NK细胞对小鼠异基因骨髓移植造血及免疫重建的影响

目的　研究自然杀伤 (NK)细胞在小鼠异基因骨髓移植 (allo BMT)中对造血及免疫重建的影响。方法　以近交系小鼠C5 7BL/ 6 (H 2 b)为供鼠、BALB/c(H 2 d)为受鼠 ,在allo BMT同时输入供鼠外周T细胞和 (或 )NK细胞 ,计数受鼠移植后不同时间的白细胞数 ;用流式细胞仪检测骨髓CD34 细胞和外周淋巴细胞中CD3 和CD19 细胞及表达供鼠基因的H 2Kb 细胞百分率 ,比较不同移植组存活率、植入水平、造血及免疫重建等。结果　输入供鼠外周NK细胞移植组与不输入NK细胞组比较 ,存活率显著增高 (6 0d存活率为 70 %vs 0 % ) ;白细胞计数、CD19 细胞及骨髓CD34 细胞计数恢复快 ;H 2Kb 细胞表达水平高 (86 .6 8± 4 .4 5vs 4 .6 8± 0 .32 )。移植后第 2 8天 ( 2 8天 )输入NK细胞组CD3 细胞水平 [(33.6 9± 3.36 ) % ]低于未输入NK细胞组 [(5 0 .4 0± 5 .0 6 ) % ](P <0 .0 1) ,在 6 0天两组比较差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　在小鼠allo BMT中 ,同种异基因反应性NK细胞可以提高造血干细胞的植入水平、促进造血及免疫重建、增高移植受鼠的生存率。     

小鼠脂肪源间充质干细胞在重型再生障碍性贫血中的应用

背景:骨髓间充质干细胞联合造血干细胞移植是最有希望解决造血重建缓慢的策略之一,但临床实施中,抽取骨髓进而分离、扩增间充质干细胞尚不能为大部分健康供者所接受。目的:探讨小鼠脂肪源间充质干细胞对异基因重型再生障碍性贫血模型鼠造血功能的影响。设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2007-05/11在河南省肿瘤医院中心实验室完成。材料:雄性6~8周龄BALB/c(H-2Kd)小鼠20只,雌性7~8周龄C57BL/6(H-2Kb)小鼠50只,均购于河南省实验动物中心。方法:贴壁法体外分离培养20只雄性BALB/c小鼠脂肪源间充质干细胞;反复吹打20只雌性C57BL/6(H-2Kb)小鼠骨髓细胞,加入EDTA-NH4Cl液去除红细胞,即为骨髓有核细胞。剩余30只雌性C57BL/6(H-2Kb)小鼠均给予一次全身3.0Gy60Co-γ照射,照射后第4,5,6天皮下注射环磷酰胺及氯霉素,建立重型再生障碍性贫血模型。模型鼠随机分为3组,联合组经尾静脉输入骨髓有核细胞2×107个 脂肪源间充质干细胞3×106个,骨髓有核细胞组单纯输入骨髓有核细胞2×107个,对照组输入生理盐水0.2mL,10只/组。主要观察指标:定期检测外周血和股骨有核细胞数以及巨噬细胞/粒细胞集落形成单位数的变化,PCR法鉴定Y染色体,流式细胞仪检测移植小鼠骨髓及脾脏CD3和H-2Kd阳性表达情况。结果:细胞移植后第2周,联合组外周血有核细胞数、股骨有核细胞数、巨噬细胞/粒细胞集落形成单位数均明显高于骨髓有核细胞组(P<0.05),且随移植时间的延长,各种细胞数量逐渐恢复(P<0.05)。细胞移植后第4周(即造血恢复期),联合组外周血可特异性地扩增Y染色体的SRY基因片段,移植小鼠骨髓及脾脏中CD3和H-2Kd双阳性细胞达6.66%,提示在受体小鼠体内有供体细胞的存在。结论:脂肪源间充质干细胞能够重建重型再生障碍性贫血小鼠的造血功能,促进小鼠造血系统的恢复。     

