程序性细胞死亡分子5在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达与意义

目的:程序性细胞死亡分子5作为一个重要的凋亡正调控分子,在许多疾病的发生发展过程中起着重要的作用,但有关其在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的作用研究甚少.实验拟验证程序性细胞死亡分子5在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达水平及细胞定位分布,探讨程序性细胞死亡分子5在类风湿关节炎发病中的可能作用.方法:实验于2005-06/2006-10在北京大学人民医院关节病诊疗研究中心完成.①实验材料:滑膜均取材于北京大学人民医院关节病诊疗研究中心行人工全膝关节表面置换术的类风湿关节炎或骨关节炎患者.所有患者均参照美国风湿病学会标准确诊.术前获得患者知情同意,并经北京大学人民医院伦理委员会批准.②实验方法:原代培养并传代分离获得型别均一的成纤维样滑膜细胞,提取细胞RNA和蛋白.③实验评估:实时定量聚合酶链反应及蛋白免疫印迹检测类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞和骨关节炎成纤维样滑膜细胞中程序性细胞死亡分子5 mRNA和蛋白的表达水平:制备细胞爬片采用免疫组织化学技术分析程序性细胞死亡分子5在成纤维样滑膜细胞中的定位分布特征.结果:①相对于骨关节炎,分离培养的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中程序性细胞死亡分子5在mRNA和蛋白水平上表达下调.②类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中程序性细胞死亡分子5的下调与抗凋亡分子Bcl-2的上调是协调一致的.③程序性细胞死亡分子5蛋白主要定位于体外培养的成纤维样滑膜细胞的胞浆中.结论:程序性细胞死亡分子5可能参与类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞对凋亡刺激信号所产生的凋亡抑制过程,在类风湿关节炎的病理演变过程中可能具有抑制凋亡的作用.     

透明质酸影响人膝骨关节炎滑膜成纤维样细胞骨桥蛋白和CD44的表达☆

背景:在骨关节炎病程中,透明质酸水平的改变可以使一系列细胞因子和酶表达水平改变,但是滑膜组织中骨桥蛋白、CD44的高表达是否与透明质酸水平改变相关目前尚不清楚. 目的:通过透明质酸干预体外培养的人膝骨关节炎滑膜成纤维样细胞,观察透明质酸对骨关节炎滑膜成纤维样细胞骨桥蛋白和CD44表达的影响. 方法:选取接受膝关节镜手术和膝关节置换的原发性膝关节骨关节炎患者滑膜标本10例,进行体外培养获取纯化的滑膜成纤维细胞,取第4~6代滑膜成纤维细胞,分为3组:空白对照组不进行任何干预;透明质酸组用100 mg/L透明质酸干预24 h;透明质酸酶组用300 mg/L透明质酸酶干预24 h. 结果与结论:与空白对照组相比,透明质酸组滑膜成纤维细胞骨桥蛋白mRNA表达水平上升(P <0.05),透明质酸酶组滑膜成纤维细胞骨桥蛋白mRNA表达水平下降(P <0.05).透明质酸组和透明质酸酶组之间膜成纤维细胞骨桥蛋白mRNA表达水平差异有显著性意义(P <0.05).空白对照组、透明质酸组和透明质酸酶组滑膜成纤维细胞CD44 mRNA表达水平差异均无显著性意义(P >0.05).提示透明质酸可以使骨关节炎滑膜成纤维细胞骨桥蛋白mRNA表达增高,对CD44 mRNA表达没有影响.     

不同浓度骨碎补提取液对体外培养人牙髓细胞增殖及超微结构的影响

背景:体外培养人牙髓细胞难度很大,国内外已有生长因子对体外培养牙髓细胞增殖分化作用的研究,而中药骨碎补对体外培养牙髓细胞的影响,经作者检索未见报道.目的:观察不同浓度骨碎补提取液对体外培养的人牙髓细胞增殖分化的影响.设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-03/2007-05在河北医科大学第四医院科研中心完成.材料:人牙髓细胞组织选自河北医科大学第四医院口腔科要求正畸治疗需拔除的健康阻生智齿着,取得所有供者对标本采集的知情同意.产地云南的骨碎补购自河北医科大学第四医院中药房.方法:采用组织块法体外培养人牙髓细胞.水提醇沉法提取骨碎补有效成分,以每1 mL药液含生药1 g加入积体分数为0.02的胎牛血清培养液,稀释成质量浓度为10,50,100,500,1 000 mg/L.分别以此培养液作用于体外培养的人牙髓细胞,以不加骨碎补提取液培养的细胞做对照.主要观察指标:①人牙髓细胞原代培养和来源鉴定.②四甲基偶氮唑盐法检测各质量浓度组骨碎补对人牙髓细胞增殖的作用.③免疫组织化学法观察各浓度组骨碎补对人牙髓细胞纤维连接蛋白的表达.④扫描电镜和透射电镜下观察骨碎补对人牙髓细胞超微结构的影响.结果:原代培养的人牙髓细胞呈梭形或多角形.各浓度骨碎补均对体外培养的人牙髓细胞有促增殖作用,其中以100 mg/L浓度组促增殖作用最明显,可诱导牙髓细胞合成、分泌纤维连接蛋白.电镜下实验组人牙髓细胞表面枝状嵴丰富,细胞周围可见细胞外基质,细胞浆内有丰富粗面内质网和游离的核糖体,核内常染色质均匀分散,异染色质少.结论:含1 00 mg/L骨碎补培养液对体外培养的人牙髓细胞有明显的促增殖作用.     

