体外诱导脂肪源性干细胞向类肝细胞的定向分化

背景:用脂肪源性干细胞治疗肝脏疾病之前,如何建立有效稳定的肝细胞分化诱导方案,纯化并快速扩增性能稳定的类肝细胞等问题亟待解决。目的:建立大鼠脂肪源性干细胞转化为类肝细胞的程序化诱导体系。方法:分离纯化Lewis大鼠脂肪源性干细胞,流式细胞仪鉴定其表面标志,分3个阶段加入含有肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4、酸性成纤维细胞生长因子、制瘤素M细胞因子的诱导培养体系,使脂肪源性干细胞向肝细胞转化。结果与结论:大鼠脂肪源性干细胞诱导7,14,21d后,细胞阳性表达ALB、AFP、CK18mRNA,表达量随诱导时间延长而增强,类肝细胞具有白蛋白合成功能。氨代谢和尿素的合成功能在9～12d出现并持续存在。结果表明脂肪源性干细胞体外分段诱导可成功转化为类肝细胞。     

体外诱导脂肪源性干细胞向类肝细胞的定向分化

背景：用脂肪源性干细胞治疗肝脏疾病之前,如何建立有效稳定的肝细胞分化诱导方案,纯化并快速扩增性能稳定的类肝细胞等问题亟待解决。目的：建立大鼠脂肪源性干细胞转化为类肝细胞的程序化诱导体系。方法：分离纯化Lewis大鼠脂肪源性干细胞,流式细胞仪鉴定其表面标志,分3个阶段加入含有肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4、酸性成纤维细胞生长因子、制瘤素M细胞因子的诱导培养体系,使脂肪源性干细胞向肝细胞转化。结果与结论：大鼠脂肪源性干细胞诱导7,14,21d后,细胞阳性表达ALB、AFP、CK18mRNA,表达量随诱导时间延长而增强,类肝细胞具有白蛋白合成功能。氨代谢和尿素的合成功能在9～12d出现并持续存在。结果表明脂肪源性干细胞体外分段诱导可成功转化为类肝细胞。     

骨髓间充质干细胞在诱导液条件下向软骨细胞的定向诱导分化

背景:骨髓间充质干细胞易于从骨髓中分离,来源取材方便,对供体损伤小,具有强大的增殖能力及多向分化潜能,便于自体移植,如能成功诱导为软骨细胞将是软骨组织工程理想的种子细胞.目的:观察体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化,并对分化后细胞进行鉴定.设计、时间及地点:细胞形态学、蛋白质组学的比较观察于2005-05-03/2007-12-30在沈阳医学院临床中心实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于二三个月龄新西兰健康大白兔,体质量2～2.5 kg.方法:采用全骨髓法分离培养兔骨髓间充质干细胞.取生长良好的细胞第4代细胞消化传代,以1×105密度接种于24孔板中将生长状态良好的细胞在含有地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C及转化生长因子β的培养液中诱导分化. 主要观察指标:采用免疫组化的方法进行细胞鉴定,RT-PCR法检测诱导分化细胞 Ⅱ型胶原的表达.结果:骨髓间充质干细胞经成骨诱导后,由长梭形变为椭圆形及肾形.免疫组织化学方法显示所培养间充质干细胞不表达CD34、CD45,但CD105显阳性.骨髓间充质干细胞在未经诱导时不表达Ⅱ型胶原蛋白,经诱导后在500～750 bp之间可见明显条带.结论:骨髓间充质干细胞经含地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子维生素C及转化生长因子β等培养液诱导后,可以在体外向软骨细胞转化,高表达Ⅱ型胶原,并经细胞形态学及蛋白质组学RNA水平鉴定验证.     

