大鼠脑损伤对移植人胚神经干细胞存活和分化的影响

目的 探讨大鼠脑液压冲击伤(FPI)后对植入的人胚神经干细胞(HNSCs)存活和分化的影响。方法 取8周龄人胎儿大脑皮层细胞，体外培养获得神经干细胞(NSCs)，巢蛋白免疫荧光染色；SD大鼠制作FPI模型．于伤后24h在损伤区移植标有5-溴脱氧脲嘧啶(BrdU)的HNSCs，1周和4周后处死大鼠，邻片行BrdU／微管相关蛋白-2(MAP-2)和BrdU胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学双染。结果 HNSCs移植后1周可见BrdU阳性细胞向周围迁移，且BrdU／MAP-2双阳性细胞多于BrdU GFAP双阳性细胞；移植后4周BrdU阳性细胞迁移的范围更广，但细胞数量明显减少，脉络丛和微血管中可见BrdU阳性细胞．BrdU／GFAP双阳性细胞多于BrdU／MAP-2双阳性细胞。结论 HNSCs能存活于损伤区域，移植后逐渐分化为星形胶质细胞．且易被内皮吞噬细胞吞噬。     

银杏内酯B与低氧预适应对氧-葡萄糖剥夺星形胶质细胞的保护途径

目的：观察银杏内酯B与低氧预适应对氧葡-萄糖剥夺模型中星形胶质细胞的影响，分析该影响作用途径。方法：实验于2004-10／2005-10在南通大学航海医学研究所完成。①选用新生1d的ICR小鼠15只，雌雄不拘。②传3代后的星形胶质细胞，将培养基换成无糖DMEM培养，加入银杏内酯B，置入体积分数0．95空气＋体积分数0．05CO2培养箱24h后，进行氧-葡萄糖剥夺实验，培养基换成无糖Hank溶液，置37℃体积分数0．0102＋体积分数0．94N2＋体积分数0．05CO2培养箱进行缺氧24h后，换成含150g／L新生牛血清的DMEM／F12完全培养液在体积分数0，95空气＋体积分数0．05CO2培养箱复氧24h。③低氧预适应0，5或3h，用原完全培养基培养24h后进行氧-葡萄糖剥夺实验。④利用相差显微镜观察细胞形态变化；四甲基偶氮唑盐比色法测定线粒体脱氢酶活性。免疫印迹分析促红细胞生成素表达的变化。⑤计量资料差异比较采用单因素方差分析，组间差异比较采用Q检验（Newman-Keuls法）。结果：①氧-葡萄糖剥夺实验对星形胶质细胞活性的影响：氧-葡萄糖剥夺0．5或3h后星形胶质细胞活性增强；氧-葡萄糖剥夺24h后，细胞活性明显下降（P〈0．01）。②银杏内酯B对氧-葡萄糖剥夺24h后星形胶质细胞活性的影响：预先给予120μmol／L银杏内酯B作用24h，再进行氧-葡萄糖剥夺24h，细胞形态基本正常；在一定浓度范围内银杏内酯B对缺氧损伤有明显的保护作用，以120μmol／L银杏内酯B预处理后细胞活性明显高于氧-葡萄糖剥夺24h后（P〈0．01）。⑧银杏内酯B（120μmol／L）对氧-葡萄糖剥夺24h后星形胶质细胞表达促红细胞生成素的影响：经氧-葡萄糖剥夺0．5或3h或单纯用银杏内酯B处理后的比值明显高于未进行氧-葡萄糖剥夺者（P〈0．01）；银杏内酯B预处理后再进行氧-葡萄糖剥夺24h表达明显高于氧-葡萄糖剥夺24h后（P〈0．05）。④低氧预适应对氧-葡萄糖剥夺24h后星形胶质细胞活性的影响：低氧预适应0．5和3h后再进行氧-葡萄糖剥夺24h，细胞形态基本正常；低氧预适应0．5和3h对氧-葡萄糖剥夺24h后星形胶质细胞有保护作用（P〈0．01，0．05）。结论：银杏内酯B与低氧预适应对氧-葡萄糖剥夺星形胶质细胞有保护作用，其作用发生可能与促进促红细胞生成素表达有关。     

