细胞外信号调节激酶在缺糖缺氧/复糖复氧神经元中的表达与银杏叶提取物的调节作用

目的研究细胞外信号调节激酶(ERK1/2)在缺糖缺氧/复糖复氧神经元中的表达以及银杏叶提取物的调节作用。方法利用原代培养的皮层神经元,通过去除培养液中的糖和氧(oxygen and glucose deprivation,OGD)模拟缺血缺氧,恢复糖氧供给模拟再灌注。通过免疫蛋白印迹法测定ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达。再灌注时加用银杏叶提取物(EGB761)观察其对神经元保护作用以及时ERK1/2表达的调节作用。结果缺糖缺氧/复糖复氧后神经元p-ERK1/2表达明显下降,EGB761可剂量依赖地保护神经元活性,并可上调p-ERK1/2蛋白的表达。结论EGB761对培养的神经元缺糖缺氧/复糖复氧损伤有保护作用,该作用可能与激活ERK信号转导通路有关。     

银杏叶提取物对缺血-再灌流神经元损伤的保护作用及其信号转导机制

目的研究银杏叶提取物(EGB761)对缺糖缺氧/复糖复氧神经元损伤的保护作用,并探讨其主要细胞内信号转导机制。方法利用原代培养的皮层神经元,通过去除培养液中的糖和氧(oxygen and glucose deprivation,OGD)模拟缺血缺氧,恢复糖氧供给模拟再灌流。通过免疫蛋白印迹法测定Akt、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白的表达。再灌流时加用银杏叶提取物(EGB761)观察其对神经元保护作用以及对Akt、p-Akt表达的调节作用。结果缺糖缺氧/复糖复氧后神经元p-Akt表达明显下降,EGB761可剂量依赖地保护神经元活性,并可上调因缺糖缺氧/复糖复氧而降低的p- Akt蛋白的表达,但该作用不被Ly294002所阻断。结论EGB761对培养的神经元缺糖缺氧/复糖复氧损伤有保护作用,该作用可能与非PI3K依赖的p-Akt信号转导通路激活有关。     

大鼠海马神经元体外氧糖剥夺/复氧模型的构建

目的 建市体外培养的大鼠海马神经元氧糖剥夺(OGD)/复氧实验模型,并尝试确定该模型最合适的缺氧缺糖时间点.方法 新生SD乳鼠海马神经元原代培养7 d后,随机(随机数字法)分为OGD组和对照组.OCD组根据氧糖剥夺时间的不同又分为1 h,2 h,4 h,6 h,8 h,10 h亚组.OGD组细胞置于含0.5%氧气的三气培养箱,同时将培养液换成无糖Earle氏液,模拟体内脑缺血损伤.复氧复糖24 h后观察对照组和OCD各组的神经元形态,测定MTT细胞光密度值(OD)和培养液LDH含量,流式细胞仪检测细胞凋亡率.所得数据采用SPSS 16.0统计软件行单因素方差分析(Dunnett-t检验)和Spearman等级相关分析.结果 随着缺氧缺糖时间的延长,OGD各组神经元形态学损伤逐步加重,细胞OD值和存活率逐渐下降(rs=-0.961和rs=-0.966,P<0.01),LDH值逐渐升高(rs=0.990,P<0.01),细胞凋亡率明显增加,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05).OGD6 h时,细胞的凋亡率接近50%.结论 成功建立了大鼠海马神经元体外氧糖剥夺/复氧模型,结合形态学改变和细胞凋亡率,建议将6 h作为该模型合适的缺氧缺糖损伤时间.     

鼠骨髓间充质干细胞对缺氧/复氧心肌细胞的影响

目的:观察在体外培养条件下骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)对缺氧/复氧新生大鼠心肌细胞的保护作用.方法:无菌条件下分离、培养、传代Wistar大鼠MSC,细胞融合达90%时更换培养基培养24 h,收集细胞培养液作为MSC条件培养基;原代培养新生Wistar大鼠心肌细胞,先用5% CO2、10% H2、85% N2混合气造成细胞缺氧24 h,再给予95% O2 和 5% CO2混合气复氧2 h,建立缺氧/复氧模型.MSC 处理组于复氧时加入MSC 条件培养基,正常细胞作为对照组,分别于复氧后用MTT法、乳酸脱氢酶(lactated dehydrogenase)法测定各组心肌细胞活性的改变;RT-PCR观察细胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达.结果: 与对照组比较,缺氧/复氧组细胞活力显著降低(P ＜ 0.01).与缺氧/复氧组比较,MSC处理组细胞活力明显增加(P ＜ 0.01).缺氧/复氧组抗凋亡基因Bcl-2的表达明显降低,促凋亡基因Bax的表达明显增加,而MSC条件培养基可以减少Bax基因的表达,提高Bcl-2/Bax值,与缺氧/复氧组比较差异具有显著性(P ＜ 0.01).结论:MSC对体外缺氧-复氧诱导的心肌细胞的凋亡有保护作用.     