大鼠附睾脂肪垫脂肪源性干细胞的分离培养及分化潜能

背景:相对于骨髓基质干细胞,脂肪源性下细胞来源丰富,取材方便,干细胞丰度高,极易培养,具有多向分化潜能,有望成为组织工程、细胞治疗以及基因转染良好的源细胞,但目前对脂肪源性干细胞的研究尚处于初级阶段.目的:拟在体外分离培养大鼠脂肪源性干细胞,并探讨其分化潜能.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/2009-01在南方医科大学组胚教研室和南方医院临床医学实验中心完成.材料:SPF级成年雄性SD大鼠1只,由南方医科大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下切取大鼠双侧附睾尾脂肪垫,胶原酶消化法分离培养脂肪源性干细胞,胰蛋白酶消化法传代扩增.取第4代脂肪源性干细胞接种到96孔板,5×104个细胞/皿,待细胞贴壁后分成3组:成骨诱导组加入成骨培养基,成脂诱导组加入成脂培养基,对照组仍用基础培养基,培养14 d.主要观察指标:脂肪源性干细胞的形态变化、体外增殖能力、细胞免疫化学鉴定结果.脂肪源性干细胞成骨和成脂分化能力.结果:体外培养的脂肪源性干细胞易扩增,传代后以长梭形细胞为主,呈旋涡状排列,克隆样生长;经多次传代仍能保持较强的增殖能力,细胞生长曲线争"S"形;细胞表面标志CD44和CD49d呈阳性表达,CDl06呈阴性表达.脂肪源性干细胞经成骨诱导7 d后,碱性磷酸酶染色呈阳性;成脂诱导3 d后,油红O染色示胞浆内有脂滴出现;对照组细胞碱性磷酸酶染色呈阴性,无脂滴存在.结论:从大鼠附睾脂肪垫内分离的脂肪源性干细胞易于培养和传代扩增,在特殊条件下可分化为成骨细胞和脂肪细胞.     

体外培养大鼠脂肪干细胞诱导分化为神经细胞

背景:脂肪间充质干细胞是一组具有多向分化潜能的干细胞,在不同诱导条件下可以向软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞分化,在一定条件下也可分化为神经干细胞。目的:研究大鼠脂肪间充质干细胞的体外培养及细胞表型,探讨其向神经细胞方向分化的能力。方法:取 SD 大鼠的腹股沟、附睾垫和腹膜后脂肪,分离培养脂肪间充质干细胞,形态观察并进行传代。流式细胞仪检测第三四代细胞表型 CD29、CD44、CD45。利用碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子模拟神经细胞生长环境,使脂肪间充质干细胞向神经细胞方向分化,免疫荧光法检测诱导分化后神经细胞 nestin、NF-200、GFAP 的表达情况。结果与结论:从大鼠的脂肪组织中成功提取脂肪间充质干细胞,并能连续传代,稳定增殖,高表达 CD29(99.00±0.12)%,CD44(95.62±0.68)%,低表达 CD45(0.13±0.12)%。经无血清的神经因子诱导后,脂肪间充质干细胞可表达 nestin,加入血清后可表达 NF-200、GFAP。提示脂肪间充质干细胞具有强大的体外扩增能力,体外建立神经诱导环境后可定向分化为神经细胞的生物学特性,可为神经系统损伤、退行性疾病提供种子细胞。     

微球培养人脂肪间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化

目的:观察微球培养的人脂肪间充质干细胞在特定诱导条件下向软骨细胞的分化情况,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法:实验于2006-03/08在湘雅医院中心实验室完成。①实验材料:皮下脂肪组织来源于股骨颈骨折手术患者6例,对本实验均知情同意。②实验方法:取皮下脂肪,分离培养脂肪间充质干细胞,胰酶消化,取传至第6代的细胞,密度调整为1×1010L-1进行接种培养,细胞贴附后加入软骨细胞诱导剂(含10μg/L转化生长因子β1、37.5mg/L维生素C、6.25mg/L胰岛素、6.25mg/L转铁蛋白、10-7mol/L地塞米松、1%新生牛血清的高糖DMEM),倒置显微镜下观察细胞团的变化。③实验评估:诱导14d后,将细胞吹散,细胞爬片,免疫组化染色检测Ⅱ型胶原的表达,甲苯胺兰染色观察细胞内异染情况,RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白和软骨蛋白聚糖aggrecan mRNA的表达。结果:①脂肪间充质干细胞向软骨细胞诱导后的形态:诱导3d后,细胞团向内呈放射状聚集。②诱导后Ⅱ型胶原的表达及细胞内异染情况:诱导14d后,Ⅱ型胶原在胞浆、胞膜及细胞外基质中均有表达,呈棕黄色;甲苯胺兰染色显示胞浆内呈蓝色异染。③诱导前后Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan mRNA的表达:诱导前脂肪间充质干细胞无Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan mRNA表达,而诱导14d后二者均有较高表达。结论:在微球状态下可成功诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化。     

