不同方式冻存的外周血干细胞复苏培养CIK细胞的实验研究

采集的PBSC悬液分外周血干细胞悬液冻存组和PBMNCs冻存组两组冷冻于-80℃保存。1个月后42℃复苏后,加入各种细胞因子(IFN-γ、IL-2、抗CD3单抗)诱导培养成CIK细胞,观察培养的细胞总数、培养总时间及细胞表型鉴定。经14~21d培养后,两组诱导扩增的CIK细胞总数无显著差异(P0.05),但在培养总时间上,PBMNCs冻存组为15.2±0.92d,干细胞悬液组为18.2±2.35d,差异有统计学意义(P0.05)。流式鉴定两组CIK细胞均可见总T细胞、CD8+T细胞、CD3+、CD56+细胞均较诱导前显著升高。通过在血细胞分离机分离采集单个核细胞时留取部分悬液冻存后复苏进行CIK细胞培养,可以获得有效的细胞输注数量,同时可作为一种补充手段,减少患者细胞采集时的痛苦和大量血液成分的丢失。     

造血干细胞体外冻存的效果评价

目的探讨不同冻存环境和不同冻存时间对外周血造血干细胞活性的影响。方法采用每份终浓度为10%二甲亚砜、5%人血白蛋白作为细胞冷冻保存液对45份采集的干细胞分别进行冰箱转液氮组和冰箱组冻存,并观察冻存1、2、3年后单个核细胞(MNC)、CD34+细胞计数及细胞回收率,细胞活力。结果冰箱组冻存干细胞2、3年后单个核细     

细胞的简易冻存技术与冻存液的选择

在组织培养和细胞杂交工作中,实验细胞的保种显得十分重要。目前,液氮深低温冻存是公认的保存细胞的唯一途径。我们在工作中,试用简易冷冻技术,应用不同的冻存液对数种细胞株/系进行了冻存、复苏试验,现报告如下。     

脐血造血干细胞短期冻存效果的评价

为了探讨脐血造血干细胞在液氮中短期冻存复苏后的效果，分别将各自为8例冻存6个月、1年、2年的脐血千细胞进行复苏，观察造血干细胞活性。有核细胞(NC)计数采用自动血细胞分析仪测定，CD34^ 细胞采用流式细胞技术测定，用体外造血细胞培养技术分析粒一巨噬细胞集落生成单位(CFU-GM)产率，台盼蓝染色法判断造血细胞存活率。结果表明：脐血造血干细胞在液氮中冻存6个月、1年、2年后解冻，其有核细胞、CD34^ 细胞、细胞活率、CFU-GM产率在3个不同冻存时间的差异无显著性。结论：脐血干细胞于液氯中短期冻存，其干细胞数量和细胞活性没有明显的变化，冻存效果较好。     

CGRP预培养对肝细胞冻存损伤的保护作用及机制

[目的]探讨降钙素基因相关肽(CGRP)预培养对冻存肝细胞的保护作用与机制.[方法]外科切除肝组织分成5组:①对照组(DMEM预培养0 h);②标准预培养组(DMEM预培养8 h);③CGRP三个浓度预培养组(10-6 mol/L,10-7 mol/L,10-8 mol/L;8 h).采用胶原酶灌注法分离肝细胞,经预培养后冻存5周,复苏,台盼蓝检测新鲜分离肝细胞成活率,并体外培养肝细胞48 h,用MTT 法观察肝细胞活力,收集细胞培养上清检测谷白蛋白(Alb),乳酸脱氢酶(LDH)水平,检测肝细胞内活性氧(ROS)及丙二醛(MDA)含量.[结果]预培养组及各 CGRP(10-6,10-7,10-8)处理组细胞成活率(53±5,63±6,61±6,58±7)、Alb合成(4.8±0.6,6.5±0.7,5.8±0.7,4.9±0.6)及MTT活性(0.25±0.07,0.38±0.06,0.31±0.05,0.22±0.03)较对照组(46±7,3.9±0.6;0.11±0.01)显著增加(P＜0.05),且CGRP(10-6,10-7)处理组细胞成活率、Alb合成及MTT活性显著高于预培养组(P＜0.05);预培养组及各CGRP (10-6,10-7,10-8)处理组肝细胞复苏后48h内LDH释放(25±7,15±4,17±5,18±6),ROS释放(107±9.5,62±4.8,70±7.1,80±5.8)及MDA水平(0.87±0.1,0.70±0.06,0.76±0.07,0.80±0.07)较对照组(31±6,120±8.5,1.31±0.04)显著减少(P＜0.05),且与预培养对照组比较,CGRP (10-6,10-7,10-8) 各处理组LDH及ROS释放显著减少(P＜0.05),CGRP (10-6,10-7)处理组MDA释放显著减少(P＜0.05).[结论]CGRP预培养对冻存引起的肝细胞损伤具有保护作用,其机制与抗氧化应激损伤有关.     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存研究