大鼠神经干细胞体外培养条件下GDNF及NGF的分泌特点

目的：探讨体外培养条件下大鼠神经干细胞（NSCs）分泌胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和神经生长因子（NGF）的特点。方法：取SD胎鼠NSCs悬浮培养，光镜观察细胞形态，使用Nestin、微管相关蛋白2（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、半乳糖神经鞘氨醇酶（GalC）免疫荧光法鉴定细胞。培养第3代后使用ELISA法测量其GDNF及NGF分泌量，连续测量6代。结果：光镜下第3代细胞仍保持较多NSCs特征，至第6代，大部分干细胞分化为星形胶质细胞，少部分分化为神经元或少突胶质细胞。第3代细胞GDNF的分泌量较低，但随着培养时间的延长，其分泌量逐渐增高；而第3代细胞NGF的分泌量较高，但其分泌有一个高峰期（第6代），随后逐渐下降。结论：在体外培养条件下，NSCs干细胞阶段分泌GDNF的能力较低，而分泌NGF的能力较高；进入分化阶段后，分泌GDNF的能力提高，而分泌NGF的能力有所减弱。利用干细胞移植治疗中枢神经系统损伤时应注意时程的选择。     

远志皂苷元对新生大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的：观察远志皂苷元对体外培养的胎鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖分化的影响。方法利用无血清DMEM/F12体外培养技术从新生Wistar大鼠大脑海马中培养NSCs,添加不同浓度(0、1、2、4μg/ml)远志皂苷元。应用免疫荧光技术对NSCs及其分化后的细胞进行鉴定。结果培养的NSCs能够表达Nestin,并具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力。在同一接种密度条件下,远志皂苷元干预组的Nestin阳性细胞数较对照组减少(P<0.05),神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数较对照组增加(P<0.05)。结论远志皂苷元能促进新生大鼠大脑海马NSCs的分化。     

封闭Notch信号影响神经干细胞分化的体外研究

目的探讨γ-分泌酶抑制剂N-［N-（3,5-二氟苯乙酰丙烯基）］-s-苯甘氨酸叔丁基酯（DAPT）对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导神经干细胞（NSCs）分化的作用及对Notch通路的影响。 方法原代培养来自大鼠前脑组织的NSCs,根据处理措施将NSCs分为溶剂对照组、TGF-β1诱导组（TGF-β1处理细胞,浓度为5 ng/L）和DAPT干预组（5 ng/L TGF-β1基础上加入1或10 μmol/L DAPT）。细胞培养3、8、24和48 h后,real-time RT-PCR检测Notch信号关键分子Notch1和Jagged1 mRNA的表达;Western Blot检测星形胶质细胞标志物-胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及NSCs标志物-巢蛋白（Nestin）的表达;细胞免疫荧光染色法检测Notch1、Jagged1、GFAP及Nestin的表达。 结果TGF-β1处理后,可加速诱导NSCs的分化。NSCs标记物GFAP的表达呈现时间依赖性,早期并不表达,在8 h后GFAP开始表达,并随时间延长而表达增加。而Nestin早期明显表达,但8 h后表达明显下调,这提示（TGF-β1）作用8 h后可诱导NSCs向星形胶质细胞转化。深入研究显示,Notch1和Jagged1也在TGF-β1作用8 h后表达逐渐升高,这提示TGF-β1介导星形胶质细胞转化过程中,Notch信号可能被激活进而参与了此过程。应用DAPT处理后,GFAP表达在8 h与对照组相比无明显差异,而在48 h后逐渐下降;伴随着Notch1和Jagged1表达的下调,提示DAPT作用后,NSCs向星形胶质细胞转化被抑制,这与Notch信号活性的下降有关。 结论TGF-β1可诱导了NSCs向星形胶质细胞转化,并且具有时间依赖性;其机制可能与Notch信号的活化有关。DAPT的干预可封闭Notch信号,进而抑制TGF-β1介导NSCs向星形胶质细胞分化。     