中药双黄补对体外培养人牙周膜细胞增殖活性的影响

背景:目前的研究大多为单味中药或单一中药成分对体外培养人牙周膜细胞的影响,而中药组方提取液对体外培养细胞影响的研究较少.目的:观察中药双黄补对体外培养的人牙周膜细胞增殖活性的影响.设计、时间及地点:对比观察实验,于2008-11/2009-02在河北医科大学第四医院科研中心完成.材料:人牙周膜细胞组织选自河北医科大学第四医院口腔科要求手术拔除的埋伏多生牙者.黄连、黄芩、骨碎补均购自河北医科大学第四医院中药房.方法:采用组织块法体外培养人牙周膜细胞.水提醇沉法制各双黄补提取液.以每1 Ml药液含生药1 g加入体积分数20%的胎牛血清培养液,稀释成质量浓度为10,25,50,100,150,200,250,500,750,1 000 mg/L,分别作用于体外培养的人牙周膜细胞,以不加双黄补提取液的培养细胞为对照.主要观察指标:采用四甲基偶氮唑蓝法测定培养细胞增殖活性的变化,应用流式细胞术检测100 mg/L的双黄补提取液对牙周膜细胞周期的变化和对成纤维细胞生长因子18水平的影响.结果:双黄补对人牙周膜细胞的增殖活性的影响存在质量浓度和时间效应,各质量浓度双黄补均能促进体外培养人牙周膜细胞的增殖活性,其中以100 mg/L质量浓度促增殖活性作用最明显(P<0.01),相同质量浓度不同作用时间对细胞促增殖活性作用也不同,以48 h作用最明显(P<0.05).与对照组相比,100 mg/L的双黄补促进牙周膜细胞成纤维细胞生长因子18水平增高,S期和G2M期细胞数目增多,在48 h最明显.结论:中药双黄补可增强人牙周膜细胞的增殖活性,具有明显的浓度效应和时间效应.     

昆明山海棠与类风湿关节炎滑膜细胞体外增殖和凋亡

背景:昆明山海棠应用于类风湿关节炎治疗已被证实有确切疗效,但对于其作用机制目前尚不明确.目的:验证昆明山海棠对类风湿关节炎滑膜巨噬样细胞和成纤维样细胞体外增殖活性及对其凋亡影响,分析其剂量效应关系.设计、时间及地点:细胞学体外分组对照实验,于2003-08/2007-06在汕头大学医学院第一附属医院中心实验室和南方医科大学细胞生物实验室完成.材料:类风湿关节炎6例及正常滑膜组织3例,来源于汕头大学医学院第一附属医院骨科和南方医院脊柱骨病科患者术中获得的标本.昆明山海棠制备水提取液,含生药0.667 g/mL..方法:收集获得的滑膜组织,通过消化法获得原代类风湿关节炎及正常滑膜细胞,第2-4代细胞用免疫磁珠法筛选滑膜CD68~+细胞和CD68~-细胞,在接种72 h后加入实验各组分别在培养液中加入最终体积分数分别为5,10,20 mL/L的昆明山海棠药液处理24 h和48 h.同时设立不加药物的阴性对照及不加细胞空白对照.主要观察指标:相差倒置显微镜、扫描电镜观察细胞形态,用MTT法测定细胞增殖情况,流式细胞仪检测和TUNEL.法检测细胞凋亡.结果:分选后滑膜CD68~-细胞为成纤维样细胞,滑膜CD68~+细胞为滑膜巨噬样细胞.施予干预因素后,各组有部分细胞体积缩小,胞膜皱缩,微绒毛和伪足减少或消失,部分细胞可见团块脱落形成凋亡小体.当昆明山海棠体积分数为2%时,各组细胞均有不同程度抑制,显示昆明山海棠有细胞毒性,对类风湿关节炎滑膜CD68~-、CD68~+细胞的抑制效应和诱导细胞效应强于同种正常滑膜细胞(P<0.01).在药物体积分数为1%时,对类风湿关节炎滑膜细胞有明显抑制效应(P<0.01).昆明山海棠对诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡作用有明显时间依赖性和剂量依赖性,且凋亡率与相同条件下的抑制率表现出较好的直线相关关系(r=0.497,P<0.01).结论:昆明山海棠对于类风湿关节炎滑膜巨噬样细胞和滑膜成纤维样细胞有诱导凋亡和明显抑制异常增殖作用.在一定浓度下,昆明山海棠对于正常滑膜细胞毒性较小且对类风湿关节炎滑膜细胞的有较明显抑制异常增殖和诱导细胞凋亡的效应.     