目的:寻求体外培养、冻存、复苏兔骨髓间充质干细胞(mensechymalstemcells,MSCs)的方法,为兔MSCs进一步的实验研究打下基础。方法:取新西兰白兔胫骨穿刺获取骨髓液,以贴壁筛选法分离、纯化、培养和扩增获得MSCs,并行液氮冻存,通过倒置显微镜观察其生物学表现。结果:MSCs为贴壁生长,形态为均匀成纤维细胞样,增殖能力强,传代及冻存后细胞仍然保持其生物学特性。结论:MSCs可采取贴壁筛选法进行较好的纯化和扩增,并可长期保存于液氮中,在一定的条件下可复苏存活。     

复方壳多糖人工皮肤的冻存研究

目的:寻找一种适合于复方壳多糖人工皮肤的保存方法。方法:采用标本沉降式液氮冻存方法,将培养1周的人工皮肤冻存;并在冻存后1,2个月时解冻,继续器官型培养,观察种子细胞的生长情况,并通过组织学检查比较两者在细胞形态方面的差异。结果:解冻后的人工皮肤生长良好,组织学表现与没有冻存过的人工皮肤相比,未见明显不同。结论:液氮冻存没有改变复方壳多糖的生物学特性,提示该保存方法可能会在今后临床应用中发挥作用。     

复方壳多糖人工皮肤的冻存研究

目的：寻找一种适合于复方壳多糖人工皮肤的保存方法。方法：采用标本沉降式液氮冻存方法，将培养1周的人工皮肤冻存；并在冻存后1，2个月时解冻，继续器官型培养，观察种子细胞的生长情况，并通过组织学检查比较两者在细胞形态方面的差异。结果：解冻后的人工皮肤生长良好，组织学表现与没有冻存过的人工皮肤相比，未见明显不同。结论：液氮冻存没有改变复方壳多糖的生物学特性，提示该保存方法可能会在今后临床应用中发挥作用。     

最适苦参碱浓度并用冻存保护剂对L-02人肝细胞系冻存保护的效应

目的:观察不同浓度剂量苦参碱与冻存保护剂联用对L-02人肝细胞系液氮冻存复苏后功能的影响,探索一种适合肝细胞保存的新方法。方法:实验于2005-01/07在南方医科大学中心实验室进行。常规培养的L-02人细胞系用胰酶消化后,将收集的L-02人肝细胞系分别以6种不同的冻存液(10%二甲基亚砜、5%二甲基亚砜 0mg/L苦参碱、5%二甲基亚砜 0.2mg/L苦参碱、5%二甲基亚砜 2mg/L苦参碱、5%二甲基亚砜 6mg/L苦参碱、5%二甲基亚砜 10mg/L苦参碱)在液氮中冷冻保存1个月。1个月后快速复苏L-02人肝细胞系,进行存活率、形态学及功能检测。结果:①复苏后L-02人肝细胞系的活存率5%二甲基亚砜 6mg/L苦参碱组明显高于其他处理组[胰酶刚消化的细胞活率为(96.2±1.4)%,10%二甲基亚砜组(76.6±3.8)%,5%二甲基亚砜组(81.9±2.4)%,5%二甲基亚砜 0.2mg/L苦参碱组(81.6±2.4)%,5%二甲基亚砜 2mg/L苦参碱组(84.7±2.8)%,5%二甲基亚砜 6mg/L苦参碱组(89.6±3.4)%,5%二甲基亚砜 10mg/L苦参碱组(86.9±1.6)%,P>0.05]。②复苏后5%二甲基亚砜 6mg/L苦参碱组肝细胞完整性恢复快,肝细胞生长旺盛,细胞膜完整,胞浆内有丰富颗粒,核仁清楚,与未冻存组肝细胞形态相似。③复苏后L-02人肝细胞系培养上清液尿素含量、上清液白蛋白含量5%二甲基亚砜 6mg/L苦参碱组明显高于其他处理组,与对照组无显著差异。结论:①苦参碱对L-02人肝细胞液氮冻存有保护作用,6mg/L苦参碱是最好的浓度。②苦参碱、二甲基亚砜有协同作用,5%二甲基亚砜 6mg/L苦参碱联合冻存保护体系显著提高L-02人肝细胞系的冻存质量。     