酸性肽对大鼠星形胶质细胞分泌神经生长因子和脑源性神经因子水平的影响

背景：神经生长因子和脑源性神经因子对神经细胞的存活和增殖非常重要。阿尔茨海默病患者的神经生长因子和脑源性神经因子水平均较低。目的：探讨酸性肽能否增加大鼠星形胶质细胞分泌神经生长因子和脑源性神经因子。设计：随机对照动物实验。单位：郑州大学医学院生物化学与分子生物学教研室。材料：实验于2003—09／2005—05在郑州大学生物活性肽研究所第一实验室和郑州大学基础医学院细胞培养中心完成。选取出生后2d内的SD乳鼠15只作为实验对象。方法：①将SD乳鼠在无菌条件下断头取出大脑皮质部分，进行星形胶质细胞的纯化培养，采用胶质纤维酸性蛋白免疫组化方法鉴定星形胶质细胞。②将培养的星形胶质细胞随机分为6组：空白对照组、血清对照组、阳性对照组、酸性肽37．5，75，150mg／L治疗组。空白对照组不施加任何实验因素，血清对照组加入体积分数为0．2的血清，阳性对照组加入1000U／mL干扰素，酸性肽治疗组则分别加入37．5，75，150mg／L的酸性肽。③将长满瓶底的第2代星形胶质细胞消化成单细胞悬液，以5&;#215;10^5mL等量接种于3块12孔培养板中。各组均于培养24，48，72h各时间点测定细胞存活率、细胞上清液中和细胞内神经生长因子及脑源性神经因子含量。主要观察指标：①不同培养时间各组细胞计数和存活率的检测结果。②酸性肽对大鼠星形胶质细胞增殖的影响。③不同培养时间各组星形胶质细胞上清液中神经生长因子及脑源性神经因子含量的变化。结果：①与空白对照组比较，酸性肽75，150mg／L治疗组细胞计数和细胞存活率在培养24，48，72h时均明显增加（P〈0．05，0．01，0．001）；酸性肽37．5mg／L治疗组虽有所增加但不明显。②与空白对照组比较，酸性肽37．5，75，150mg／L治疗组细胞增殖率均显著升高（0，17．5％，45．5％，72．5％，P〈0．001）。③与空白对照组比较，酸性肽37．5，75，150mg／L治疗组细胞上清液中神经生长因子的吸光度值在培养24，48，72h时均明显增加（P〈0．001）；除了在培养24h时间点酸性肽37．5mg／L治疗组不能增加星形胶质细胞分泌脑源性神经因子外，其他各浓度酸性肽治疗组在培养24，48，72h时脑源性神经因子的吸光度值均显著提高（P〈0．05，0．001）。结论：酸性肽能够不同程度地增加大鼠星形胶质细胞分泌神经生长因子和脑源性神经因子。     

胶质细胞参与吗啡耐受的形成

目的观察长期吗啡治疗引起胶质细胞的应答。方法采用吗啡鞘内注射和氟代柠檬酸鞘内给药，免疫组织化学方法检测星形胶质细胞的特殊标记物GFAP。结果通过星形胶质细胞的特殊标记物GFAP在免疫组织化学中进行检测，连续9天，每日1次吗啡全身给药（50mg／kg，i．p．）引起脊髓、后部扣带回皮质和海马的GFAP免疫染色密度的明显增加，而在丘脑没有变化。这种增加主要是星形胶质细胞的肥大而不是增殖或者移行。吗啡鞘内注射（20μg／2μl，i．t．）和氟代柠檬酸（1nmol／μl，i．t．）——星形胶质细胞特异可逆性抑制剂，同时鞘内给药，通过行为学测试，吗啡脊髓止痛耐受只是部分而不是明显减弱，脊髓GFAP免疫染色密度增加也是部分被阻滞。结论目前研究为在体吗啡耐受形成中胶质细胞的作用提供了第一手证据。     

