多重聚合酶链反应检测革兰阳性／阴性细菌、真菌和mecA基因的临床评价

目的：评价多重聚合酶链反应（PCR）直接检测革兰阳性／阴性细菌、真菌和耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的可靠性和准确性。方法：采用细菌16rRNA基因通用引物、革兰阴性细菌特异引物、全真菌通用引物和mecA基因特异引物，通过多重PCR对271份临床无菌性体液扩增检测革兰阳性／阴性细菌、真菌和MRS，同时对这些标本进行细菌、真菌培养和甲氧西林对葡萄球菌MIC测定。结果：多重PCR诊断无菌性体液体革兰阳性／阴性细菌、真菌和MRS感染的特异性、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值和诊断效率分别为98.5％、97.0％、97.0％、99.0％、98.2％、99.1％、95.9％、95.9％、99.1％、98.5％、99.6％、100％、83.3％、100％、99.6％、100％、48.0％、100％、61.8％、71.7％。结论：多重PCR直接检测无菌性体液中革兰阳性／阴性细菌、真菌和mecA基因所致的MRS具有敏感、快速、特异、准确的优点，是一种可靠的实验诊断手段，但不能代替培养法。     

应用PCR技术扩增细菌16S rRNA快速诊断肝硬化SBP的分析

目的：建立PCR技术扩增细菌16S rRNA的快速诊断肝硬化自发性腹膜炎的实验方法并探讨其临床应用价值。方法以细菌16S rRNA基因为靶序列,利用计算机软件Primer Express设计一对通用引物UP1和UP2,建立快速诊断肝硬化自发性腹膜炎的PCR实验方法;同时采用该方法检测60例肝硬化患者的腹水中的细菌DNA情况,并比较PCR方法与腹水培养法的灵敏度和特异度等。结果用引物UP1、UP2对12个不同菌株进行PCR扩增,均得到996bp左右长度的DNA片段,敏感性实验表明,用UP1、UP2引物进行的PCR扩增最低可检测出10pg/ml。对60例肝硬化腹水标本进行PCR扩增,阳性率为30.0%（18/60）,明显高于同期腹水细菌培养阳性率仅为6.7%（4/60）,二者比较有显著性差异（χ2=8.625,P〈0.05）。结论 PCR法优于腹水培养,其阳性率、灵敏度、特异度均较高,具有早期、快速诊断自发性细菌性腹膜炎的重要的临床应用价值。     

应用聚合酶链反应检测真菌性角膜炎

目的:探讨应用聚合酶链反应(PCR)快速检测临床疑似真菌性角膜炎(FK)的方法。方法:以源于医学机会性致病性真菌18srDNA保守区的一对寡核苷酸序列B2F(5'-ACTTTCGTAGGATAG-3')和B4R(5'-TGATCGTCTTCGATAAATA-3')为通用引物,对临床疑似FK的标本进行PCR,并与培养进行对比。结果:在687bp处出现DNA扩增带者为阳性。30份临床标本的真菌培养率为23.3%,而经扩增阳性率为50%。结论:真菌通用引物PCR反应检测真菌性角膜溃疡有较好的敏感性和特异性。     

TaqMan探针法荧光定量PCR检测脑脊液细菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法,用于脑脊液标本细菌的快速检测.方法 针对细菌的16S rRNA基因,设计合成细菌的通用引物和革兰阳性菌、革兰阴性菌分型探针,通过构建质粒和制作脑脊液模拟标本来研究引物和探针的检测特异度和敏感度.结果 两种革兰分型探针只对相应的细菌可以检测到荧光信号,乙肝病毒DNA、白色念珠菌及人基因组DNA检测结果均为阴性,此方法最低可以检测到10个拷贝的质粒DNA以及102CFU/ml的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌.结论 TaqMan探针法荧光定量PCR检测细菌的特异度和敏感度高,检测快速,对脑脊液细菌的早期诊断有重要意义.     

痰标本甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌培养与聚合酶链反应快速检测方法的比较

目的评价聚合酶链反应(PCR)快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)方法在痰标本中的应用。方法同时采集痰标本送细菌培养、真菌培养和PCR快速检测,以细菌培养方法为金标准,评价PCR方法的灵敏度和特异度。结果 PCR方法检测痰标本MRSA的灵敏度为88.9%,特异度为73.6%,阳性预测值为36.4%,阴性预测值为97.5%,均较文献报道的鼻拭子PCR的灵敏度和特异度低。结论将痰标本PCR检测MRSA用于临床动态监测MRSA的流行尚缺乏进一步的数据支持,但PCR结果不受其他细菌生长的影响,而且阴性预测值高达97.5%,在排除MRSA感染或定植方面有一定价值。     