黄芩素通过抗氧化及调节细胞内钙离子浓度抑制大鼠缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡

背景:黄芩素对缺氧复氧损伤的心血管有保护作,但机制至今不清。目的:探讨中药黄芩素对心肌细胞缺氧/复氧损伤导致心肌细胞凋亡的保护作用机制。方法:体外培养大鼠乳鼠心肌细胞培养。实验分3组:正常对照组为正常培养的心肌细胞未做处理;缺氧/复氧组为应用缺氧/复氧方法诱导心肌细胞凋亡损伤;黄芩素预处理组为经黄芩素预处理30min后经缺氧/复氧诱导的心肌细胞。通过检测培养基上清液中乳酸脱氢酶活力检测细胞损伤程度及黄芩苷保护作用;应用原位末端标记细胞法标记细胞后,流式细胞检测心肌细胞凋亡率;应用免疫印迹方法检测心肌细胞凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达水平;应用Fura-2-AM负载心肌细胞,实时检测心肌细胞内Ca2+浓度变化。结果与结论:与正常对照组相比,缺氧/复氧组上清液乳酸脱氢酶活性、心肌细胞凋亡率、Bax蛋白含量、心肌细胞Ca2+浓度均增加(P<0.05),Bcl-2蛋白含量降低(P<0.05)。与缺氧/复氧组相比,黄芩素预处理组乳酸脱氢酶含量、心肌细胞凋亡率、Bax蛋白含量及心肌细胞Ca2+浓度均降低(P<0.05),Bcl-2蛋白含量增加(P<0.05)。证实黄芩素能抑制缺氧/复氧导致的心肌细胞凋亡,其作用机制可能与抗氧化与调节心肌细胞内钙离子浓度有关     

重组腺病毒介导的Bcl-2基因转染对缺氧再复氧肠上皮细胞的保护作用

目的探讨复制缺陷型重组腺病毒介导的Bcl-2基因转染对缺氧再复氧损伤肠上皮细胞的保护作用。方法构建能介导Bcl-2基因转染和表达的复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad/CMV-Bcl-2),转染体外培养的小肠上皮细胞株(IEC-6),检测其Bcl-2基因表达变化,分别对正常对照组、缺氧复氧组(单纯给予缺氧复氧处理)、Ad-CMV/Bcl-2转染组(AdCMV/Bcl-2腺病毒载体转染48h后再给予缺氧复氧处理)细胞的凋亡率、死亡率及活力进行分析。结果对照组微弱表达,Ad/CMV-Bcl-2转染组细胞Bcl-2基因高表达;经缺氧再复氧处理后,Annexin-V-Flous试剂盒检测死亡细胞明显减少(P0.01),凋亡显著受到抑制(P0.01);采用MTT法证明,Ad/CMV-Bcl-2转染组细胞活力较对照组明显增强(P0.01)。结论复制缺陷型重组腺病毒介导的Bcl-2基因转染可显著减轻缺氧再复氧导致的肠上皮细胞损伤。     