小鼠脂肪来源干细胞向成骨及软骨细胞的诱导分化

背景：脂肪干细胞常从脂肪组织中分离获取,脂肪组织在全身均有分布,极易大量获得,取材时对供区损伤小。目的：进一步验证小鼠脂肪来源干细胞的体外分离、培养方法,并在特定条件下诱导其向成骨细胞和软骨细胞分化,探讨其作为组织工程种子细胞的可行性。方法：取昆明种雄性小鼠附睾处脂肪,I型胶原酶消化法和差速贴壁法获取、纯化脂肪干细胞并进行细胞表型鉴定。采用成骨诱导培养基诱导脂肪干细胞,进行钙钴法碱性磷酸酶染色和茜素红钙结节染色检测细胞分化情况;采用软骨诱导培养基诱导脂肪干细胞,进行甲苯胺蓝染色,番红O染色,Ⅱ型胶原免疫组织化学检测细胞分化情况。结果与结论：脂肪干细胞呈梭形贴壁生长,原代7-9d可达90％融合,传至第3代后细胞形态趋向一致,传代的脂肪干细胞生长曲线呈“S”形。细胞特异性抗原测定CD29、CD44表达阳性,而CD34、CD45呈阴性表达。成骨诱导分化后细胞碱性磷酸酶染色和茜素红染色呈阳性。软骨诱导分化后细胞番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色呈阳性。证实从脂肪组织中可分离到具有分化潜能的干细胞,可在体外稳定增殖传代,经诱导后可分化为成骨细胞、软骨细胞,其具有来源广泛,取材方便等优点,可成为组织工程理想的种子细胞。     

体外培养大鼠脂肪干细胞诱导分化为神经细胞

背景：脂肪间充质干细胞是一组具有多向分化潜能的干细胞,在不同诱导条件下可以向软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞分化,在一定条件下也可分化为神经干细胞。目的：研究大鼠脂肪间充质干细胞的体外培养及细胞表型,探讨其向神经细胞方向分化的能力。方法：取 SD 大鼠的腹股沟、附睾垫和腹膜后脂肪,分离培养脂肪间充质干细胞,形态观察并进行传代。流式细胞仪检测第三四代细胞表型 CD29、CD44、CD45。利用碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子模拟神经细胞生长环境,使脂肪间充质干细胞向神经细胞方向分化,免疫荧光法检测诱导分化后神经细胞 nestin、NF-200、GFAP 的表达情况。结果与结论：从大鼠的脂肪组织中成功提取脂肪间充质干细胞,并能连续传代,稳定增殖,高表达 CD29（99.00±0.12）%,CD44（95.62±0.68）%,低表达 CD45（0.13±0.12）%。经无血清的神经因子诱导后,脂肪间充质干细胞可表达 nestin,加入血清后可表达 NF-200、GFAP。提示脂肪间充质干细胞具有强大的体外扩增能力,体外建立神经诱导环境后可定向分化为神经细胞的生物学特性,可为神经系统损伤、退行性疾病提供种子细胞。     

兔脂肪干细胞在含有转化因子和转铁蛋白培养基中向软骨细胞的分化

背景：成软骨的种子细胞的选择是软骨组织工程研究中的关键因素。目的：观察脂肪干细胞在含有转化因子和转铁蛋白诱导条件下向软骨细胞分化的能力。方法：取新西兰大白兔颈背部脂肪组织,机械分离及酶消化法获得脂肪干细胞,显微镜下观察细胞黏附及生长情况;加入含有转化因子β1和转铁蛋白的诱导培养基培养2周后以免疫组化方法检测Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：从兔脂肪组织中分离出的干细胞原代培养时24h贴壁,96h后达80%融合;于软骨诱导培养基内向软骨诱导7d后形成软骨结节,14d后Ⅱ型胶原免疫组化阳性。结果初步表明兔脂肪干细胞经诱导后可以向软骨细胞分化。     

兔脂肪干细胞在含有转化因子和转铁蛋白培养基中向软骨细胞的分化

背景:成软骨的种子细胞的选择是软骨组织工程研究中的关键因素.目的:观察脂肪干细胞在含有转化因子和转铁蛋白诱导条件下向软骨细胞分化的能力.方法:取新西兰大白兔颈背部脂肪组织,机械分离及酶消化法获得脂肪干细胞,显微镜下观察细胞黏附及生长情况;加入含有转化因子β1和转铁蛋白的诱导培养基培养2周后以免疫组化方法检测Ⅱ型胶原的表达.结果与结论:从兔脂肪组织中分离出的干细胞原代培养时24 h贴壁,96 h后达80%融合;于软骨诱导培养基内向软骨诱导7 d后形成软骨结节,14 d后Ⅱ型胶原免疫组化阳性.结果初步表明兔脂肪干细胞经诱导后可以向软骨细胞分化.     