反向斑点杂交法检测流感嗜血杆菌核酸

目的　探讨早期、快速检测流感嗜血杆菌的方法。方法　应用流感嗜血杆菌编码外膜蛋白特异的P6基因设计引物 ,通过聚合酶链反应合成特异探针 ,采用反向斑点杂交法检测生物素标记DNA ,并应用于痰标本的检测。结果　只有流感嗜血杆菌扩增出 35 1bp的DNA片段 ,该探针能检测出 10ng的细菌DNA ,与其他细菌、病毒、真菌无交叉反应。该方法和培养法分别检测 5 0份痰标本 ,两者的阳性率分别为 30 %和 2 2 %。结论　该方法快速、特异 ,对流感嗜血杆菌感染有早期诊断价值     

巢式聚合酶链式反应检测脑脊液标本中病原体的方法评价

目的探讨巢式聚合酶链式反应(PCR)检测脑脊液标本中病原体的可行性,为疾病的快速临床诊断提供参考。方法源自细菌16S rRNA基因序列设计的巢式PCR技术方法,包括2对引物,2次PCR扩增,第1对引物首次PCR扩增脑脊液标本提取的核酸DNA,第2对引物再次PCR扩增,其DNA模板为第1轮PCR扩增产物。将第2轮PCR扩增产物进行测序,对序列进行比对分析,从而确定感染的病原体。使用DNA微量分光光度测定布鲁氏菌纯菌核酸DNA,将DNA进行倍比稀释,用于巢式PCR敏感性测试。结果巢式PCR能够检测的最低限约为1个核酸DNA拷贝数。应用巢式PCR检测40份临床患者的脑脊液标本,扩增结果表明有37份标本获得约1 460 bp的预期扩增条带(不同细菌扩增片段有差异),测序比对结果显示,检出脑膜炎奈瑟菌7份、产碱假单胞菌1份、草假单胞菌22份、嗜麦芽窄食单胞菌2份、肺炎链球菌1份、未知细菌性病原体4份、未检出3份。结论巢式PCR能够快速检测与鉴定脑脊液标本中的细菌性病原体。     

拟杆菌属细菌的分子生物学鉴定

目的 用聚合酶链反应（PCR）技术鉴定拟杆菌.方法 以该属细菌的标准16S Rrna基因序列为靶基因设计通用引物,对该属标准菌株及不同来源的临床株进行PCR扩增,然后对扩增产物进行基因测序验证引物的特异性和敏感性.结果 设计的引物能扩增13株拟杆菌,而40株肠杆菌科细菌、本实验室分离和保存的其他非拟杆菌不能被扩增;13株拟杆菌所得的PCR产物经基因测序、比对相应标准菌的16S Rrna,同源性在81%～100%.结论 建立的方法可特异的鉴定拟杆菌,敏感性为100个细菌的基因组.     

BD Affirm TM VPⅢ DNA探针法在阴道炎病原体检测中的应用

目的分析BD Affirm TM VPⅢDNA探针法在阴道炎诊断中的临床应用价值。方法选取该院2019年1—9月收治的357例阴道炎患者为研究对象,同时采用BD Affirm TM VPⅢDNA探针法,细菌、真菌、滴虫培养法检测,比较4种方法的检测结果。结果与细菌、真菌、滴虫培养法的检测结果比较,BD Affirm TM VPⅢDNA探针法检测结果的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均在80%以上。BD Affirm TM VPⅢDNA探针法对加德纳菌、念珠菌、滴虫检测的灵敏度分别为95.08%、82.26%、93.10%;特异度分别为87.93%、97.00%、99.70%;阳性预测值分别为89.23%、93.58%、96.43%;阴性预测值分别为94.44%、91.13%、99.40%。结论BD Affirm TM VPⅢDNA探针法在阴道炎检测中具有较高的灵敏度及特异度,操作简便,能够在1 h内快速有效地检测出病原体,值得临床推广使用。     

应用特异性引物鉴定人申克孢子丝菌感染

目的研究人申克孢子丝菌感染的分子生物学鉴定方法,为建立检测人申克孢子丝菌感染的快速、敏感、特异方法提供参考资料。方法从疑似申克孢子丝菌感染患者的感染部位表面刮取物、腐烂组织或活检组织中提取DNA,应用合成的申克孢子丝菌特异性引物ITS3-SSP进行核糖体DNA内1332靶序列PCR扩增,将检测结果与真菌培养鉴定结果或组织病理学检查对比,观察种特异性引物PCR扩增结果的敏感性和特异性。结果在17例经形态学检查和／或真菌培养检查证实的组织标本中,有12例扩增出191bp的片段,其中7例组织中发现染成紫红色的圆形或卵圆形的孢子;而在11例经真菌培养证实为申克孢子丝菌的标本中,有4例样品巢式PCR结果为阴性。结论应用所设计的特异性引物ITS3-SSP结合巢式PCR方法鉴定申克孢子丝菌特异、敏感,是一种非常有发展潜力的检查手段。     