最适苦参碱浓度并用冻存保护剂对L-02人肝细胞系冻存保护的效应

目的：观察不同浓度剂量苦参碱与冻存保护剂联用对L-02人肝细胞系液氮冻存复苏后功能的影响，探索一种适合肝细胞保存的新方法。 方法：实验于2005—01／07在南方医科大学中心实验室进行。常规培养的L—02人细胞系用胰酶消化后，将收集的L-02人肝细胞系分别以6种不同的冻存液（10％二甲基亚砜、5％二甲基亚砜＋0mg／L苦参碱、5％二甲基亚砜＋0．2mg／L苦参碱、5％二甲基亚砜＋2mg／L苦参碱、5％二甲基亚砜＋6mg／L苦参碱、5％二甲基亚砜＋10mg／L苦参碱）在液氮中冷冻保存1个月。1个月后快速复苏L-02人肝细胞系，进行存活率、形态学及功能检测。结果：03复苏后L-02人肝细胞系的活存率5％二甲基亚砜＋6mg／L苦参碱组明显高于其他处理组[胰酶刚消化的细胞活率为（96．2&;#177;1．4）％，10％二甲基亚砜组（76．6&;#177;3．8）％，5％二甲基亚砜组（81．9&;#177;2．4）％，5％二甲基亚砜&;#177;0．2mg／L苦参碱组（81．6&;#177;2．4）％，5％二甲基亚砜＋2mg／L苦参碱组（84．7&;#177;2．8）％，5％二甲基亚砜＋6mg／L苦参碱组（89．6&;#177;3．4）％，5％二甲基亚砜＋10mg／L苦参碱组（86．9&;#177;1．6）％，P〉0．051。②复苏后5％二甲基亚砜＋6mg／L苦参碱组肝细胞完整性恢复快，肝细胞生长旺盛，细胞膜完整，胞浆内有丰富颗粒，核仁清楚，与未冻存组肝细胞形态相似。③复苏后L-02人肝细胞系培养上清液尿素含量、上清液白蛋白含量5％二甲基亚砜＋6mg／L苦参碱组明显高于其他处理组，与对照组无显著差异。 结论：①苦参碱对L-02人肝细胞液氮冻存有保护作用，6mg／L苦参碱是最好的浓度。②苦参碱、二甲基亚砜有协同作用，5％二甲基亚砜＋6mg／L苦参碱联合冻存保护体系显著提高L-02人肝细胞系的冻存质量。     

冻存复苏培养的人鼻中隔软骨细胞生物学特性观察

目的：观察冻存复苏过程对人鼻中隔软骨细胞生物学特性的影响。方法：体外培养人鼻中隔软骨细胞，对冻存1周组、1个月组、3个月组和新鲜制备组的软骨细胞进行倒置相差显微镜动态观察、甲苯胺蓝异染和Ⅱ型胶原的免疫组化染色，并测定”S-Na2SO4掺入量以观察对软骨细胞蛋白多糖合成量的影响，在细胞表型和功能方面进行比较。结果：各组间软骨细胞的生长过程、特殊染色无明显差别，蛋白多糖合成量(^35S-Na2SO4掺入量)测定值为(3.2&;#177;0.24)&;#215;10^3dpm／ug DNA，统计分析其差异无显著性意义(F=0.6，P&;gt;0.05)。各组间细胞存活率差异没有显著性意义(F=2．1．P&;gt;0．05)。结论：冻存复苏的人鼻中隔软骨细胞保持了其生物特性，且冻存时间长短对冻存的软骨细胞存活率无显著影响。     

