影响启动子活性测定的关键影响因素

目的探讨载体、质粒转染剂量、启动子长度、细胞系以及检测仪器等因素对启动子分析实验的影响。方法采用化学发光法测定荧光素酶,EGFP荧光强度采用流式细胞仪。以上检测每组样品均设三复孔,并重复两次,所得结果进行t检验。结果选择不同的报告基因、载体、质粒转染剂量、启动子长度和细胞系得到不同的结果。结论载体、质粒转染剂量、启动子长度、细胞系的选择会对启动子分析的结果造成很大的影响,因此,在进行启动子分析前,应综合考虑上述因素,以达到更好的实验效果。     

人ID4基因表达调控启动子及其亚克隆荧光素酶报道重组子的构建

本研究旨在克隆ID4基因启动子及上游调控序列,并构建一系列启动子亚克隆-pGL3Basic荧光素酶报道重组子,以探讨ID4基因表达调控机制。方法与结果:以ID4基因cDNA全长作为探针,在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列;利用TESS和Genomax等在线启动子分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析,据此设计PCR引物,采用分段扩增法,获得了2条长度分别为1 829bp和784bp的产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之先后应用KpnI/NheI、KpnI/EcoRI对获得的2个pGEMT重组载体及pGL3Basic荧光素酶报道重组载体进行双酶切,用T4DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,成功构建了人ID4基因启动子-pGL3Basic荧光素酶报道重组子;经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定,获得了与GenBank相应序列一致、长度为2 459bp的目的片段;以此片段为模板,相隔400bp左右设计了5对3′端平齐、5′端不同的PCR引物,进行半巢式PCR扩增,获得5条长度分别为2 112bp、1 703bp、1 290bp、784bp和496bp片段,回收纯化后分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之用KpnI/NheI对获得的5个pGEMT重组载体及pGL3Basic荧光素酶报道载体双酶切,T4DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定。结论:成功克隆了长度为2.5kb的ID4基因启动子及上游表达调控序列,构建了一系列ID4启动子亚克隆-pGL3-Basic荧光素酶报道重组子。     

LCN2基因启动子区荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 为进一步研究LCN2(Lipocalin 2)基因在急性肾损伤中的作用,克隆LCN2的编码序列,构建含LCN2基因的荧光素酶报告基因载体,并在肾小管上皮细胞系HK-2 中表达.方法 以HK-2细胞系提取的RNA为模板进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用HindⅢ和SmaI双酶切后克隆到双荧光素酶报告基因载体PGL3-Basic中,用非脂质体法将构建质粒PGL3-Basic /LCN2导入HK-2 中,氨苄青霉素选择培养,经双荧光素酶鉴定其表达.结果 PCR和测序结果表明扩增的LCN2启动子序列正确,酶切检测证实重组荧光素酶报告基因载体构建成功.转染PGL3-Basic/LCN2 质粒的HK-2细胞荧光素酶活性比转染空载体的明显增加(P<0.000 1).结论 成功克隆了LCN2的编码序列,构建了其荧光素酶报告基因载体PGL3-Basic/LCN2,有助于进一步研究LCN2基因在急性肾损伤中的作用机制.     

慢病毒表达双报告基因载体系统的构建及病毒制备

本研究旨在构建萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,FLUC)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)双基因表达的慢病毒载体,并转染特定细胞系(HeLa),观察双基因的表达。采用PCR技术分别扩增FLUC和RFP报告基因,再将报告基因连接到慢病毒表达载体pLenti-Bi-cistronic中,获得具有双报告基因的慢病毒重组质粒pLenti-FLUC-RFP。然后,用脂质体将该慢病毒重组质粒转染293T细胞,收集纯化慢病毒颗粒。最后,测定病毒滴度,并用所获慢病毒感染HeLa细胞,采用荧光显微镜和荧光素酶报告基因检测试剂盒检测RFP和FLUC的表达。结果表明,酶切和测序证明RFP和FLUC基因成功连入目的载体,所构建的pLenti-FLUC-RFP慢病毒重组质粒序列符合预期。经纯化获得的慢病毒滴度为1×107TU/ml。将pLenti-FLUC-RFP转染HeLa细胞系后,在荧光显微镜下可见大量细胞表达RFP,荧光发光检测仪也检测到转染细胞具有较高的荧光素酶活性。结论:本研究成功构建了具有双报告基因的慢病毒重组质粒pLenti-Ⅲ-FLUC-RFP,经纯化获得了高滴度的慢病毒颗粒,该病毒颗粒具有很好的感染活性,为研究间充质干细胞在体内的动态分布奠定了基础。     