白血病小鼠单倍型相合骨髓移植的归巢

背景:移植后造血干细胞的顺利归巢是单倍相合骨髓移植成功的关键.目的:构建小鼠白血病模型,进行单倍型相合的骨髓移植,动态观察受体小鼠体内移植细胞归巢率及不同时间点的归巢规律.设计、时间及地点:随机对照观察实验,于2005-11/2007-10在福建医科大学实验动物中心清洁级动物实验室进行.材料:供鼠为清洁级近交系C57BL/6小鼠和C57BL/6小鼠与BALB/c 小鼠杂交的雄性F1小鼠,受鼠为清洁级近交系雌性BALB/c小鼠,用于构建白血病小鼠模型.方法:将48只造模小鼠随机分为2组,对照组供鼠为C57BL/6小鼠,实验组供鼠为F1小鼠.实验组进行主要组织相容性复合物单倍型相合的同种异基因骨髓移植,对照组进行主要组织相容性复合物完全不相合的骨髓移植.主要观察指标:移植后1,2,3,4 d动态观察小鼠外周血、骨髓和脾中有核细胞计数,以流式细胞仪检测可与FITC标记的抗鼠H-2Kb单抗结合的供鼠阳性细胞并计算骨髓和脾归巢率.结果:对照组外周血中供鼠来源的细胞数持续下降,脾和骨髓的归巢率均为先升后降,提示供者来源的骨髓细胞在受鼠体内为先归巢再出巢;实验组外周血中供鼠来源的细胞数先下降,再持续上升,骨髓归巢率为下降后上升,脾归巢率为上升后下降,提示供鼠来源骨髓细胞在骨髓中表现为出巢后再归巢,脾中有延迟,与对照组比较,实验组第4天外周血中供鼠细胞数量及骨髓和脾归巢率均增高(P<0.05).结论:主要组织相容性复合物单倍体相合的骨髓移植的归巢规律是先出巢再归巢,归巢的细胞数量和归巢率高于主要组织相容性复合物完全不相合骨髓移植.     

自然杀伤细胞对异基因骨髓移植中移植排斥和造血及免疫重建的影响

背景:近几年,自然杀伤细胞与异基因骨髓移植的关系备受关注.目的:探讨自然杀伤细胞在小鼠异基因骨髓移植中对移植排斥、造血及免疫重建的影响.方法:以C57BL/6(H-2b)小鼠为供鼠、BALB/c(H-2d)小鼠为受鼠,分别在致死剂量和非致死剂量(≤7.0 Gy)全身照射的预处理条件下进行异基因骨髓移植,移植同时输注供鼠外周T细胞和(或)自然杀伤细胞.结果与结论:在致死剂量全身照射的移植中,输注自然杀伤细胞与不输注自然杀伤细胞的移植组比较,存活率显著增高;白细胞计数、CD19+细胞表达及骨髓CD34+细胞计数恢复快;H-2Kb+细胞的表达水平高.移植后28 d,输注自然杀伤细胞组CD3+细胞表达水平明显低于不输注自然杀伤细胞组,60 d两组比较差异无显著性意义(P＞0.05).在非致死剂量全身照射的移植中,移植30 d,异基因骨髓组H-2Kb+细胞表达百分率明显下降,60 d已下降至移植前水平;而输注高浓度和低浓度自然杀伤细胞的两组在移植后60 d仍能检测到80%以上的H-2Kb+细胞表达.提示,在小鼠异基因骨髓移植中,同种异基因反应性自然杀伤细胞可以抑制移植排斥,提高造血干细胞的植入水平,促进造血及免疫重建并增加移植受鼠的生存率.     

巨细胞病毒对小鼠心脏移植术后急性排斥反应的影响

目的观察巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）感染对同种异基因小鼠腹腔异位移植心脏急性排斥反应的影响。方法 BALB/c小鼠80只,C57BL/6小鼠40只,按供、受鼠基因不同分为3组（每组20对）：同质移植组（A组,BALB/c→BALB/c）、环胞素A组（B组,C57BL/6→BALB/c）和小鼠巨细胞病毒联合环胞素A组（C组,C57BL/6→BALB/c）,施行小鼠腹腔异位心脏移植术。A组无药物干预,B组术后腹腔注射CsA 20mg/kg.d,C组除腹腔注射CsA 20mg/kg.d外,术后第1d腹腔接种104PFU小鼠巨细胞病毒（MCMV）0.2ml。术后观察移植鼠心脏跳动情况、移植心脏存活时间、移植心脏的病理组织学以及MCMV病毒滴度测定。结果术后10d,A组移植心脏几乎无排斥反应;B组移植心脏搏动有力,显微镜下观察移植心脏心肌间质内有局灶性炎症细胞浸润,心肌有变性;C组移植心脏搏动微弱,体积增大,重量增加,显微镜下见心内、外膜下及心肌间质有弥漫性淋巴细胞及单核细胞浸润;心肌细胞可发生变性、坏死。C组（12.4±1.3d）移植心脏存活时间明显低于B组（16.7±1.9d）（P〈0.01）,而A组移植心脏长期存活（观察60d）。结论巨细胞病毒感染加速小鼠腹腔异位移植心脏急性排斥反应。     