转录调控因子Shh促进胎鼠脊髓神经干细胞体外增殖的效应

目的：观察体外转录调控因子Shh对脊髓神经干细胞的增殖效应，探讨其在脊髓损伤中可能的应用。方法：以一定含量的Shh处理原代和传代的脊髓神经干细胞，分别在接种细胞后的第2，4，6天计数神经球的形成情况；并用胎牛血清作分化诱导剂，观察Shh中干细胞球的分化情况，8d后，免疫组化双标鉴定并计数神经微丝-200(NF-200)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞的比例，对比碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作统计学分析。结果：Shh(5～50nmol／L)在体外可以促进胎鼠脊髓原代和传代的神经干细胞增殖，且表现为剂量依赖性，Shh(50nmol／L)的增殖效应几同bFGF(20μg／L)；增殖的细胞可分化神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，其神经元与星形胶质细胞的比例同bFGF组的分别为64％：36％和63％：37％。结论：Shh(5～50nmol／L)在体外可以剂量依赖性的促进胎鼠脊髓原代和传代的神经干细胞增殖，且增殖的细胞具有多分化潜能，其分化细胞的趋向类似于bFGF组。     

Id3-EGFP融合基因表达载体的构建及其在人肺癌细胞A549中的表达

目的构建人分化抑制因子3（Id3）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合基因表达载体pEGFP／Id3，使Id3-EGFP融合蛋白在人肺癌细胞A549中得到表达。方法扩增并克隆人Id3 cDNA，构建Id3和EGFP的融合基因表达载体pEGFP／Id3。用脂质体转染技术将pEGFP／Id3导入A549细胞，使Id3-EGFP融合蛋白在A549细胞得到表达。结果经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实，Id3基因已正确插入pEGFP-N1中EGFP基因的上游，获得融合基因表达载体pEGFP／Id3。利用脂质体转染技术将pEGFP和pEGFP／Id3转入A549细胞，24h后，在激光共聚焦荧光显微镜下可观察到表达EGFP的细胞发出绿色荧光，流式细胞术分析表明，转染48h时EGFP阳性表达细胞率最高，分别可达65．40％和60．50％。pEGFP／Id3转染的A549细胞S期细胞和G2期细胞比例均明显高于pEGFP转染细胞组和未转染细胞组，表明Id3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展，从而促进细胞增殖。结论真核表达载体pEGFP／Id3的成功构建及其在A549细胞中的表达，为研究Id3的细胞定位表达及Id3在细胞生长调控中的作用奠定了实验基础。     

联合神经生长因子诱导小鼠胎肝间充质干细胞向神经外胚层分化

目的：观察小鼠胎肝间充质干细胞在联合神经生长因子的作用下向神经细胞分化的能力。方法：实验于2004-03／09在暨南大学血液病研究所完成。健康BABL／c小鼠按雌雄2：1的比例合笼过夜，第2天分开并检查。以见到阴栓为怀孕的标准，计为孕0．5d。分离孕13．5d BABL／C胎鼠肝脏，贴壁法收获胎肝间充质干细胞。用以下方案进行诱导：碱性成纤维生长因子（10μg/L 4d；碱性成纤维生长因子（10μg/L和成纤维生长因子8（10μg/L）4d；碱性成纤维生长因子（10μg/L、脑源性神经营养因子（10μg/L以及2％的B27 4d。观察诱导细胞的形态学变化。于诱导0,4，12d收获细胞，反转录聚合酶链反应检测神经特异性基因表达；免疫细胞染色检测神经特异性蛋白的表达。以上实验均重复3次。结果：①形态学变化：经贴壁法分离的胎肝间充质干细胞呈均质梭形。碱性成纤维生长因子诱导3d，胎肝间充质干细胞开始变圆并聚集，呈神经干细胞样形态。经成纤维生长因子8和脑源性神经营养因子的进一步诱导后，大部分细胞呈现典型的神经元样细胞形态，极少数细胞呈星形胶质细胞样形态。②胎肝间充质干细胞经过神经生长因子的顺序诱导后，表达神经特异性基因：未诱导的胎肝问充质干细胞巢蛋白（nestin神经干细胞特异性）、低分子量神经丝蛋白（神经元特异性）、胶质纤维酸性蛋白基因（星形胶质细胞特异性）表达与看家基因（甘油醛-3磷酸脱氢酶）的比值分别为（0.06&;#177;0.02）,0,0；诱导4d分别为（0．59&;#177;0．11），（0．46&;#177;0．23），（0．20&;#177;0．96）；诱导12d分别为（0．21&;#177;0．07），（0．85&;#177;0．31），（0．13&;#177;0．10）。每种基因在不同诱导时间的表达具有统计学差异（P〈0．01）。③经过神经生长因子的顺序诱导，胎肝问充质干细胞表达神经特异性蛋白：未诱导的细胞不表达巢蛋白（神经干细胞特异性）、微管蛋白Tubulin（神经元特异性）以及胶质纤维酸性蛋白（星形胶质细胞特异性）；诱导4d，圆形细胞及细胞团nestin染色阳性，Tubulin阳性细胞为（62．3&;#177;3．5）%，仅有（6．0&;#177;1．6）％的细胞显示胶质纤维酸性蛋白阳性；诱导12d，巢蛋白阳性细胞开始减少，Tubulin阳性细胞达（90．3&;#177;1．5）％；胶质纤维酸性蛋白阳性细胞为（4．7&;#177;1．5）%。诱导12d的细胞微管蛋白Tubulin阳性表达率与诱导4d的细胞相比有统计学差异；而诱导12d的细胞胶质纤维酸性蛋白阳性表达率与诱导4d的细胞相比没有统计学差异。结论：胎肝间充质干细胞在联合神经生长因子提供的信号作用下可以分化为神经元样细胞，诱导结束后，细胞表现为典型的神经元形态并表达神经元特异性蛋白Tubulin。     

胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化

背景:胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1同属于转化生长因子β超家族,两者在哺乳动物中枢与外周神经系统发育、分化及细胞周期的调节中扮演重要角色。目的:观察胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导脊髓源性神经干细胞的分化,并与单一因子诱导培养液比较。设计:对照观察。单位:南方医科大学附属深圳医院中心实验室。材料:选用10只清洁级孕16d的SD大鼠,由华中科大同济医学院动物中心提供。主要试剂及材料:DMEM/F12,B27(GIBCO);碱性成纤维细胞生长因子,EGF,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子-β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白(nestin)多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多抗,神经丝蛋白(NF-200)单抗(Sigma)。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。无菌条件下分离大鼠胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。实验分①基础培养基组:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02 B27添加液的DMEM/F12。原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆。②对照组:在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清。③碱性成纤维细胞生长因子组。④转化生长因子β1组。⑤胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组。换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子 2μg/L转化生长因子β1。①光镜观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化情况。②免疫细胞化学染色标记检测神经元与星状胶质细胞的表达。③通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。主要观察指标:①各组细胞分化的形态学特点。②各组神经干细胞免疫组织化学检测结果。③各组神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。结果:①细胞分化形态:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程。在细胞密度较低区域可辨认出神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞。②免疫组织化学检测结果:对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组及胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性。③神经元及星状胶质细胞的阳性百分比:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组神经元阳性百分比高于血清对照组、碱性成纤维细胞生长因子组及转化生长因子β1组(χ2=24.15,19.56,25.32,P<0.05～0.01),星状胶质细胞阳性百分比低于血清对照组及转化生长因子β1组(χ2=24.45,23.79,P<0.01)。结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,说明两者具有协同作用。     