人PNPLA3基因启动子转录调控的初步分析

目的构建人PNPLA3基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因裁体,在LO2细胞中比较不同长度启动子片段的活性,为研究PNPLA3基因的转录调控机制提供初步依据。方法对PNPLA3基因5’侧翼区约1 400个碱基进行生物信息学分析,预测其转录调控区域;利用PCR及酶切方法,以人外周血中全基因组DNA为模版扩增不同长度的PNPLA3基因上游启动子区序列,分别构建荧光素酶基因报告载体。瞬时转染LO2细胞,利用双荧光素酶报告基因分析系统检测各启动子的转录活性。利用在线分析软件预测PNPLA3基因主要转录调控区的潜在转录因子结合位点。结果成功构建5段不同长度的PNPLA3基因上游启动子区的报告载体;在LO2细胞内启动子活性随片段长度变化,表现为当PNPLA3启动子片段从-1015截短到-647,从-647截短至-553,从-553截短至-333时活性变化不大,而从-333截短至-8时活性显著下降(P<0.05);Match分析显示-333～-8片段具有多个转录因子结合位点。结论初步判断-333～-8区是PNPLA3基因的主要转录调控区。     

kir3dl1启动子表达调控载体的构建及其在K562细胞中的活性

为了分析kir3dl1基因核心启动子区域的功能并明确其表达调控机制，构建了kir3dl1基因启动子．荧光素酶报告载体，分析其在K562细胞中的活性。采用PCR方法从含有kit3dl1基因转录起始位点5’侧翼区的质粒中扩增kir3dl1基因核心启动子序列，插入经Bg1II和NcoI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-Basic；采用阳离子脂质体SuperFect包裹荧光素酶报告重组子转染K562细胞，应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性；采用MTT法检测脂质体-DNA复合物对细胞存活率的影响。结果表明：成功构建了含有254bp的kir3dl1基因核心启动子序列的荧光素酶报告重组子3DL1-luc254并通过酶切及基因测序方法的鉴定；荧光素酶报告重组子在K562细胞中的荧光素酶活性明显高于阴性对照，且荧光素酶活性、相对活性持续3天无明显衰减。转染了3DLl-luc254报告质粒的K562细胞存活率在76％-92％之间。结论：成功构建了kir3dl1基因启动子-荧光素酶报告载体，本研究采用的转染系统能够有效地在K562细胞中进行基因转染，kir3dl1基因核心启动子在K562细胞中具有较高活性。     

小鼠adam10基因启动子克隆和双荧光素酶报告基因系统构建及鉴定

本研究旨在克隆小鼠adam10基因启动子,构建以adam10基因启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统并分析其活性,为研究adam10基因转录调控提供有效工具。以BALB/c小鼠脑组织为模板,采用PCR方法克隆小鼠adam10基因启动子序列至pCR-Blunt载体,酶切后连接至荧光素酶报告质粒pGL4.10启动子区域,构建重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10,采用阳离子脂质体法与阳性对照质粒pGL4.74共转染真核细胞293FT,以离子霉素刺激为刺激组、DMSO为未加干预组,同时以不含启动子的pGL4.10与阳性对照质粒pGL4.74共转染组为阴性对照组,化学发光仪检测荧光强度及比例。结果表明,酶切及测序验证克隆的adam10启动子序列正确且无突变,构建的重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10与阳性对照质粒pGL4.74载体成功共转染293FT细胞,pGL4.10-adam10转染细胞后具有转录活性。离子霉素刺激组活性明显高于DMSO组,荧光比值约为DMSO组2倍(P<0.05),阴性对照组不具备转录活性。结论:成功克隆了adam10启动子并构建了重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10,离子霉素可增强adam10基因启动子转录活性。     

LRP16基因启动子活性分析

本研究的目的在于分析LRP16基因不同启动子区域的活性，为深入研究LRP16基因的表达调控机制奠定基础。在NCBI的人类基因组数据库中截取并下载LRP16基因转录起始位点5侧翼区2．7kb的基因组序列，设计PCR引物，从健康外周血单个核细胞中克隆和亚克隆了LRP16基因的启动子分子。对各个长度相差400bp左右的亚克隆启动子片段调控荧光素酶表达的作用强度进行比较分析。结果获得了与GeneBank序列一致、长度为2．6kb的LRP16基因启动子DNA序列，其主要调控序列在LRP16基因转录起始位点5侧翼区的-200至-600bp。结论：LRP16基因启动子是一个典型的Ⅱ型启动子，其启动子活性在-200至-600bp区域最强。     