丹参体外抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的研究

目的 检测丹参体外对类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLSs）增殖的影响。方法 用不同浓度丹参处理RA FLSs 24 h后,采用MTT法检测RA FLSs的增殖水平;用流式细胞仪检测其凋亡百分率。结果 加入不同浓度丹参处理RA FLSs 24 h后,细胞增殖受到抑制（P＜0.05）,并在一定丹参浓度范围内（0～1.56 mg/ml）呈现剂量相关性,当丹参浓度达到1.56 mg/ml时,细胞增殖抑制达到平台期。对照组与不同浓度丹参处理组凋亡细胞百分率比较,在丹参浓度为0.195 mg/ml时差异不明显,当丹参浓度为0.39 mg/ml时差异有显著统计学意义（P＜0.05）。结论 丹参在体外抑制RA FLSs增殖,可诱导细胞凋亡。     

透明质酸影响人膝骨关节炎滑膜成纤维样细胞骨桥蛋白和CD44的表达

背景：在骨关节炎病程中,透明质酸水平的改变可以使一系列细胞因子和酶表达水平改变,但是滑膜组织中骨桥蛋白、CD44的高表达是否与透明质酸水平改变相关目前尚不清楚。目的：通过透明质酸干预体外培养的人膝骨关节炎滑膜成纤维样细胞,观察透明质酸对骨关节炎滑膜成纤维样细胞骨桥蛋白和CD44表达的影响。方法：选取接受膝关节镜手术和膝关节置换的原发性膝关节骨关节炎患者滑膜标本10例,进行体外培养获取纯化的滑膜成纤维细胞,取第4~6代滑膜成纤维细胞,分为3组：空白对照组不进行任何干预;透明质酸组用100mg/L透明质酸干预24h;透明质酸酶组用300mg/L透明质酸酶干预24h。结果与结论：与空白对照组相比,透明质酸组滑膜成纤维细胞骨桥蛋白mRNA表达水平上升（P〈0.05）,透明质酸酶组滑膜成纤维细胞骨桥蛋白mRNA表达水平下降（P〈0.05）。透明质酸组和透明质酸酶组之间膜成纤维细胞骨桥蛋白mRNA表达水平差异有显著性意义（P〈0.05）。空白对照组、透明质酸组和透明质酸酶组滑膜成纤维细胞CD44mRNA表达水平差异均无显著性意义（P〉0.05）。提示透明质酸可以使骨关节炎滑膜成纤维细胞骨桥蛋白mRNA表达增高,对CD44mRNA表达没有影响。     

改进的Coca＇s液提取户尘螨过敏原蛋白的效果探究

目的 采用改进的Coca＇8液提取户尘螨螨体中的蛋白,提高提取液的蛋白浓度和过敏原蛋白的效价.方法 （1）细胞破碎：取样品于研钵内,液氮反复冻融4次,每次间隔10min,在研钵内反复研磨冻融后的样品.（2）蛋白提取：在离心管中加入10mlCoca＇s液,4℃匀速搅拌4h后置于4℃冰箱过夜.（3）离心：4℃,5000×g离心1h,取上清液备用.（4）测提取蛋白的浓度：Bradford Reagent法测其提取蛋白的浓度.（5）SDS-PAGE电泳：参照Tricine-SDS-PAGE配制10％分离胶和4％浓缩胶,上样10μL.（6）采用酶联免疫吸附实验（ELISA）进行本研究获得的提取液与进口户尘螨过敏原蛋白产品的功能性比较.结果 本研究中户尘螨过敏原蛋白提取液的蛋白浓度为3.0 mg/ml,远高于美国ALLERMED公司产品的0.35mg,/ml;且电泳图显示包含分子量为25kDa、14kDa的户尘螨主要过敏原蛋白Der p 1、Der p 2条带,蛋白浓度也高于美国ALLERMED公司产品相应的条带;功能性实验中也表明本研究中户尘螨过敏原蛋白提取液的免疫效价也显著高于美国ALLERMED公司产品.结论 可以用本研究的方法来大量提取户尘螨过敏原蛋白,提取液可替代进口产品,用作户尘螨过敏原检测试剂的生产原料或用于户尘螨过敏原皮试、点刺及脱敏治疗等,降低这些产品的生产成本,进而降低国内户尘螨过敏的诊疗费用.     

