质细胞转分化的影响

目的:探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)通路在转化生长因子β1(TGF-β1)体外诱导的人肺上皮细胞A549间充质化过程中的作用。方法:将体外培养的A549细胞随机分成3组:正常对照组、TGF-β1组及抑制剂组,正常对照组不加入TGF-β1,TGF-β1组加入10ng/mLTGF-β1,抑制剂组加入TGF-β1(10ng/mL)和PI3K的抑制剂Ly294002(10nmol/L),72h后通过RT-PCR检测各组A549细胞上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cad)及间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的变化,ELISA方法检测间充质细胞标志物纤连蛋白(Fn)表达的变化,Westernblot检测Akt磷酸化(p-Akt)水平的变化。所有实验至少重复3次。结果:正常体外培养的A549细胞有E-cad表达及微量的α-SMA、Fn、p-Akt表达;TGF-β1组E-cad的表达下调,α-SMA、Fn、p-Akt的表达上调;抑制剂组与TGF-β1组比较E-cad的表达上调,α-SMA、Fn、p-Akt的表达明显抑制。结论:PI3K/Akt途径参与TGF-β1介导的肺上皮-间质细胞转分化过程,PI3K特异性抑制剂Ly294002可有效抑制TGF-β1介导的肺上皮-间质细胞转分化过程。     

肝细胞生长因子阻抑TGF-β1诱导大鼠韧带成纤维细胞?琢-SMA过表达及其机制

目的：研究肝细胞生长因子（HGF）能否阻抑TGF-β1诱导的大鼠内侧副韧带（MCL）成纤维细胞?琢-SMA过表达及其可能涉及的信号传导通路。方法：采用组织块培养法培养大鼠MCL成纤维细胞,培养液中加入TGF-β1(5ng/ml)及HGF (10—40 ng/ml)。培养72h后,用RT-PCR检测各组?琢-SMA mRNA及Smad3 mRNA的变化;细胞免疫组化检测?琢-SMA蛋白的表达。结果：TGF-β1能显著诱导?琢-SMA及Smad3的表达(P<0.01),而HGF则可以有效地阻抑其表达,其效应呈剂量依赖性(P<0.05)。结论：HGF可以通过下调Smad3的表达来阻抑TGF-β1诱导的?琢-SMA过表达。这为利用HGF预防和治疗MCL损伤后瘢痕及纤维化在细胞和分子水平提供了依据。     

1,25-二羟维生素D3对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响

目的:探讨1,25-二羟维生素D3对高糖诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化的影响及其可能机制。方法:培养人肾小管上皮细胞并分为正常对照组(含5.5mmol/LD-葡萄糖)、高糖组(含25mmol/LD-葡萄糖)和高糖+1,25-二羟维生素D3组,细胞免疫组化方法测定各组HK-2细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏素(E-cad)的蛋白表达,RT-PCR半定量方法测定各组HK-2细胞的α-SMA和E-cad的mRNA表达。结果:与正常对照组相比,高糖组和高糖+1,25-二羟维生素D3组,α-SMA蛋白表达水平和mRNA表达水平明显升高(P<0.05),E-cad蛋白表达水平和mRNA表达水平明显下降(P<0.05);与高糖组相比,高糖+1,25-二羟维生素D3组α-SMA蛋白表达水平和mRNA表达水平明显下降(6.576±1.044vs.4.715±0.776;0.752±0.086vs.0.491±0.023,P<0.05),而E-cad蛋白表达水平和mRNA表达水平明显上升(2.085±0.553vs.4.970±0.845;0.163±0.036vs.0.478±0.062,P<0.05)。结论:1,25-二羟维生素D3可以抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化,其可能通过下调α-SMA的表达,上调E-cad的表达,从而抑制肾小管上皮细胞转分化,对糖尿病肾病有一定防治作用。     