FLT3基因3＇-非翻译区-荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

为分析FMS样酪氨酸激酶3（FMS—like tyrosine kinase3,FLT3）基因3i非翻译区（3’untranslated region,3’-UTR）可能的微小RNA（miRNA）调控位点,构建FLT3基因3’-UTR-荧光素酶报告载体,与miRNA共转染293T细胞,分析miRNA对其调控作用。采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增FLT3基因3,-UTR区序列,插入经PstI和EcoRI双酶切的经过改造的荧光素酶报告载体pGL3-control（pGL3-control—ITI）;通过Target Scan5．1软件预测可能与FLT3基因3’-UTR作用的miRNA;采用FuGENEHD转染试剂包裹荧光素酶报告重组子和miRNA真核表达载体共转染293T细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果表明,成功构建了含有804bp的FLT3基因3’-UTR序列的荧光素酶报告重组子,通过酶切和基因测序的方法鉴定正确;miRNA靶位点预测显示,FLT3基因3’-UTR可能是miRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-16、miRNA-195、miRNA-424、miRNA-497的作用靶点;与对照组相比,miRNA-15a、15b、195可使荧光素酶报告重组子的荧光素酶活性降低20％左右。结论：成功构建了FLT3基因3’-UTR-荧光素酶报告载体,而miRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-195可抑制其荧光素酶活性。     

X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的克隆及其转录活性检测

目的：X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1能够诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3凋亡，其具体转录调控机制尚不十分清楚。克隆X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子，检测干扰素对其转录活性的影响。 方法：实验于2006—05／2007—07在香港大学分子生物学研究所和洛阳华美生物工程公司完成。①材料：结肠癌细胞株Lovo和Swl116来自美国American Type Culture Col-lection。pGL3 basic载体，内参照pRL-CMV载体和Dual-luciferase reporter Kit，T4DNA连接酶，限制性内切酶KpnI和XhoI均由Promega公司提供。②实验方法：采用PCR法扩增获得X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因的启动子片段，将之定向克隆到含荧光素酶报告基因的pGL3 basic载体上，获得的报告基因质粒命名为pLUC107，瞬时转染Lovo和Swl116细胞株，经α-干扰素刺激处理，启动子转录活性用荧光素酶相对表达活性表示。 结果：①PCR扩增结果：在预期的271bp处出现清晰DNA片段，无非特异扩增现象，证明其为X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的PCR扩增产物。②重组质粒的酶切鉴定及测序：重组质粒pLUC107双酶切后可见约为271bp的DNA片段，与理论值相一致。DNA测序证实含X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功。③干扰素对X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子转录活性的影响：与未经α-干扰素处理的含pLUC107的Lovo和Swl116细胞的荧光素酶相对活性值比较，经α-干扰素处理后两种细胞的荧光素酶相对活性值均明显升高（P均〈0．05），且升高幅度与α-干扰紊呈剂量依赖性。 结论：成功克隆出X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子片段，并利用荧光素酶报告基因证实α-干扰素可上调其转录活性。     

报告基因系统的研究进展

综述氯霉素转乙酰酶 (CAT)、β 半乳糖苷酶 (β gal)、β 葡萄糖苷酸酶 (p GUS)、分泌型碱性磷酸酶 (SEAP)、荧光素酶(luc)、绿荧光蛋白 (GFP)等报告基因系统研究与应用进展 ;简要介绍主要报告基因分析系统商品化试剂盒的研制及其应用范围和优缺点。     

调控毛囊生长CCDC72基因启动子克隆及萤光素酶报告基因载体的构建

目的对新发现的调控毛囊生长相关的CCDC72基因启动子序列进行分析,克隆并构建不同长度启动子萤光素酶报告基因载体。方法运用在线软件Cister对CCDC72基因5’端2000bp进行启动子特征分析;以人毛乳头细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增目并进行测序鉴定,再以扩增产物为模板PCR得到不同长度的启动子片段,并测序,将获得启动子片段插入pGL3-Basic载体。结果序列分析发现起始密码子ATG上游的-1--200bp及-600--1000bp的区域内存在多个顺式作用元件,成功获得1924bp扩增片段,并构建了4个不同长度的CCDC72启动子报告基因载体。结论上述载体的成功构建及序列分析为进一步研究CCDC72基因的启动子活性及基因表达调控奠定了基础。     