瑞香狼毒提取液对大鼠肺成纤维细胞增殖的抑制与其细胞毒性作用

目的：观察大鼠原代培养的肺成纤维细胞给予不同浓度的瑞香狼毒提取液后,肺成纤维细胞增殖与剂量增加的效应及其对细胞产生的毒性作用.方法：实验于2003-12/2004-03在军事医学科学院附属医院药剂科临床药理室完成.选取纯系Wistar雌性大白鼠10只,瑞香狼毒由中国人民解放军第307医院药剂科中药房提供.经过传代5代以后的肺成纤维细胞大部分呈梭形,可以用于实验,3个实验各自独立.[1]肺成纤维细胞增殖检测与分组：大鼠肺成纤维细胞在正规生长培养基中传代培养,48 h后处于对数生长期,可进行增殖试验.随机分为1个空白对照组和6个实验组.空白对照组加入空白DMEM,实验组分别加入浓度为500,250,125,62.5,31.25,15.625 mg/L的瑞香狼毒提取液.应用噻唑蓝比色法观察瑞香狼毒提取液对细胞增殖的影响.[2]乳酸脱氢酶活性测定与分组：随机分为1个空白对照组和5个实验组.空白对照组加入空白DMEM,实验组分别加入浓度为125,62.5,31.25,15.625,7.813 mg/L的瑞香狼毒提取液.全自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶活性值来观察其细胞毒性.[3]细胞形态学观察与分组：随机分为1个空白对照组和6个实验组.空白对照组加入空白DMEM,实验组分别加入浓度为500,250,125,62.5,31.25,15.625 mg/L的瑞香狼毒提取液,显微镜下观察细胞形态学变化.结果：实验纳入10只大鼠无脱落.[1]瑞香狼毒提取液对肺成纤维细胞增殖的影响：浓度为500,250,125 mg/L的瑞香狼毒提取液组吸光度值明显低于空白对照组（0.104&;#177;0.003,0.097&;#177;0.003,0.172&;#177;0.029,0.285&;#177;0.011,P＜0.01）;浓度为62.5,31.25,15.625mg/L的瑞香狼毒提取液组吸光度值亦低于空白对照组（0.217&;#177;0.030,0.216&;#177;0.010,0.199&;#177;0.005,0.285&;#177;0.011,P＜0.05）.[2]瑞香狼毒提取液对细胞的毒性作用：浓度为15.625,7.813 mg/L的瑞香狼毒提取液组乳酸脱氢酶吸光度值与空白对照组比较,均无显著性差异（28.91&;#177;0.88,26.27&;#177;0.31,25.91&;#177;0.39,P＞0.05）,说明瑞香狼毒提取液在浓度为15.625,7.813 mg/L范围内对细胞无毒性作用;而浓度为125,62.5,31.25 mg/L的瑞香狼毒提取液其乳酸脱氢酶吸光度值均显著高于空白对照组（P＜0.05）,且随着浓度的增加,毒性显著增强.[3]瑞香狼毒提取液对肺成纤维细胞形态学的影响：细胞传代至第5代以后,所得细胞已经都是梭形呈放射状的成纤维细胞.用药前伸展良好,折光性较弱,有方向性;而加入瑞香狼毒提取液后肺成纤维细胞数目显著减少,形状不规则,突起变短,细胞排列混乱,细胞内代谢产物增多.结论：瑞香狼毒提取液对大鼠原代培养的肺成纤维细胞生长增殖有较强的抑制作用,随着给药剂量的增加,对细胞增殖抑制作用增强,呈剂量依赖性抑制.同时在高浓度范围内瑞香狼毒提取液对细胞具有一定的毒性作用.     

丹参对类风湿关节炎患者滑膜细胞肿瘤坏死因子α表达的影响

目的探讨丹参对类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达的影响。方法抽取RA患者关节液进行体外培养分离滑膜细胞,在细胞培养至3～5代时,给予丹参处理,在处理48h后收集培养上清,ELISA检测TNF-α的表达水平。结果当丹参浓度依次以0,6.25,12.5,25,50,100mg/L递增时,TNF-α浓度分别为（161.68±7.55）pg/ml、（161.68±8.79）pg/ml、（163.49±25.68）pg/ml、（137.33±35.98）pg/ml、（81.32±22.84）pg/ml和（86.89±28.48）pg/ml。丹参浓度为50mg/L和100mg/L时,与加入丹参前比较差异有统计学意义（P值分别为0.001和0.004）。结论丹参可以抑制RA滑膜细胞TNF-α的分泌,并且这一抑制作用可能是其用于RA治疗的理论基础。