冻存复苏培养的人鼻中隔软骨细胞生物学特性观察

目的:观察冻存复苏过程对人鼻中隔软骨细胞生物学特性的影响。方法:体外培养人鼻中隔软骨细胞,对冻存1周组、1个月组、3个月组和新鲜制备组的软骨细胞进行倒置相差显微镜动态观察、甲苯胺蓝异染和Ⅱ型胶原的免疫组化染色,并测定35S-Na2SO4掺入量以观察对软骨细胞蛋白多糖合成量的影响,在细胞表型和功能方面进行比较。结果:各组间软骨细胞的生长过程、特殊染色无明显差别,蛋白多糖合成量(35S-Na2SO4掺入量)测定值为(3.2±0.24)×103dpm/μgDNA,统计分析其差异无显著性意义(F=0.6,P>0.05)。各组间细胞存活率差异没有显著性意义(F=2.1,P>0.05)。结论:冻存复苏的人鼻中隔软骨细胞保持了其生物特性,且冻存时间长短对冻存的软骨细胞存活率无显著影响。     

脐血造血细胞的分离冻存

目的 探讨不同条件对脐血造血细胞回收的影响。方法 运用6％羟乙基淀粉(HES)沉降法分离脐血,以程序降温法冻存脐 血造血细胞。结果 HES两次离心法分离脐血,造血细胞回收率高,活力好,费时短。脐血分离前在4℃或室温下可放置24小时而不影响细胞活力。HES终浓度以1％～2％为宜。以0．9％生理盐水 DMSO做保护剂对脐血造血细胞损伤小。复苏后脐血造血细胞可放置60分钟,洗涤会造成约10％的细胞损失,但能延长放置时间达120分钟以上。结论 HES两次离心法分离脐血简便实用。     

温度波动对血小板冻存质量的影响

血小板是一种重要的凝血因子 ,常用于抢救外伤大出血或因血小板减少导致出血的患者。而低温保存的血小板具有良好的止血效果和升高血小板的功效 ,副作用少 ,并具有安全、快捷、疗效好的特点。低温保存血小板既解决了临床输注血小板的需要 ,也为血小板保存开辟了新途径 [1 ] 。本站自 1 999年 7月开始应用血小板低温保存技术 ,取得了满意的临床疗效 [2 ] 。通过对 82 5袋血小板冻存过程的观察 ,发现温度波动是影响血小板冻存质量的重要因素 ,现报告如下。材料与方法1　供者的选择及血小板采集　按照献血者健康检查标准 ,保证 HBs Ag、抗 -H…     

传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果的比较

目的:比较传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果,建立一种适合于人胎肝细胞冷冻保存的方法。方法:实验于2006-07/11在广州医学院进行。①人胎肝组织取自中期终止妊娠胎儿(20周,经胎儿亲属知情同意及医院伦理委员会批准)。冷冻保护液包括A液(DMEM培养液含1.5mol/L乙二醇 体积分数为0.2胎牛血清);B液(A液 0.1mol/L蔗糖)两部分。②传统冻存法:用0.025%Ⅰ型胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞。胎肝细胞在A液、B液中分别渗透平衡20min后,在冷冻保护B液中经液氮蒸汽冷平衡5min后迅速入液氮冻存,1周后复苏培养观察。③改良冻存法:胎肝组织在A液、B液中分别渗透平衡20min后,在冷冻保护液B液中经液氮蒸汽冷平衡5min后迅速入液氮冻存,1周后复苏,入DMEM培养液37℃孵育1h,胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞培养观察。④新鲜分离的胎肝细胞做为对照组。⑤复苏后分离所得胎肝细胞用锥虫兰染色评估细胞活率,并记录贴壁时间,观察集落生长情况。结果:①锥虫兰染色结果显示传统冻存法复温后的胎肝细胞活率为(73.8±2.2)%,明显低于新鲜分离的胎肝细胞活率(89.2±3.6)%及改良冻存法所得胎肝细胞活率(82.5±4.2)%(P<0.01)。②贴壁情况观察发现新鲜胎肝细胞与改良冻存法胎肝细胞于培养24h开始贴壁,而传统冻存法胎肝细胞贴壁时间滞后48h。③新鲜胎肝细胞及改良冻存法胎肝细胞于第3天出现生长集落(细胞数>10为一个集落),传统冻存法胎肝细胞在第5天出现生长集落,集落的数量低于改良冻存法及对照组(P<0.01)。结论:改良冻存法可避免冻存前损伤,提高细胞对冷冻的耐受性和冻存复温后细胞的活率。     