治疗基因VEGF_(165)和报告基因NIS共表达载体的构建和鉴定

目的:利用内部核糖体进入位点(IRES)序列,构建含有血管内皮生长因子(VEGF165)和人钠碘同向转运体(NIS)的真核双表达载体pIRES-VEGF165-NIS,并在体外检测NIS蛋白和VEGF165蛋白在HEK293细胞中的表达。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增得到目的基因VEGF165和NIS,通过酶切将其连接克隆至pIRES载体以构建pIRES-VEGF165-NIS质粒,再通过脂质体将构建好的质粒转染入HEK293细胞,并采用蛋白印迹法和免疫荧光法检测VEGF165和NIS蛋白的表达。结果:成功构建了双基因双表达载体pIRES-VEGF165-NIS,且其受巨细胞病毒(CMV)极早期基因启动子调控。蛋白印迹法检测显示,VEGF165和NIS可同时在HEK293细胞中表达,而免疫荧光显示转染的HEK293细胞可同时表达VEGF165蛋白和NIS蛋白。结论:IRES序列调控VEGF165和NIS双基因可在细胞中同时独立表达,为进一步构建双基因表达重组腺病毒,并利用人NIS作为报告基因,实时监测VEGF165治疗基因的表达和分布奠定基础。     

大鼠SERCA2a启动子虫荧光素酶质粒的构建、鉴定和转染

目的 构建大鼠SERCA2a启动子一虫荧光索酶质粒，并进行鉴定和转染检测。方法 PCR法扩增出含SERCA2a启动子基因的DNA大片段，经pGEM-Tesay载体连接后酶切获得目的基因，亚克隆到pGL3-Basic载体中；酶切及测序鉴定；用Lipofectin Reagent转染到心肌细胞中。细胞培养后裂解并作荧光检测。结果 构建出了含虫荧光家酶基因的质粒，酶切及测序鉴定插入子为大鼠SERCA2a启动于。转染细胞后检测到荧光。结论 成功构建了大鼠SERCA2a启动子-虫荧光索酶质粒，为SERCA2a基因调控等研究提供了工具和基础。     

大鼠SERCA2a启动子虫荧光素酶质粒的构建、鉴定和转染

目的构建大鼠SERCA2a启动子-虫荧光素酶质粒,并进行鉴定和转染检测。方法PCR法扩增出含SER-CA2a启动子基因的DNA大片段,经pGEM-T esay载体连接后酶切获得目的基因,亚克隆到pGL3-Basic载体中;酶切及测序鉴定;用Lipofectin Reagent转染到心肌细胞中,细胞培养后裂解并作荧光检测。结果构建出了含虫荧光素酶基因的质粒,酶切及测序鉴定插入子为大鼠SERCA2a启动子,转染细胞后检测到荧光。结论成功构建了大鼠SERCA2a启动子-虫荧光素酶质粒,为SERCA2a基因调控等研究提供了工具和基础。     

MTS1基因β启动子转录活性研究

目的 研究IMTSl基因β启动子在急性T淋巴细胞白血病细胞株中的转录激活情况，鉴定β启动子转录活性的功能片段区。方法 用DNA重组方法，构建MTS1基因口启动子3′端转录起始点相同，而5′端序列不同的7种pGL3重组质粒。用脂质体介导的基因瞬时转染法，将构建的重组质粒分别转染MTSl基因双等位缺失的Jurkat细胞株，检测pGL3重组质粒中荧光素酶报告基因的表达，观察β启动子在Jurkat细胞中的激活情况及其基础转录活性片段区。结果 成功构建了MTSI基因β启动子7种不同片段的重组质粒，它们在Jurkat细胞中均有转录活性，其中0．38kb Sac Ⅱ-Sac Ⅰ酶切片段是MTSl基因β启动子转录活性的基础片段。结论 IMTSlβ启动子可在Jurkat细胞中被激活。     

pGL3-Claudin-1 promoter荧光素酶报告基因质粒的构建及其功能鉴定

背景:Claudin-1是一种多功能蛋白,除了组成紧密连接封闭细胞间隙,它在转录水平的表达失调可能作为一种分子标志反映到恶性肿瘤的侵袭转移和预后中。目的:构建重组大鼠重组Claudin-1萤光素酶报告基因质粒。方法:设计和合成包含5’非转录区的约2000bp的脱氧核糖核酸链,经过限制性内切酶KpnⅠ和MluⅠ酶切后插入到pGL3-Basic载体中,并用感受态E.coliDH5α和Pmd18-T-simple载体筛选阳性样品。阳性克隆通过测序和PCR证实。实验分为4组:对照组,阳性对照组(pGL3-promoter质粒转染),阴性对照组(转染pGL3-Basic质粒),实验组(转染pGL3-Claudin-1promoter质粒)。将质粒转染293T细胞检测Claudin-1启动子活性。结果与结论:重组质粒DNA测序结果采用NCBIblast比对与GenBank(gi|62750811)中大鼠Claudin-1基因启动子序列完全匹配。重组萤光素酶报告基因转录活性检测与pGL3-Basic质粒相比,重组pGL3质粒转录活性明显增强(P<0.001)。经过测序和转染结果证实有效的pGL3-Claudin-1启动子质粒构建成功。     