转化生长因子β2诱导鼠脂肪间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞成骨和成软骨的促分化作用已被广泛证实.目的:假设转化生长因子β2可在体外诱导鼠脂肪间充质干细胞向成软骨细胞分化,实验拟验证其可行性.设计、时间及地点:体外细胞学实验,于2007-03/11在北京大学第三医院中心实验室完成.材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,用于分离培养脂肪间允质干细胞.方法:取第2代脂肪间充质于细胞,通过10μg/L外源性转化生长因子β2以离心管内微团培养、单层培养两种方式向软骨细胞进行诱导分化,培养3周.对照组单纯加入基础培养液.主要观察指标:两种湾导方式下细胞(团)形态结构的变化、Ⅱ型胶原免疫组织化学检测结果、软骨细胞特异性基因Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA的表达.结果:微团培养诱导的脂肪间充质干细胞组织块经苏木精.伊红染色显示在组织内部形成类似软骨陷窝样结构,阿尔新蓝染色呈强阳性,Ⅱ型胶原免疫组化结果显示有棕褐色强阳性颗粒,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA的表达.单层培养诱导的脂肪间充质干细胞无细胞外软骨基质分泌,未发现Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan mRNA的表达.结论:在离心管内微团培养方式下,转化生长因子β2可以启动或促进脂肪间充质干细胞的软骨分化,且分泌软骨细胞特异性基质.简单的单层培养方式诱导失败.     

SD大鼠脂肪源间充质干细胞分离培养特性及影响因素

背景：脂肪源间充质干细胞因为容易大量获得、抽取后残留于供区的脂肪组织仍可扩增、供区的损伤小等优点,成为干细胞生物工程研究的理想种子细胞来源。但是,脂肪源间充质干细胞分离培养有较大困难。目的：探索脂肪源间充质干细胞的分离培养方法及其生长特性。方法：分别取4周龄和10月龄不同性别的SD大鼠腹股沟、肩部和腹腔脂肪组织,经细胞培养液洗涤、离心后接种于细胞培养瓶,放置体积分数5%CO2孵箱中培养,分别于24,48,72h后换液。待细胞密度达到约80%时,用0.25%胰酶-EDTA消化,传代培养。分析SD大鼠的年龄、性别、采集脂肪组织的部位、胶原酶Ⅰ的浓度和消化时间,以及原代细胞的首次换液时间等对脂肪源间充质干细胞培养的影响。结果与结论：原代脂肪源间充质干细胞呈梭形或多角形。随着传代和培养时间的延长,脂肪源间充质干细胞由多边形、成巢分布,逐渐连接成片,伸展为梭形或多角形。培养48h后,含脂滴的细胞数量逐渐增多,但仍有90%的脂肪源间充质干细胞始终不表现向脂肪细胞自发分化的趋势。4周龄雌性SD大鼠腹腔脂肪组织在一定条件下传代培养最佳。提示,从SD大鼠腹腔脂肪组织中分离的脂肪源间充质干细胞可在体外稳定传代,SD大鼠的年龄、性别、采集脂肪组织的部位、胶原酶Ⅰ的浓度和消化时间,以及原代细胞的首次换液时间等均影响脂肪源间充质干细胞的分离培养效果。     

SD大鼠脂肪源间充质干细胞分离培养特性及影响因素

背景:脂肪源间充质干细胞因为容易大量获得、抽取后残留于供区的脂肪组织仍可扩增、供区的损伤小等优点,成为干细胞生物工程研究的理想种子细胞来源。但是,脂肪源间充质干细胞分离培养有较大困难。目的:探索脂肪源间充质干细胞的分离培养方法及其生长特性。方法:分别取4周龄和10月龄不同性别的SD大鼠腹股沟、肩部和腹腔脂肪组织,经细胞培养液洗涤、离心后接种于细胞培养瓶,放置体积分数5%CO2孵箱中培养,分别于24,48,72h后换液。待细胞密度达到约80%时,用0.25%胰酶-EDTA消化,传代培养。分析SD大鼠的年龄、性别、采集脂肪组织的部位、胶原酶Ⅰ的浓度和消化时间,以及原代细胞的首次换液时间等对脂肪源间充质干细胞培养的影响。结果与结论:原代脂肪源间充质干细胞呈梭形或多角形。随着传代和培养时间的延长,脂肪源间充质干细胞由多边形、成巢分布,逐渐连接成片,伸展为梭形或多角形。培养48h后,含脂滴的细胞数量逐渐增多,但仍有90%的脂肪源间充质干细胞始终不表现向脂肪细胞自发分化的趋势。4周龄雌性SD大鼠腹腔脂肪组织在一定条件下传代培养最佳。提示,从SD大鼠腹腔脂肪组织中分离的脂肪源间充质干细胞可在体外稳定传代,SD大鼠的年龄、性...     