联合试验在真菌性角膜炎诊断中的应用

目的:探讨Gram染色法与墨汁-KOH湿片法联合试验在真菌性角膜炎诊断中的应用价值.方法:2008年1月至2009年12月期间临床诊断为真菌性角膜炎患者120例,角膜刮片标本分别行Gram染色法、墨汁-KOH湿片法和真菌培养及菌种鉴定.结果:120份真菌性角膜炎标本中113份培养出真菌,阳性率94.1%.Gram染色法与墨汁-KOH湿片法串联试验提高诊断试验的特异度、假阴性率、阳性预测值和阴性预测值,但降低了诊断试验的检出率、灵敏度、假阳性率和正确指数.Gram染色法与墨汁-KOH湿片法并联试验提高诊断试验栓出率、灵敏度、假阳性率和正确指数,但降低了诊断试验的特异度、假阴性率、阳性预测值和阴性预测值.结论:Gram染色法与墨汁-KOH湿片法联合试验是真菌性角膜炎早期诊断简单、快速、有效的方法.     

多重PCR快速鉴定19种致病真菌

摘要:目的：建立快速鉴定致病真菌的多重PCR体系。 方法：选取19种致病真菌的rDNA内部转录间隔区（ITS）序列设计引物,建立两个多重PCR体系,扩增临床与环境分离真菌菌株、人类细胞及9种常见细菌DNA,检测体系的特异性;以浓度梯度的DNA模板检测体系的灵敏度。 结果：对氟康唑天然耐药的克柔念珠菌、光滑念珠菌以及对两性霉素B耐药的土曲霉、镰刀菌、尖端赛多孢、根霉在该体系中可扩增出特异性条带,其他真菌可同时进行种属鉴定。74株被测真菌菌株的鉴定结果与常规鉴定的符合率为95.9%。两个多重PCR体系对人类基因组及9种常见细菌DNA的扩增结果均为阴性;扩增阳性的最低模板浓度均为10 fg/μL。 结论：建立的两个多重PCR体系可对致病真菌进行检测和种属鉴定。     

通用引物PCR研究进展

通用引物PCR是应用与不同序列的保守区互补的通用引物，来进行PCR扩增，它能够高通量地对相关微生物或其亚型进行检测与鉴定分型，是一种简便、快速、灵敏、特异的鉴定分型方法，目前广泛应用于病毒、细菌、支原体及真菌等微生物的检测与鉴定。     

斑点杂交法用于检测烟曲霉菌感染的实验研究

目的:建立一种利用DNA探针快速检测烟曲霉菌的斑点杂交方法。方法:在烟曲霉特异的碱性蛋白酶基因序列内设计引物,聚合酶链反应合成一段465bp的DNA探针,用地高辛标记探针并与烟曲霉、黄曲霉、念珠菌、隐球菌等真菌以及细菌DNA行斑点杂交,并将该方法应用于临床标本的检测。结果:所合成的探针具有高度特异性,与其他真菌、细菌间无交叉反应,该方法的敏感性达100fg。100份临床标本曲霉培养阳性者6份,杂交阳性者13份。结论:斑点杂交法具有快速、敏感、特异的优点,对烟曲霉菌感染的快速诊断有重要意义。     

聚合酶链反应检测真菌感染的临床评价

用聚合酶链反应 (PCR)检测真菌 ,已有较多报道[1 2 ] ,我们也曾报道过初步研究[3 ] 。为给临床提供快速、灵敏、非创伤的真菌感染诊断方法 ,本文就采用真菌通用引物PCR检测真菌DNA的灵敏度、特异性、可检测真菌范围及临床适用性作进一步评价。1　材料和方法1 1　引物　真菌 18S亚基rRNA多拷贝基因的保守序列通用引物序列为 5′ ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG 3′和 5′ CCGATCCCTAGTCGGCATAG 3′ ,扩增产物大小因真菌病原体而异 ,为 4 82～ 5 0 3bp[4] ,白色念珠菌为 4 90bp。由北京赛百盛生物工程公司合成。1 2　临床无菌性…     