构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定

背景:增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白.研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达.目的:构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,并对此重组载体进行鉴定.方法:用聚合酶链反应方法从含增强型绿色荧光蛋白基因的表达载体pEGFP-N1上高保真克隆出EGFP基因,通过分子克隆技术将目的基因重组至反转录病毒表达载体pLXSN.用菌斑快速聚合酶链法筛选阳性重组子,针对目的基因插入载体的方向设计鉴别插入方向的引物,用聚合酶链反应法、限制性酶法鉴定目的基因及连接的正向性,并对pLXSN-Kozak-EGFP重组载体进行DNA测序分析.结果与结论:从pEGFP-N1载体中克隆出上游含Kozak序列的EGFP基因,目的条带大小约750 bp.构建的pLXSN-Kozak-EGFP重组子经菌落PCR鉴定,750 bp处有特异性条带.插入方向经PCR鉴定,350 bp处有特异性条带.限制性内切酶法鉴定,750与6000 bp处有特异性条带.DNA测序比对结果表明克隆的目的基因与Kozak-EGFP一致性为100%.结果提示实验成功构建了含EGFP报告基因与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,且插入方向为正向.     

血管紧张素Ⅱ对人α1(Ⅰ)胶原基因启动子与活性的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人皮肤成纤维细胞增殖活性及人α1(Ⅰ)原胶原基因启动调控序列的作用。方法用组织块法原代培养人皮肤成纤维细胞并进行传代培养作为本研究的模型细胞。①采用四甲基偶氮唑盐(MTT)掺入法测定经不同浓度血管紧张素Ⅱ处理24 h后成纤维细胞的增殖情况。②构建含长短不一的人α1(Ⅰ)原胶原基因5'侧翼区序列与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的重组体pCOLH11.5、pCOLH12.5,用FUGENE 6将重组体转染至人皮肤成纤维细胞,ELISA法测定不同浓度血管紧张素Ⅱ作用24 h后,转染有重组体的成纤维细胞的CAT表达量。结果①在1×10-9~1×10-5mol/L血管紧张素Ⅱ处理24 h后,各浓度组成纤维细胞增殖值与对照组之间不存在剂量依赖关系(P>0.05)。②2种重组体转染成纤维细胞,并经血管紧张素Ⅱ处理24 h后,转染细胞的CAT相对表达量测定:pCOLH12.5组与对照组之间,较高浓度组(1×10-5mol/L)与较低浓度组(10×10-6mol/L)之间存在显著差异(P<0.05),且存在剂量依赖关系,pCOLH11.5组与对照组之间不存在明显差异(P>0.05)。结论血管紧张素Ⅱ在1×10-9~1×10-5mol/L浓度范围内,对所研究的模型细胞———人皮肤成纤维细胞增殖不存在剂量依赖关系。血管紧张素Ⅱ对胶原基因启动序列pCOLH12.5具有正性调控作用,并存在剂量依赖关系。     

新型内源性磁共振报告基因——小鼠铁蛋白基因的构建

目的 应用pcDNA3.1(-)质粒载体系统构建携带小鼠铁蛋白重链全基因质粒,并探讨铁蛋白基因作为一种新型内源性磁共振分子影像报告基因的可行性和优越性.方法 从来源于小鼠肌肉的mRNA,应用一对含有限制性内切酶Not Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的引物进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增出铁蛋白重链全基因(Fth)片断.通过限制性内切酶Not Ⅰ和BamH Ⅰ酶切和T4连接酶的作用,将铁蛋白重链全基因插入到载体pcDNA3.1(-)中,构建铁蛋白重链全基因质粒pcDNA3.1(-)-Fth.结果 质粒pcDNA3.1(-)-Fth成功构建,符合酶切和测序鉴定结果.结论 初步构建的小鼠铁蛋白重链质粒,为进一步探讨铁蛋白基因作为一种新型内源性磁共振分子影像报告基因在细胞示综和基因显像中的应用奠定了基础.