冻存人脐血间充质干细胞向类肝细胞的诱导分化

目的分离培养人脐血间充质干细胞,观察其冻存复苏后向肝细胞定向分化的能力.方法实验于2004-01/2006-01在四川大学华西医院感染性疾病中心生物治疗国家重点实验室进行.采用密度梯度离心与直接贴壁相结合的方法,1×107 L-1和1×108 L-1两种接种密度进行人脐带血间充质干细胞的分离,观察细胞生长及检测其表面抗原.将第6代的人脐带血间充质干细胞采用梯度冷冻技术冻存6个月,复苏后培养至第8代时,加入肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-4联合诱导28 d.将第8代人脐带血间充质干细胞爬片与诱导28 d后的类肝细胞爬片共培养,第8代人脐带血间充质干细胞爬片与未诱导培养28 d的人脐带血间充质干细胞爬片共培养作为阴性对照.检测加入肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子4后不同时间点及共培养28 d后的人脐带血间充质干细胞中CK8&18、白蛋白和糖原的表达.结果①密度梯度离心收获的单个核细胞培养传代后,能获得均-贴壁的间充质干细胞,第5代细胞中,CD44阳性的细胞达97.9%.②人脐血间充质干细胞冻存复苏后,活细胞约为70%,复苏后接种密度为1×107 L-1的生长状态优于1×108 L-1.③添加肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子4后,可以在细胞内检测到CK8&18、白蛋白及糖原的表达.④与类肝细胞共培养28 d后,人脐血间充质干细胞中小部分细胞中同时表达CK8&18和白蛋白,并有糖原的表达.结论人脐血间充质干细胞可采用密度梯度离心法结合直接贴壁法分离获得,并可冷冻保存;复苏后在肝细胞生长因和成纤维细胞生长因子4的联合诱导下,能定向分化为表达CK8&18,并合成白蛋白和糖原的类肝细胞,类肝细胞可能具有诱导人脐血间充质干细胞向肝系细胞定向分化的作用.     

冻存血浆中microRNAs稳定性研究

目的探讨不同冻存时间血浆microRNAs表达水平及血浆总RNA提取并冻存2周后microRNAs表达水平的稳定性。方法 -80℃冻存2a,1a及6个月和新鲜抽取的健康人血浆样本各10份,提取血浆总RNA,应用基于TaqMan探针的MicroRNA定量检测法检测血浆样本中4种microRNAs表达水平。结果冻存6个月人血浆样本中U6与新鲜血浆标本比较差异有统计学意义(P<0.05),冻存2a,1a及6个月人血浆样本中4种microRNAs表达水平与新鲜血浆标本比较差异无统计学意义(P>0.05);新鲜血浆RNA提取并冻存2周后2个目的microRNAs相对表达水平与提取后即刻比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 -80℃下冻存2a内血浆中microRNAs稳定存在,血浆总RNA提取并冻存2周后仍可用于microRNAs的定量检测。     

人牙龈成纤维细胞原代培养及冻存和复苏

背景：牙龈成纤维细胞是牙龈固有结缔组织层中主要的细胞,在许多生理和病理过程中起着重要作用。目的：对人牙龈成纤维细胞进行原代培养、鉴定、冻存及复苏。方法：采用组织块培养法培养人牙龈成纤维细胞,并进行形态学和免疫学鉴定。对人牙龈成纤维细胞进行冻存与复苏,倒置显微镜下观察细胞形态变化。结果与结论：人牙龈成纤维细胞原代培养成功率为86.7%,细胞呈梭形或纺锤形。免疫组织化学鉴定抗波性蛋白抗体染色阳性,抗角蛋白抗体染色阴性,为中胚层来源的成纤维细胞。牙龈成纤维细胞冻存与复苏成功,细胞经2次传代后生物学性状与原代相似。提示采用组织块培养法培养原代人牙龈成纤维细胞及冻存与复苏方法可行。     

人羊膜细胞WISH株液氮冻存及复苏培养

<正> 将离体细胞在实验室中进行长期培养的组织细胞培养技术,已广泛应用于医学科学的研究。人羊膜细胞WISH株(以下简称Wish细胞)是目前用于测定人干扰素抗病毒活性的常用检测细胞株,其培养的好坏直接关系干扰素的研究、生产和测定,为此,笔者将Wish细胞在液氮(-196℃)中冻存及复苏培养的一些经验简介如下。