异位气管移植模型中上皮细胞的增殖与凋亡

背景：异位气管移植中上皮细胞的变化过程尚不清楚,有研究表明在上皮增殖同时伴随有不可逆的细胞死亡,并且气道上皮再生与死亡发生在移植气道闭塞之前。目的：观察异位鼠气管移植过程中气道上皮细胞的增殖与凋亡情况。方法：将异体BALB/c小鼠气管植入BALB/c小鼠颈背部皮下,移植后不注射环孢素A。将BALB/c小鼠气管植入C57BL/6小鼠颈背部皮下,一组不注射环孢素A,另一组全程腹腔注射环孢素A。移植后第3,7,14,21,30天苏木精-伊红染色评价气道上皮的完整性、黏膜下炎症细胞浸润和纤维组织增生情况;测定移植气管中BrdU标记指数及TUNEL阳性细胞数。结果与结论：受体BALB/c小鼠移植后第3天气道上皮细胞轻度损伤丢失,第7～21天,气道上皮逐渐恢复正常,第30天,气道上皮接近正常上皮;BrdU标记指数变化范围为3%～5%;TUNEL阳性细胞数基本无变化。受体C57BL/6小鼠移植后第3天,气道上皮轻度损伤,第7～21天,气管上皮脱落、坏死,开始出现纤维增殖并逐渐加重,第30天时,上皮细胞完全消失,管腔被纤维组织填塞,接近闭塞;移植后第14天,BrdU标记指数达到最高,未注射环孢素A组高于注射环孢素A组（P=0.000）,移植后第21,30天,标记指数明显降低;移植后第21天,未注射环孢素A组TUNEL阳性细胞数达到最大值,注射环孢素A组于移植后第14天达最大值。说明异位气管移植上皮增殖同时伴随有不可逆的细胞凋亡,环孢素A可以减轻闭塞性细支气管炎的发病程度,但并不能阻止其发生。     

异位气管移植模型中上皮细胞的增殖与凋亡

背景:异位气管移植中上皮细胞的变化过程尚不清楚,有研究表明在上皮增殖同时伴随有不可逆的细胞死亡,并且气道上皮再生与死亡发生在移植气道闭塞之前。目的:观察异位鼠气管移植过程中气道上皮细胞的增殖与凋亡情况。方法:将异体BALB/c小鼠气管植入BALB/c小鼠颈背部皮下,移植后不注射环孢素A。将BALB/c小鼠气管植入C57BL/6小鼠颈背部皮下,一组不注射环孢素A,另一组全程腹腔注射环孢素A。移植后第3,7,14,21,30天苏木精-伊红染色评价气道上皮的完整性、黏膜下炎症细胞浸润和纤维组织增生情况;测定移植气管中BrdU标记指数及TUNEL阳性细胞数。结果与结论:受体BALB/c小鼠移植后第3天气道上皮细胞轻度损伤丢失,第7～21天,气道上皮逐渐恢复正常,第30天,气道上皮接近正常上皮;BrdU标记指数变化范围为3%～5%;TUNEL阳性细胞数基本无变化。受体C57BL/6小鼠移植后第3天,气道上皮轻度损伤,第7～21天,气管上皮脱落、坏死,开始出现纤维增殖并逐渐加重,第30天时,上皮细胞完全消失,管腔被纤维组织填塞,接近闭塞;移植后第14天,BrdU标记指数达到最高,未注射环孢素A组高于注射环孢素A组(P=0.000),移植后第21,30天,标记指数明显降低;移植后第21天,未注射环孢素A组TUNEL阳性细胞数达到最大值,注射环孢素A组于移植后第14天达最大值。说明异位气管移植上皮增殖同时伴随有不可逆的细胞凋亡,环孢素A可以减轻闭塞性细支气管炎的发病程度,但并不能阻止其发生。     