脂肪干细胞与软骨细胞的共培养

背景：有研究发现关节软骨微环境可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。目的：验证软骨细胞能否诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化,以便成为组织工程构建关节软骨可能的新方法。设计、时间及地点：随机对照细胞实验,于2007-09／2008—07在南京大学生物医药生物技术国家重点实验室完成。材料：清洁级成年新西兰大白兔,雌雄不限,体质量1．5—2．0kg。方法：分离培养原代新西兰大白兔脂肪干细胞和软骨细胞,分别种植于6孔板和插入式细胞培养皿共培养2周后,胰酶消化终止。脂肪干细胞分别行油红O染色、碱性磷酸酶检测和甲苯胺蓝染色法鉴定。主要观察指标：倒置显微镜观察共培养前后脂肪干细胞的形态变化。甲苯胺蓝染色法检测共培养后脂肪干细胞的蛋白多糖的表达水平。免疫细胞化学检测共培养后脂肪干细胞的Ⅱ型胶原的表达水平。反转录-聚合酶链反应检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录水平。结果：脂肪干细胞分别经油红。染色、碱性磷酸酶染色和甲苯胺蓝染色法鉴定证实,分离的细胞具有多向分化能力,是脂肪来源的间充质干细胞。共培养1周后部分脂肪干细胞变圆,2周时其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录和蛋白表达均增高。结论：与软骨细胞共培养后,脂肪干细胞可以被诱导成软骨样细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

体外定向诱导鹿茸间充质干细胞向软骨细胞的分化

目的:间充质干细胞的诱导分化的研究多见于骨髓、脐血等组织,而在鹿茸组织中分离的间充质干细胞是否能诱导为软骨细胞目前尚不清楚.实验拟建立梅花鹿鹿茸生长中心间充质干细胞体外培养方法,观察转化生长因子β1体外诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞的可行性.方法:实验于2006-03/2007-06在吉林大学畜牧兽医学院基础兽医研究室完成.①实验材料:4岁龄健康雄性梅花鹿由中国农科院左家特产研究所提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:于生长早期锯取梅花鹿鹿茸,在解剖显微镜下定位和切取间质层(突起部),即为鹿茸间充质干细胞所在的组织层.Ⅰ型胶原酶消化法原代分离培养鹿茸生长中心间充质干细胞,锥虫蓝染色显示细胞活性达90%以上,将活性确定后的细胞液氮冻存.取第3代细胞,用含10%胎牛血清以及10 μg/L转化生长因子β1的条件培养基诱导培养.③实验评估:培养12 d 后于倒置显微镜下观察细胞形态,采用细胞化学及免疫细胞化学鉴定细胞.结果:①鹿茸生长中心间充质干细胞的分离与培养:Ⅰ型胶原酶消化法培养可以获得均一的间充质干细胞,贴壁的间充质干细胞形态均匀,呈长梭形,克隆样生长,增殖迅速.②转化生长因子β1体外定向诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞:转化生长因子β1诱导分化的鹿茸间充质细胞生长迅速,诱导后细胞形态明显改变,呈典型的软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原表达阳性.结论:采用酶消化法可以从鹿茸生长中心间充质层中分离出间充质干细胞,在体外转化生长因子β1具有促进鹿茸生长中心间充质干细胞分化为软骨细胞的能力.     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景:骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能.目的:体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件.方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3 代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1 的软骨分化诱导剂,2 周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达.结果与结论:可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖.经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性.10 μg/L 的转化生长因子β1 诱导成软骨分化能力最强.     