大鼠缺氧复氧损伤神经元钙敏感受体表达水平及其与神经元凋亡的相关性分析

目的分析缺氧复氧损伤神经元钙敏感受体表达水平及其与神经元凋亡的相关性。方法取新生SD大鼠(出生1 d)脊髓神经元,随机分为A组(正常对照,未进行任何处理)、B组(建立缺氧复氧损伤模型)、C组(缺氧复氧损伤+激动剂GdCl_3)、D组(缺氧复氧损伤+抑制剂NPS-2390)。通过免疫荧光技术对各组大鼠脊髓神经元中钙敏感受体的表达定位进行检测,并用Western blotting法对各组钙敏感受体及凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达水平进行检测,通过激光共聚焦显微镜对细胞内游离钙的变化进行检测,同时用TUNEL法对各组细胞凋亡情况进行检测。结果 B组钙敏感受体和细胞内游离钙的表达水平较A组显著升高(P 0. 01),C组钙敏感受体和细胞内游离钙表达水平较B组显著升高(P 0. 01),D组钙敏感受体和细胞内游离钙表达水平较B组显著下降(P 0. 01)。B组细胞凋亡比率较A组显著升高,C组细胞凋亡比率较B组显著升高,D组细胞凋亡比率较B组显著下降(P 0. 05)。B组凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平较A组显著下降,Bax和Caspase-3的表达水平较A组显著升高(P 0. 05); C组Bcl-2的表达水平较B组显著下降,Bax和Caspase-3的表达水平较B组显著升高(P 0. 05); D组Bcl-2的表达水平较B组显著升高,Bax和Caspase-3的表达水平较B组显著下降(P 0. 05)。结论在大鼠缺氧复氧损伤模型中,钙敏感受体在脊髓神经元中的表达水平升高,细胞内游离钙增多,脊髓神经元细胞凋亡比率升高,凋亡相关蛋白的表达水平升高。     

胞二磷胆碱对大鼠海马神经元缺糖缺氧再灌注损伤的保护作用

目的观察胞二磷胆碱对大鼠海马神经元缺糖缺氧再灌注损伤的保护作用。方法建立海马神经元缺糖缺氧再灌注损伤模型,随机分为正常对照组、缺糖缺氧再灌注组、胞二磷胆碱干预组(1、10、100μmol/L),观察再灌注6、24h还原型谷胱甘肽含量以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性的改变;于再灌注24h检测海马神经元四甲基偶氮唑盐(MTT)代谢率,以及流式细胞术检测凋亡。结果与缺糖缺氧再灌注组相比,胞二磷胆碱于再灌注6h可明显提高谷胱甘肽(GSH)的含量及GPx的活性(P<0.05);于再灌注24h可增高MTT代谢率,提高GPx的活性及减少海马神经元凋亡(P<0.05)。结论胞二磷胆碱对海马神经元缺糖缺氧再灌注损伤有明显的保护作用,其机制可能与改善神经元GSH含量、GPx活性及减少凋亡有关。     

血管内皮生长因子对神经细胞的保护作用及机制

目的 探讨VEGF对体外培养的神经元保护作用及机制。方法 体外培养大鼠皮质神经元细胞，建立神经细胞缺氧缺糖/再灌注损伤模型(OGSD)，在加入VEGF基础上，加入VEGFR-2/Flk-1受体抑制剂SU1498；检测以下指标：①观察细胞形态学变化②细胞活力：MTT法③线粒体跨膜电位④凋亡相关蛋白：Bc1-2和Bax表达。结果 ①OGSD组、VEGF164+SU1498组细胞损害重，VEGF组细胞损害轻(p<0.05)；②OGSD组、VEGF164+SU1498组细胞活力下降明显(p<0.05)，而VEGF组与正常组无明显区别；③OGSD组、VEGF164+SU1498组线粒体跨膜电位不稳定(p<0.05)，VEGF能稳定线粒体跨膜电位；④OGSD组、VEGF164+SU1498组Bcl- 2、Bax蛋白表达均增多，VEGF组Bcl- 2蛋白表达增多最明显(p<0.01)，而Bax蛋白表达增多最不明显(p<0.01)。结论 VEGF对神经元起直接的保护作用，并通过与VEGFR-2受体结合减少了缺血、缺氧下培养的体外神经元细胞的凋亡。     

原代缺氧缺糖损伤神经元模型Cdh1及其下游底物的表达

背景：课题组前期实验已证实Cdh1在大鼠海马、皮质均有大量表达,且体外实验发现神经元中Cdh1表达高于神经干细胞,可能与神经干细胞向神经元分化有关。但细胞周期末期促进复合物调节亚基 Cdh1在缺血性神经元损伤中的作用,尚不明确。
　　目的：体外构建原代缺氧缺糖损伤神经元模型,观察Cdh1及其下游底物表达变化。
　　方法：取出生24 h内乳鼠大脑皮质,体外培养原代神经元并通过免疫荧光染色进行鉴定。使用无糖Earle’s 液替代细胞培养液,利用三气培养箱充以氮气建立原代神经元缺氧缺糖模型,缺氧处理1h后复氧。于缺氧前、缺氧缺糖损伤后6 h、1 d,3 d,7 d采用实时荧光定量PCR检测神经元Cdh1及其下游底物Skp2、Cyclin B1的表达。
　　结果与结论：体外缺氧缺糖损伤后,原代神经元Cdh1及其下游底物Cyclin B1表达上调(P<0.05),Skp2表达均下调(P <0.05)。提示,体外缺氧缺糖损伤后神经元Cdh1表达升高,可能通过泛素化降解Skp2参与缺氧性神经元凋亡等病理过程。     