TGF-β1/Smad4在乳腺癌细胞中的表达及意义

目的:探讨TGF-β1/Smad4信号通路与乳腺癌发生发展的关系。方法:采用荧光定量PCR技术、免疫组织化学技术对30例乳腺癌临床标本及恶性程度不同的乳腺癌细胞株中TGF-β1及Smad4的表达情况进行检测。结果:TGF-β1和Smad4mRNA表达及蛋白表达随着乳腺癌细胞恶性程度增加而逐步下降。结论:TGF-β1/Smad4信号通路参与了乳腺癌的发生、发展过程,TGF-β1/Smad4信号通路可能在乳腺癌演变中起抑制作用,与乳腺癌的恶性程度呈负相关。     

ERKl／2信号通路在高糖诱导的HK-2上皮间质转分化中的作用

目的：观察高糖诱导的细胞外信号调节激酶（ERK1/2）信号通路活化在上皮间质转分化中的作用,从而探讨延缓糖尿病肾病肾间质纤维化的发生机制。方法体外培养HK-2细胞,随机分为正常对照组、高糖组、ERK1/2通路抑制剂PD98059＋高糖组和高渗组,处理72 h后收集细胞,应用免疫细胞化学方法检测α-SMA、CK18的表达;应用Western blot法检测磷酸化ERK1/2、总ERK1/2表达水平的变化。结果（1）正常对照组胞质有大量CK18蛋白阳性表达,而α-SMA蛋白表达呈阴性;高糖组胞质中可见大量α-SMA蛋白强阳性染色,而CK18蛋白呈阴性表达;经PD98059处理后,CK18表达较高糖组染色深,而α-SMA表达较高糖组染色浅;高渗组胞质中CK18呈阳性表达,α-SMA表达呈阴性。（2）正常对照组可见少量总ERK1/2表达,p-ERK1/2蛋白仅有微量表达;经高糖刺激48 h后,总ERK1/2表达较正常对照组无明显差异,p-ERK1/2蛋白表达明显增加（P＜0.05）;而使用PD98059处理后,总ERK1/2的变化不大,但p-ERK1/2蛋白的表达却显著降低（P＜0.05）;高渗组与正常对照组无显著差异。结论 ERK1/2信号通路可能参与了高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化过程,阻断 ERKl/2可部分抑制人近端肾小管上皮细胞的转分化,进而延缓肾小管间质纤维化的发生和发展。     

白藜芦醇抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌成纤维细胞分化的作用和机制

目的研究白藜芦醇(resveratrol,Res)对血管紧张素Ⅱ(angiotension AngⅡ)诱导的心肌成纤维细胞增殖和分化的影响,探讨其抗心肌纤维化的作用及其机制。方法将细胞分为对照组、AngⅡ模型组和Res组。分别用ELISA法检测胶原蛋白collagen I和collagenⅢ含量;采用Western blot法检测PCNA、α-SMA、TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3、Smad7蛋白含量。结果与对照组相比,AngⅡ可明显诱导细胞中PCNA、α-SMA含量增多、细胞培养基中胶原蛋白collagen I、collagenⅢ含量增加、TGF-β1和TGF-βRⅡ、Smad3蛋白水平增多,降低Smad7蛋白含量;而Res可明显改善上述指标。结论Res抗心肌纤维化的作用可能与其抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞的增殖和分化,下调TGF-β1/Smads信号通路有关。     

前列腺癌细胞株PC-3中PKB信号通路拮抗TGF-β信号

目的研究前列腺癌中蛋白激酶B（PKB）信号通路对转化生长因子β（TGF-β）信号通路的调节作用，探讨两信号通路在前列腺癌发生发展中的作用。方法通过生长抑制实验、细胞周期停滞实验、荧光素酶报告基因、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫共沉淀检测PC-3细胞中PKB信号通路对TGF-β信号的调节作用。结果PKB信号通路可以抑制TGF-β反应性的CAGA报告基因活性；应用LY294002（PKB通路特异性抑制剂）可以增强TGF-β抗增殖和诱导细胞周期停滞作用；PKB信号通路的活化和抑制均不能影响TGF-β通路信号分子的表达；LY294002和TGF-β可以协同抑制cyclinD1的表达；LY294002增强TGF-β诱导的P15表达；PKB与Smad3之间存在蛋白质相互作用。结论PKB信号通路通过凋节cyclinD1和P15的表达拈抗TGF-β诱导的抗增殖和诱导细胞周期停滞作用，Smad3与PKB的相互作用可能介导了该作用。PKB信号通路通过上述拈抗性作用促进了前列腺癌的发生发展。     