表皮生长因子培养条件下脑源性神经生长因子诱导大鼠海马神经干细胞向神经元分化的最佳浓度

背景：目前神经干细胞的定向分化是神经干细胞研究的热点。脑源性神经生长因子作为诱导剂可否诱导神经干细胞分化为神经元。目的：观察在表皮生长因子培养条件下,不同质量浓度脑源性神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的影响。设计：对比实验。单位：中国医科大学人体解剖学教研室。材料：实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成。提取成年SD大鼠海马神经干细胞,无血清技术培养。清洁级成年SD大鼠3只,体质量200-250g,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R＆D公司提供。方法：①无菌条件下分离大鼠海马组织,用含碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养神经干细胞。②取第4代神经干细胞,利用有限稀释法进行单细胞克隆培养。将单细胞克隆传代后的克隆球细胞进行神经干细胞的鉴定。克隆球细胞行巢蛋白免疫细胞化学染色,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。③单细胞克隆的神经干细胞脑源性神经生长因子诱导分化实验,根据脑源性神经生长因子质量浓度不同分成0μg/L浓度的对照组和50、100、150、200μg/L浓度的4个实验组,各组的培养液中均加入表皮生长因子,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,检测神经干细胞向神经元分化情况。主要观察指标：神经干细胞分化为神经元的比例。结果：①神经干细胞免疫细胞化学染色结果显示,单细胞克隆培养后克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②50,100μg/L组脑源性神经生长因子组神经干细胞分化为神经元比例明显高于对照组、150,200μg/L脑源性神经生长因子组组（t=2.502-5.025,P〈0.05）;50,100μg/L脑源性神经生长因子组之间神经干细胞分化为神经元的比例差异不显著（P〉0.05）;对照组、150,200μg/L组3组间神经干细胞分化为神经元比例差异不显著（P〉0.05）结论：在20μg/L表皮生长因子培养条件下,脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳质量浓度为50μg/L。     

癫痫发作1h后延髓内脏带区域内反应神经元与星形胶质细胞功能单位的分布特征:激光共聚焦显微镜研究

背景传统观点认为癫痫是大脑不同区域内神经元出现异常兴奋引起的复杂神经行为紊乱现象.而对星形胶质细胞在癫痫发病中的作用目前研究较少.目的研究戊四氮诱导大鼠癫痫发作后延髓内脏带内神经元和星形胶质细胞的反应.设计随机对照的实验研究.地点和材料实验在南方医科大学珠江医院神经外科实验室和解放军第四军医大学全军神经科学研究所完成.成年健康SD大鼠14只,体质量180～220 g,清洁级,由解放军第四军医大学实验动物中心提供.干预用抗Fos蛋白、抗酪氨酸羟化酶和抗胶质原纤维酸性蛋白的三重免疫荧光组织化学方法结合激光共聚焦显微镜技术,显示癫痫发作1 h后延髓内脏带内反应性神经元与星形胶质细胞的分布.主要观察指标对延髓内脏带内Fos,胶质原纤维酸性蛋白和抗酪氨酸羟化酶阳性细胞的分布及胶质原纤维酸性蛋白阳性星形胶质细胞与神经元的关系进行观察.结果延髓内脏带内的Fos阳性神经元和胶质原纤维酸性蛋白阳性星形胶质细胞明显增多,三重免疫组化方法显示反应性神经元(Fos阳性)与反应性星形胶质细胞(胶质原纤维酸性蛋白阳性)关系密切,发现3种不同标记的"神经元-星形胶质细胞复合体"即抗酪氨酸羟化酶+/Fos+/胶质原纤维酸性蛋白+三标记复合体、抗酪氨酸羟化酶+/胶质原纤维酸性蛋白+/Fos-和Fos+/胶质原纤维酸性蛋白+/抗酪氨酸羟化酶-二标记复合体.结论延髓内脏带内的神经元和星形胶质细胞在癫痫发作时反应强烈,可能以神经元-星形胶质细胞复合体作为功能单位参与癫痫发病的调节.     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞的诱导分化：无血清培养条件下观察