Mdivi-1对糖氧剥夺后神经元凋亡蛋白Bax活化、嵌入及细胞色素C释放的影响

目的:研究线粒体分裂蛋白抑制剂Mdivi-1对糖氧剥夺(OGD)后神经元凋亡蛋白Bax活化、嵌入及细胞色素C(Cyt C)释放的影响。方法:体外培养原代皮质神经元并制备OGD模型,采用不同浓度的Mdivi-1干预细胞,MTT测定神经元存活率。之后采用10μmol/L Mdivi-1干预细胞,免疫共沉淀或细胞碱处理后测定细胞凋亡蛋白Bax的活化和嵌入情况。抽提线粒体和细胞浆蛋白,Western Blot测定线粒体内Cyt C释放情况。结果:Mdivi-1可以剂量依赖地改善OGD后神经细胞的存活,10μmol/L Mdivi-1干预可以减少凋亡蛋白Bax的激活和嵌入,并且减少Cyt C的释放。结论:线粒体分裂蛋白抑制剂Mdivi-1在OGD后具有明确的神经保护作用,其机制可能和其抑制细胞凋亡有关。     

神经生长因子预处理对沙土鼠全脑缺血/再灌注损伤脑神经细胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

目的探讨神经生长因子(NGF)预处理对沙土鼠全脑缺血/再灌注(I/R)损伤的脑保护作用的可能机制及最佳给药时间窗。方法采用夹闭沙土鼠双侧颈总动脉造成全脑I/R损伤模型。采用NGF侧脑室注射法进行预处理。沙土鼠30只随机分为5组,每组6只:假手术组(A组)、I/R损伤组(B组)、NGF预处理12、24和48h组(C、D、E组),除A组外各组分别于脑缺血20min、再灌注72h后处死取标本。用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测沙土鼠全脑I/R损伤后脑皮质及海马CA1区凋亡神经细胞,用免疫组化法检测凋亡相关调控基因Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果与B组比较,NGF预处理各组可显著减少沙土鼠全脑I/R损伤后脑皮质及海马CA1区神经细胞凋亡数目(P均<0.05),诱导Bcl-2蛋白及抑制Bax蛋白的表达(P均<0.05),其中以NGF预处理48h时脑皮质及海马CA1区细胞凋亡指数和Bax蛋白表达的阳性细胞指数最低,Bcl-2蛋白表达的阳性细胞指数最高。结论NGF预处理能明显减轻沙土鼠全脑I/R损伤引起的神经细胞凋亡,而以NGF预处理48h对脑保护效果最好;其抑制神经细胞凋亡的机制可能是通过调节凋亡相关调控基因Bcl-2及Bax的不同表达来发挥作用。     

EPO对心肺复苏后大鼠海马神经元的细胞凋亡、Bcl-2及Bax表达的影响

目的观察促红细胞生成素(EPO)在心肺复苏后对大鼠脑海马神经元细胞凋亡、Bcl-2和Bax表达的影响。方法雄性Wistar大鼠32只,随机分4组:正常对照组(A组)、假手术组(B组)、心肺复苏模型组(C组)、EPO干预组(D组)。C组、D组采用窒息的方法制作大鼠呼吸心跳骤停模型,后行心肺复苏治疗(CPR),D组CRP同时静脉给予EPO 3000U/kg;B组仅静脉给予等剂量生理盐水,4小时的脑海马组织,采用免疫组化法观察各组神经元细胞凋亡、Bcl-2及Bax的表达情况。结果光镜下A、B组未见凋亡细胞,C组可见较多凋亡细胞,D组凋亡细胞数少于C组(P0.01)。A、B组少量Bcl-2、Bax阳性细胞,C、D组Bcl-2、Bax阳性细胞数均高于A、B组(P0.01),D组Bcl-2阳性细胞数高于C组(P0.01),D组Bax阳性细胞数低于C组。结论心肺复苏后大鼠海马神经元的细胞凋亡明显增加,Bcl-2、Bax表达上调。EPO可抑制心肺复苏后海马神经元的细胞凋亡、上调Bcl-2表达同时下调Bax表达。     