甲氧基聚乙二醇体外修饰移植物细胞对单倍体相合小鼠造血干细胞移植后GVHD的影响

本研究探讨甲氧基聚乙二醇(mPEG)化学修饰移植物细胞对小鼠单倍体相合干细胞移植后移植物抗宿主病(GVHD)的影响.取经mPEG修饰及未修饰的成年CB6小鼠脾细胞悬液注入BALB/c新生幼鼠的腹腔(5×106脾细胞/只),以脾增大指标判断新生BALB/c小鼠注射单倍体相合供鼠脾细胞后的GVHD反应;取经mPEG修饰及未修饰的成年BALB/c小鼠骨髓及脾细胞混合悬液(BMS)尾静脉注入接受致死量γ射线照射后的成年BALB/c小鼠(2×105个BMS/只),注射后第8天取受鼠脾脏,计数脾结节数.结果表明修饰组脾指数1(SI1)较未修饰组减低,修饰组脾指数2(SI2)值＜1.3,未修饰组SI2值＞1.3,提示接受mPEG修饰的单倍体相合脾细胞输注后,修饰组GVHD程度较未修饰组轻;未修饰组与修饰组相比较,脾结节形成的数量差异无显著性意义(p＞0.05),说明mPEG修饰不影响造血干祖细胞的活性.结论mPEG修饰移植物可减轻小鼠单倍体相合干细胞移植后的GVHD,而不影响干祖细胞活性.     

rhTPO对异基因造血干细胞移植模型造血重建的作用

目的：探讨重组人血小板生成素（rh TPO）对异基因造血干细胞移植模型造血重建的作用。方法：以C57BL/6小鼠为供鼠，BALB/c小鼠为受鼠，分离供鼠骨髓单个核细胞，预处理后，给予受鼠尾静脉注射供鼠骨髓单个核细胞5×106/只，建立异基因造血干细胞移植模型，移植后d 28用流式细胞术检测受鼠骨髓造血干细胞植入情况。将建模成功后的受鼠随机分为两组，实验组于移植后d 1开始注射rh TPO，对照组注射生理盐水，两组均连续注射14 d。移植后d 1、3、7、14、21观察两组受鼠外周血及骨髓造血情况。结果：移植后28 d，受鼠骨髓H-2Kb表达率为43.85%(>20%)，受鼠嵌合成功。移植后d 3、7、14、21，实验组受鼠血小板数高于对照组，比较差异具有统计学意义（P<0.05）。两组小鼠在移植后d 1、3、7均出现骨髓造血功能抑制，但实验组骨髓造血增生较对照组好。移植后d 14、21，两组小鼠骨髓造血功能均较前有所恢复，且实验组恢复明显。结论：rh TPO能有效刺激异基因造血干细胞移植后血小板生成，并促进移植后骨髓造血恢复及造血重建。     

新型免疫状态定量监测皮肤移植模型小鼠的特异性

背景：器官移植后如何监测受者的免疫状态,并预测排斥反应的发生,从而调整免疫抑制剂的用量是当前面临的重要问题。目的：探索新型免疫状态定量监测方法在小鼠皮肤移植模型中是否有抗原特异性。方法：建立C57→BALB/c皮肤移植排斥模型,分别输注C57/BALB/c混合脾细胞悬液及第三者对照DBA/BALB/c混合脾细胞,在细胞输注后检测2种混合细胞悬液比例变化及供体细胞杀伤率,同时设置BALB/c→BALB/c同系皮肤移植对照组,免疫低下裸鼠对照组及免疫抑制剂对照组与之对比。结果与结论：C57/BALB/c悬液-移植排斥模型组和C57/BALB/c悬液-移植排斥模型免疫抑制剂组小鼠对供体C57脾细胞有强烈的特异性杀伤作用,其中C57/BALB/c悬液-移植排斥模型免疫抑制剂组特异性杀伤作用稍弱,而输注第三者对照DBA/BALB/c混合脾细胞的小鼠细胞注射2～4h内没有明显特异杀伤作用,但免疫低下的裸鼠始终未表现出特异性杀伤。说明实验建立的抗原特异性免疫状态检测方法能够快速地检测出皮肤移植受体的免疫状态。