小片段PCR产物对布鲁菌种属鉴定的研究

目的 应用小片段PCR产物对布鲁菌进行快速种属鉴定.方法 收集2008年1月至2009年6月在吉林省松原地区从92例布鲁菌病患者血液中分离出的布鲁菌13株,其中羊布鲁菌9株,牛布鲁菌2株,猪布鲁菌2株.根据布鲁菌属细菌重复插入序列IS711及羊布鲁菌、牛布鲁菌及猪布鲁菌种间特异性基因片段设计引物,对3株布鲁菌标准菌株及13株临床分离布鲁菌分别进行PCR反应,获得相应PCR产物.将PCR产物T-A克隆并进行测序分析.对布鲁菌标准菌株DNA模板进行稀释,对每一稀释度的DNA模板分别进行10次PCR扩增,进行灵敏度和稳定性检测.结果 4种PCR反应均可获得特异的小片段PCR产物,片段长度分别为63、67、81和83 bp,T-A克隆测序结果 与目的 基因片段比较,符合率为100%,检测模板的最低DNA浓度为1 μg/L,分别用不同的引物对相应布鲁菌DNA模板进行10次PCR扩增,均得到预期结果 .结论 本研究建立的PCR反应能鉴定布鲁菌种属,具有良好的特异性、灵敏度和稳定性.     

用多聚酶链反应(PCR)快速诊断白色念珠菌感染

由白色念球菌引起的院内感染日益增多。应用多聚酶链反应(PCR)体外扩增白色念珠菌DNA.为临床敏感、特异、快速诊断白色念珠菌感染提供了有用的工具。本文就PCR检测白色念珠菌DNA的引物,标本处理,扩增程序,扩增产物分析以及临床应用效果予以介绍。     

PCR法快速诊断急性重症胰腺炎早期合并细菌感染

目的：探讨针对细菌16s rRNA基因的通用引物为基础的细菌聚合酶链反应（PCR）法诊断急性重症胰腺炎（SAP）早期合并细菌感染的价值。方法：采用细菌通用引物PCR法检测SAP患者的胰周渗液,并与常规细菌培养结果进行比较。结果：收集17例SAP胰周渗液标本45份,其中17份来自细针穿刺（FNA）,28份为术中标本。常规培养结果阳性38份,共10例;细菌PCR法检测阳性36份,共9例。10例最终诊断为胰腺感染,并行手术治疗。与最终结果比较,PCR、培养诊断胰腺感染的敏感性分别为90%（9/10）、100%（10/10）,特异性均为100%（7/7）。两者耗时分别为5 h3、d。结论：PCR法能快速、准确地诊断SAP早期合并细菌感染,为手术治疗提供可靠依据。     

细菌革兰双检荧光定量PCR方法检测新生儿败血症

目的 建立细菌革兰阴、阳性菌双重实时荧光定量检测体系,探讨其检测败血症的临床应用价值.方法 分析细菌16SrRNA基因序列,在高度保守区自行设计通用引物和革兰阴性和阳性分型探针,选取临床较常见的35株菌株进行细菌革兰双检实时荧光定量PCR方法检测;对临床疑为败血症的512例新生患儿分别做细菌革兰双检荧光定量PCR和血培养检测.结果 细菌革兰双检荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性,能稳定检测到10 CFU左右细菌数.35株菌株进行细菌革兰双检荧光定量PCR检测,均为阳性,且革兰阴、阳性菌能正确分型和定量.巨细胞病毒、EB病毒、乙肝病毒、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA及空白对照均为阴性.对临床疑为败血症的512份新生患儿标本中,革兰双检荧光定量PCR检测血标本阳性率8.20%(42/512),血培养阳性率6.25%(32/512),前者明显高于后者,差异具有统计学意义(χ<'2>=8.10,P<0.01),30例非感染性疾病同期患儿血标本革兰双检荧光定量PER及细菌培养均为阴性.若以血培养作为对照,细菌革兰双检荧光定量PCR方法的诊断敏感度为100%,特异度为97.92%,准确性98.05%.结论 建立了用通用引物和分型双荧光探针的细菌革兰双检荧光定量PER方法.其检测快速、准确,具有很大的临床推广价值.     

定量PCR方法用于恶性血液病患者侵袭性真菌感染的诊断研究

本研究建立恶性血液病合并侵袭性真菌感染患者的外周血真菌定量PCR检测方法并初步评价其诊断价值。选取真菌高度保守的区段序列18Sr DNA-ITS1区设计引物及探针,提取真菌菌株DNA进行定量PCR验证引物及探针的敏感性和特异性,利用pGEM-T质粒制备真菌DNA标准品并对患者血液中真菌DNA进行定量测定。结果表明:12株曲霉菌和14株念珠菌定量PCR结果均为阳性;真菌在血浆、单个核细胞和全血中分布差异无统计学意义(p0.05)。真菌定量PCR的ROC曲线分析显示,用于临床诊断侵袭性真菌感染的诊断界值为8copies/ml全血,其敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、Kappa值分别为0.84,0.9,0.955,0.692,0.679。结论:真菌定量PCR检测可作为恶性血液病患者侵袭性真菌感染的早期诊断手段。