丹参素对缺氧/复氧诱导H9C2心肌细胞损伤和内质网应激的改善作用

目的观察丹参素(DLA)通过抑制内质网应激和凋亡对H9C2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)后损伤的保护作用。方法将离体培养的H9C2心肌细胞随机分为3组:对照组、缺氧/复氧组(H/R组)、DLA+H/R组(DLA组)。H/R组先缺氧6h后复氧24h;DLA组于缺氧时给予DLA(10-6M)培养6h,再复氧24h。对照组心肌细胞正常培养至实验结束。ELISA测定细胞中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)和丙二醛(MDA)的含量;Western blot检测细胞中内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、Caspase-12、Bax、Bcl-2和SOD的蛋白含量。结果与对照组比较,H/R组细胞LDH、CK-MB和MDA的含量显著升高(P<0.05),GRP78、Caspase-12和Bax蛋白表达明显增加(P<0.05),而Bcl-2和SOD的蛋白含量明显降低(P<0.05);给予DLA可明显改善上述指标的变化。结论H/R可诱导H9C2心肌细胞发生凋亡、氧化应激和内质网应激,引起细胞损伤和凋亡;DLA可以通过抑制凋亡、氧化应激和内质网应激,减少细胞损伤,发挥保护细胞的作用。     

AMPK信号通路在异丙酚减轻老年大鼠短暂脑缺血再灌注损伤中的作用

目的探讨AMPK信号通路在异丙酚减轻老年大鼠短暂脑缺血再灌注损伤中的作用。方法健康雄性SD老龄大鼠(18²2月龄)150只,体重45022月龄)150只,体重450⁶00 g,采用随机数字表法将其分为5组(n=30):对照组(C组);假手术组(S组);缺血再灌注组(IR组);缺血再灌注组+异丙酚组(IR+P组)和缺血再灌注组+异丙酚组+AMPK激活剂组(IR+P+Y组)。采用Pusinelli四动脉阻断法建立全脑缺血模型。于缺血前10 min腹腔内注射异丙酚100 mg/kg,于夹闭动脉前时腹腔注射AMPK激活剂AICAR 500 mg/kg,假手术组仅暴露两侧翼孔和颈总动脉,对照组不行任何处理。采用Lawner等制定的评分标准神经行为学评估。于再灌注1、3和5 d时每组随机取10只处死,采用TUNEL法检测神经元的凋亡情况;采用Western blot法测定大鼠海马内AMPK、pAMPK、Bcl-2和Bax的表达。结果与C组比较,IR组、IR+P组和IR+P+Y组老年大鼠缺血/再灌注24 h后神经行为学评分升高,海马区TUNEL阳性神经元计数增加,海马AMPK、pAMPK表达水平升高,Bcl-2表达下调,Bax表达上调(P<0.05),与IR组比较,IR+P组老年大鼠缺血/再灌注24 h后神经行为学评分降低、海马区TUNEL阳性神经元计数减少、海马AMPK、pAMPK表达水平降低,Bcl-2表达上调、Bax表达下调(P<0.05),与IR+P组比较,IR+P+Y组老年大鼠缺血/再灌注24 h后神经行为学评分升高,海马区TUNEL阳性神经元计数增加,海马AMPK、p-AMPK表达水平升高,Bcl-2表达下调,Bax表达上调(P<0.05)。结论 AMPK信号通路参与了异丙酚减轻老年大鼠短暂脑缺血再灌注损伤的过程。     

姜黄素对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的：研究姜黄素对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其作用的机制。方法：采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，50只Wistar雄性大鼠被随机分为假手术组、缺血组和100mg／kg、300mg／kg姜黄素治疗组。缺血组和姜黄素治疗组分别在脑缺血再灌注后24h处死，观察大鼠神经功能缺失的评分．应用TTC染色观察梗死体积，应用TUNEL法及免疫组化染色检测脑组织凋亡细胞数及Bcl-2、Bax蛋白表达。结果：与损伤模型组比较．姜黄素治疗组改善大鼠神经功能的受损程度和减少脑梗死体积．各剂量姜黄素治疗组均可明显减少TUNEL染色阳性细胞数（P〈0.01），明显增加Bcl-2蛋白表达（P〈0.01），并且姜黄素治疗组Bax表达低于缺血组（P〈0．05）。结论：姜黄素可通过上调Bcl-2蛋白下调Bax蛋白表达而减少脑缺血再灌注后神经细胞凋亡．从而改善受损的神经功能．对脑缺血再灌注损伤起保护作用．