背景:神经干细胞作为修复损伤神经组织的细胞源已引起学者的关注,如何有效的获取更多的神经干细胞逐渐成为重点解决的课题之一。目的:观察大鼠室管膜下区和海马回神经干细胞体外培养、传代和分化情况。设计:单一样本实验。单位:中山大学附属第三医院神经外科。材料:取出生后3dSD大鼠10只,雌雄不拘,由中山大学实验动物中心提供。巢蛋白抗体(兔抗大鼠)、神经微丝蛋白(NF-200)抗体(兔抗大鼠)、胶质纤维酸性蛋白抗体(小鼠抗大鼠)均购自Sigma公司。方法:实验于2006-09/12在中山大学基础医学院组织胚胎学实验室完成。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。从新生大鼠海马、室管膜下区分离神经干细胞,采用DMEM/F12无血清悬浮的条件培养,同时在培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子代替血清中含有的分裂原,进行体外扩增培养、传代观察。主要观察指标:采用免疫荧光检测技术,通过检测神经干细胞表达的nestin、神经元细胞表达的神经微丝蛋白和星形胶质细胞表达的胶质纤维酸性蛋白,鉴定神经干细胞及其分化结果。结果:分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力,原代及传代培养20代后,在倒置显微镜下仍保留典型的"细胞克隆球"特征,神经克隆球通过nestin免疫荧光染色,呈阳性反应。经诱导后,细胞克隆球细胞外迁贴壁生长,可分化为神经微丝蛋白阳性的神经元细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞。结论:实验分离培养出具有自我更新和增殖能力的神经干细胞,其可诱导分化为神经元样细胞和星形胶质细胞。     

FGF-2,NT-3对海马表皮生长因子反应性神经干细胞分化为神经元的诱导作用

目的:比较碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)和神经营养素3(NT-3)对海马表皮生长因子(EGF)反应性神经干细胞(NSC)分化为神经元的诱导作用。方法:在含EGF的培养体系中分离培养NSC,免疫荧光染色检测NSC特征性标志nestin的表达,Brdu掺入实验检测细胞增殖状态。将NSCs接种在6孔培养板中,分成4组:FGF-2组、NT-3组、FGF-2+NT-3组和对照组。培养10d时,用免疫细胞化学染色和荧光标记技术检测其神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达,并计算阳性染色细胞的百分率。结果:FGF-2和NT-3均可诱导EGF反应性NSC分化为神经元,FGF-2优于NT-3。对照组神经元细胞分化率低,仅为3.70%。联合应用FGF-2和NT-3,可使神经元分化率增加约10倍。结论:FGF-2与NT-3联合作用能更好地促进海马EGF反应性NSC分化为神经元细胞。     

体外血清预培养促进神经干细胞增殖

背景:神经干细胞的临床应用前景广阔,寻找多种方法体外促进神经干细胞的增殖和分化为今后的发展方向。目的:介绍一种省时且经济的神经干细胞的培养方法。设计:观察对比实验。单位:北京市神经外科研究所。材料:选择4只孕14天Wistar大鼠,常温常湿环境饲养,体质量(180±20)g,均购自中国医学科学院动物所(实验动物许可证号码:SCXK1100-0006)。DMEM/F12(1∶1)以及B27购自Gibco公司;碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子购自PeproTech公司;巢蛋白单克隆抗体、胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体、半乳酸脑苷多克隆抗体和微管相关蛋白2单克隆抗体购自Chemicon公司。胎牛血清购自Hyclone公司。方法:实验于2004-05/2004-10在北京市神经外科研究所损伤修复室完成。将Wistar大鼠脱臼处死,每次取4只胎鼠,将其脑组织置于Hank’s液中,解剖显微镜下剥离软脑膜及血管,眼科剪剪碎脑组织并收集细胞于2个离心管中离心,弃上清液。①根据给予血清预培养与否将细胞分成血清预培养组及对照组。血清预培养组细胞加入含100g/L胎牛血清DMEM培养液,培养48h后换含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM/F12培养液;对照组细胞中直接加含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM/F12培养液,37℃,体积分数为0.05的CO2培养箱培养1周。通过相差显微镜观察血清预培养组对照组培养48h后神经干细胞的生长情况。②用100g/L胎牛血清诱导分化后的第5天和第10天行nestin、胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体、半乳酸脑苷多克隆抗体和微管相关蛋白2单克隆抗体免疫荧光染色,采用荧光显微镜观察检测两组神经干细胞的表达;对照组采用PBS缓冲液替代一抗,其它步骤同血清预培养组。主要观察指标:①相差显微镜下观察血清预培养组及对照组神经干细胞培养48h后的生长状况。②免疫荧光染色检测两组神经干细胞的表达。结果:①血清预培养组细胞经培养48h后,出现大量较规则的神经干细胞球,多数细胞球由8-10个细胞聚集而成。改用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM/F12培养液后,细胞球增殖很快;对照组细胞培养48h后只有不规则片状块,4-5d后才出现规则的小细胞球。②荧光显微镜观察可见两组细胞的分化速度和分化方向相同,在诱导分化后的第5天,nestin、胶质纤维酸性蛋白、半乳酸脑苷为阳性,微管相关蛋白2为阴性;在诱导分化后的第10天,nestin和胶质纤维酸性蛋白为阳性,半乳酸脑苷和微管相关蛋白为阴性。结论:血清预培养可使神经干细胞聚球速度加快,促进神经干细胞增殖。     