大蒜素对气道平滑肌细胞α-平滑肌肌动蛋白表达的抑制作用及其机制研究

目的 观察大蒜素对气道平滑肌细胞(ASMC)α-平滑肌肌动蛋白(0-SMA)表达的影响,以评价大蒜素对气道重塑的抑制作用,并探讨其相应的作用机制.方法 用0、2.5、5.0、10.0 μmol/L的大蒜素处理人ASMC细胞48 h后提取细胞总RNA和蛋白.荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞α-SMA mRNA表达,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测细胞α-SMA和磷酸化Smad1(p-Smad1)的蛋白表达.结果 随着大蒜素处理ASMC细胞浓度的提高(0、2.5、5.0、10.0 μmol/L),细胞α-SMA mRNA表达呈进行性下降(分别为0.543±0.121、0.354±0.072、0.223±0.058、0.191±0.034),各剂量间两两比较差异有统计学意义(均P＜0.05);α-SMA和p-Smad1的蛋白表达也呈进行性下降[α-SMA蛋白(灰度值比值)分别为0.96±0.02、0.72±0.16、0.54±0.11、0.31±0.14,p-Smad1蛋白(灰度值比值)分别为0.94±0.03、0.76±0.13、0.62±0.11、0.43±0.12],各剂量间两两比较差异有统计学意义(均P＜0.05).结论 大蒜素可以剂量依赖性地下调ASMC细胞α-SMA的mRNA和蛋白表达,抑制Smad蛋白的磷酸化,阻止转化生长因子-β(TGF-β)和Rho激酶信号通路.     

骨形成蛋白-7对晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化的影响

目的探讨骨形成蛋白-7(BMP-7)对晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化(EMT)的影响。方法晚期糖基化终产物诱导发生上皮-间叶转化的体外培养大鼠腹膜间皮细胞,分别经含5 ng/mL及80 mmol/L晚期糖基化终产物的M199培养基和含10 ng/mL BMP-7及80 mmol/L晚期糖基化终产物的M199培养基培养48 h,以含80 mmol/L晚期糖基化终产物的M199培养基为对照,应用实时定量PCR法检测间皮细胞E-cadherin、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Collagen I)、转化生长因子β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达;应用Western印迹法检测E-cadherin、α-SMA蛋白的表达;应用ELISA法检测间皮细胞TGF-β1、VEGF蛋白表达水平。结果 BMP-7作用后,上皮-间叶转化的大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA和E-cadherin蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。BMP-7作用后,上皮-间叶转化的大鼠腹膜间皮α-SMA、Collagen I、TGF-β1、VEGFmRNA和α-SMA、TGF-β、VEGF蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论 BMP-7能上调上皮-间叶转化的大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin表达和下调α-SMA、Collagen I、TGF-β、VEGF表达,BMP-7能逆转晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT。     

晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化

目的探讨晚期糖基化终产物对大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化(EMT)的影响,建立大鼠腹膜间皮细胞EMT模型。方法体外培养的大鼠腹膜间皮细胞经含40 mmol/L晚期糖基化终产物(AGEs)、80 mmol/L AGEs的M199培养基分别培养48、72 h;以正常M199培养基和含80 mmol/LBSA的M199培养基为对照。采用相差显微镜观察细胞形态学改变,应用实时定量PCR法检测间皮细胞E-cadherin、α-SMA、Collagen I、TGF-β1、VEGF mRNA的表达;应用Western blot检测E-cadher-in、α-SMA蛋白的表达;应用ELISA法检测间皮细胞TGF-β1、VEGF蛋白表达水平。结果①AGEs(40 mmol/L、80 mmol/L)刺激后,大鼠腹膜间皮细胞由典型的上皮细胞形态逐渐变为梭形及不规则形,类似肌成纤维细胞;②AGEs(40 mmol/L、80mmol/L)刺激后,大鼠腹膜间皮细胞α-SMA、Collagen I、TGF-β1、VEGF mRNA和α-SMA、TGF-β、VEGF蛋白表达水平显著增加(P<0.05);③AGEs(40 mmol/L、80 mmol/L)刺激后,大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA和E-cadherin蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论 AGEs能上调α-SMA、Collagen I、TGF-β、VEGF表达和下调E-cadherin表达,AGEs诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT。     

纤维细胞生长因子1对转化生长因子β1诱导的人肾成纤维细胞活化纤维化的保护作用

目的:探讨纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor 1,FGF1)对转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)诱导的人肾成纤维细胞活化纤维化的保护作用及机制。方法:将NRK-49F细胞过表达FGF1后,用2 ng/mL TG F-β1刺激诱导肾纤维化模型。24h后观察细胞密度及BrdU阳性率;MTT法测定细胞活力;细胞免疫荧光和蛋白质印迹法检测NRK-49F细胞中α-SMA和FN蛋白表达水平;细胞免疫荧光和蛋白质印迹法检测NRK-49F细胞中p-S6,p-Akt(Ser473),β-caten in和p-Smad 3 (Ser 423/425)蛋白的表达和分布的变化。结果:外源性TGF-β1促进肾成纤维细胞体外增殖,而过表达FGF1可以降低TGF-β1诱导的肾成纤维细胞增殖,减轻由TGF-β1处理刺激的肾成纤维细胞活化;FGF1过表达可以抑制TGF-β1诱导的Akt/β-catenin改变,但不抑制Smad信号转导。结论:FGF1可能是通过Akt/β-catenin通路实现对TGF-β1诱导的人肾成纤维细胞活化纤维化的保护作用。     

视紫红质蛋白激酶抑制剂4-氨基吡啶类化合物对大鼠腹膜间皮细胞转分化的作用

背景:有实验证明,Rho/ROCK信号通路在转分化过程中发挥了重要作用.目的:探讨视紫红质蛋白激酶抑制剂4-氮基吡啶类化合物对转化生长因子β1诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化的影响.设计、时间及地点:动物实验观察,2007-03/2008-03在中山大学附属第一医院肾脏病实验室完成.材料:健康清洁级雄性SD大鼠10只,由中山大学动物实验中心提供.4-氨基吡啶类化合物为德国Calbiochem公司产品.转化生长因子β1为美国R&D公司产品.方法:体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞,第2代细胞静止24 h后,随机分为4组:正常对照组:用无血清的DMEM/F12培养基培养:转化生长因子β1组:用无血清的DMEM/F12培养基培养,加入转化生长因子β1 10 μg/L;4-氨基吡啶类化合物组:用无血清的DMEM/F12培养基培养,加入4-氨基吡啶类化合物10 μmol/L.转化生长因子β1+4-氨基吡啶类化合物组:其中4-氨基吡啶类化合物(10 μmol/L)提前孵育2 h进行干预处理后再加入转化生长因子β1.48h后收集细胞.主要观察指标:用RT-PCR方法检测E-钙黏素、α-SMA mRNA表达,Western Blot检测E-钙黏素、α-SMA和波形蛋白表达.结果:转化生长因子β1组与正常对照组比较E-钙黏素明显下调,波形蛋白和α-SMA的表达明显上调;4-氨基吡啶类化合物能显著下调α-SMA和波形蛋白的表达(P＜0.05),但不能上调E-钙黏素的表达.结论:转化生长因子p1能够诱导腹膜间皮细胞的转分化;4-氨基吡啶类化合物能够改善转化生长因子B1诱导的大鼠腹膜问皮细胞转分化.