体外定向诱导鹿茸间充质干细胞向软骨细胞的分化

目的：间充质干细胞的诱导分化的研究多见于骨髓、脐血等组织，而在鹿茸组织中分离的间充质干细胞是否能诱导为软骨细胞目前尚不清楚。实验拟建立梅花鹿鹿茸生长中心间充质干细胞体外培养方法，观察转化生长因子β1体外诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞的可行性。 方法：实验于2006—03／2007—06在吉林大学畜牧兽医学院基础兽医研究室完成。①实验材料：4岁龄健康雄性梅花鹿由中国农科院左家特产研究所提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：于生长早期锯取梅花鹿鹿茸，在解剖显微镜下定位和切取间质层（突起部），即为鹿茸间充质干细胞所在的组织层。Ⅰ型胶原酶消化法原代分离培养鹿茸生长中心间充质干细胞，锥虫蓝染色显示细胞活性达90％以上，将活性确定后的细胞液氮冻存。取第3代细胞，用含10％胎牛血清以及10μg／L转化生长因子β1的条件培养基诱导培养。③实验评估：培养12d后于倒置显微镜下观察细胞形态，采用细胞化学及免疫细胞化学鉴定细胞。 结果：①鹿茸生长中心间充质干细胞的分离与培养：Ⅰ型胶原酶消化法培养可以获得均一的间充质干细胞，贴壁的间充质干细胞形态均匀，呈长梭形，克隆样生长，增殖迅速。②转化生长因子β1体外定向诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞：转化生长因子β1诱导分化的鹿茸间充质细胞生长迅速，诱导后细胞形态明显改变，呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性。 结论：采用酶消化法可以从鹿茸生长中心间充质层中分离出间充质干细胞，在体外转化生长因子β1具有促进鹿茸生长中心间充质干细胞分化为软骨细胞的能力。     

大鼠骨髓间充质干细胞分化成脂肪细胞的定向诱导

背景:研究表明骨质疏松症可能是间充质干细胞分化失衡后过多地向脂肪细胞分化所致.因此,探讨骨髓间充质干细胞成脂分化的影响因素对骨质疏松症防治具有重要意义.目的:分析骨髓间充质干细胞在体外定向分化为脂肪细胞的适宜诱导条件.设计、时间及地点:以细胞为对象,重复观察测量实验,于2007-10/2008-07在广东医学院药理教研室完成.材料:1月龄SD雄性大鼠由广东医学院实验动物中心提供.方法:无菌条什下分离大鼠股骨,密度梯度离心法与贴肇培养法相结合分离、纯化骨髓间充质干细胞并存体外进行培养.第3代骨髓间充质干细胞完全汇合后,利用内含0.1 mmoL/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.1 mmoL/L吲哚美辛、1μmol/L地塞米松、不同浓度胰岛素及胎牛血清的DMEM定向诱导骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞.主要观察指标:①倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征.②油红○染色检测骨髓间充质干细胞成脂肪分化情况.结果:①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞.②体积分数为0.05和0.1胎牛血清均能获得较好的成脂分化效果,胎牛血清体积分数增至0.2反而抑制骨髓间充质干细胞成脂分化(P<0.01).③10mg/L胰岛素可获得较好的成脂分化效果,胰岛素质黾浓度提高到20,40 mg/L并不能增加骨髓间充质干细胞的成脂分化效果(P>0.05).④低糖(含葡萄糖1 g/L)和高糖(含葡萄糖4.5 g/L)DMEM对骨髓间充质干细胞的成脂分化无影响(P>0.05).结论:骨髓间充质干细胞经内含0.1 mmoL/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10mg/L胰岛素、0.1 mmoL/L吲哚美辛,1 μmoL/L地塞米松、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM分化诱导液定向诱导可获得较好的成脂分化效果.     

CM-DiI标记大鼠脂肪干细胞的效力

背景:CM-DiI是DiI的衍生物,因具有一定的水溶性,且含有氯甲基化活性巯基部分,使其更易嵌入、弥散并稳固地结合到整个细胞膜上,使染色更快捷、均匀、持久。目的:进一步验证荧光染料CM-DiI标记大鼠脂肪干细胞的可行性。方法:切取大鼠腹股沟区皮下脂肪组织,采用胶原酶消化法体外分离培养脂肪干细胞,取第3代细胞分为实验组和对照组,用质量浓度4mg/L的CM-DiI对实验组细胞进行标记,于6,12,24,48h观察CM-DiI标记脂肪干细胞体内示踪效果。结果与结论:荧光显微镜下CM-DiI标记细胞的胞浆、胞膜均显红色荧光,标记的脂肪干细胞呈梭形,保持了良好的正常形态,CM-DiI标记阳性率为100%,标记早期细胞形态呈荧光环状,48h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光。与对照组比较,CM-DiI标记的细胞增殖后形态、上清液乳酸脱氢酶含量及MTT值均无明显变化(P>0.05)。细胞移植后4h后,在心、肺组织可见到发出红色荧光的标记细胞。提示CM-DiI能有效标记体外培养的脂肪干细胞,并在细胞内稳定表达,且标记细胞形态良好,对活体细胞无毒性。体内移植后,有良好的示踪效果。