人、鼠神经干细胞的生物特性比较

目的:比较分析体外人及小鼠神经干细胞原代培养的生长特性。方法:用无血清培养与单细胞克隆技术对人及鼠胚胎脑组织进行分离、培养。借用光镜、免疫组织化学对其鉴定,应用透射电镜对不同生长时期神经干细胞生物学特性进行观察。结果:人和鼠胚胎分离的细胞具有连续分化及克隆能力,克隆球与早期的原始细胞神经上皮干细胞蛋白(nestin)抗原呈阳性。诱导后成熟分化的细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及神经丝-200(NF-200)抗原呈阳性。小鼠神经干细胞电镜结果:1周时,细胞发育较为原始,核大胞质少,细胞器不发达,未观察到细胞突起及神经元与星形胶质细胞具备的特征。培养2周后,其电镜结果与1周结果无明显区别。继续培养到4周,见大部分细胞内出现空泡样变性,部分细胞表现出神经元及星形胶质细胞的一些特征。另外在克隆求内观察到类似细胞连接样结构。而人神经干细胞特性与小鼠神经干细胞相似,空泡样变性比小鼠神经干细胞更为明显。人与鼠神经干细胞经诱导分化10d后,见到典型的神经元及星形胶质细胞特征。结论:人及鼠神经干细胞具有很强的增殖能力,生物特性相似。     

神经干细胞移植治疗脊髓损伤

背景:研究已证实神经干细胞能促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,但对移植细胞在体内的增殖、分化、迁移的研究有限。目的:观察神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠后肢运动功能修复的影响。方法:SD大鼠制成T10脊髓全横断损伤模型,于造模成功后1周采用局部微量注射法。随机数字表法分为3组:损伤对照组仅打开椎管暴露脊髓;移植对照组:注射10μLDMEM/F12培养液;细胞移植组:造模后移植浓度为1.0×109L-1的神经干细胞悬液10μL。移植后通过不同时间点BBB行为评分、病理组织学、免疫荧光技术评价大鼠脊髓功能修复情况及移植细胞在体内的存活、迁移、分化。结果与结论:在体外成功建立SD大鼠海马源性神经干细胞培养体系;移植对照组、细胞移植组大鼠随着时间延长BBB评分均不同程度提高,从移植后2周起细胞移植组大鼠评分明显高于移植对照组(P<0.05);神经干细胞移植后能够在体内继续存活、迁移并且分化为NF-200、GFAP表达阳性的神经元及星形胶质细胞。提示神经干细胞移植治疗脊髓损伤是一种有效的方法。     

碱性成纤维生长因子和神经生长因子联合应用培养成年大鼠海马神经干细胞向神经元样细胞的分化

背景：影响神经干细胞向神经元分化的因素很多,各种营养因子可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞大量分化为神经元是研究的热点问题。目的：观察联合应用碱性成纤维生长因子和神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞为神经元的影响。方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织,传至第4代克隆球直径约为200μm时,滴加DMEM/F12＋2%B27＋20μg/L表皮生长因子＋20μg/L碱性成纤维细胞生长因子,进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子＋神经生长因子组。观察传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定,计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况。结果与结论：①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组均明显提高（P〈0.05）,且碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组神经元的比例最高（P〈0.05）。提示,碱性成纤维细胞生长因子可以提高神经生长因子诱和神经生长因子均可促进神经干细胞向神经元分化,且二者联合应用效果更佳。