全自动PCR检测系统检测痰中结核分枝杆菌

应用全自动PCR系统检测痰中结核分枝杆菌，因其克服了以往传统定性PCR的诸多不良，在确保PCR高特异性的基础上，大幅度提高了检出的敏感性，拓展了PCR技术的应用，从而为国内外所重视。本文概述了目前国外几种用于痰中结核分枝杆菌的全自动PCR系统的原理，检测方法及评价，并略述其临床意义，以便更好地认识和应用该项技术。     

聚合酶链反应检测稳定L型结核分枝杆菌

目的探讨聚合酶链反应(PCR)在结核分枝杆菌稳定L型检测的应用价值.方法采用结核分枝杆菌染色体基因重复保守序列为引物的PCR诊断试剂检测非高渗培养的结核分枝杆菌稳定L型纯培养物的染色体DNA.结果结核分枝杆菌稳定L型的染色体DNA经PCR扩增后电泳可见2条DNA带,其中1条主带与其亲代细菌型一致,另1条为相对分子质量较小的次带.结论结核分枝杆菌稳定L型仍保留了与细菌型染色体PCR引物反应的特异性序列和出现1条相对小分子质量的带,但仍然可用结核分枝杆菌PCR对其进行特异性检测与鉴定.     

实时荧光PCR分子信标检测耐利福平结核分枝杆菌印rpoB基因

目的 应用实时荧光PCR分子信标技术,建立快速检测临床标本中结核分枝杆菌利福平rpoB相关耐药突变点方法,探讨其缩短耐药实验报告时间的临床应用价值.方法 以分枝杆菌药物敏感性实验绝对浓度法为标准,12株非结核分枝杆菌、4株非分枝杆菌作对照,对174例结核患者临床分离株应用实时荧光PCR分子信标方法,检测利福平rpoB核心区域的耐药突变点并将结果与直接测序进行比较.结果 (1)实时荧光PCR分子信标方法:82例结核分枝杆菌利福平敏感菌株中,3例发生rpoB基因突变,特异度为96.3%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,82例检出耐药突变,敏感度为89.1%;准确性为92.5%.(2)DNA直接测序分析:82例结核分枝杆菌利福平敏感株中,1例发生rpoB基因突变,特异度为98.8%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,83例发生:rpoB基因突变,敏感度为90.2%;准确性为94.2%.检测174株结核分枝杆菌临床分离菌株,与实时荧光PCR分子信标方法检测一致性为98.3%(171/174).结论 实时荧光PCR分子信标方法检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变点可作为结核患者快速耐药检测的初筛方法之一.     

3种方法检测痰结核分枝杆菌的比较

目的：探讨建立更快速、准确的痰结核分枝杆菌检测方法。方法：采用涂片抗酸染色法、快速结核菌培养法和荧光定量PCR技术对痰结核分枝杆菌进行检测,并对其检出率进行比较。结果：荧光定量PCR技术的检出率最高,快速培养法次之且检测时间较长,抗酸染色法检出率最低。结论：荧光定量PCR技术能对痰结核分枝杆菌进行简便、快速、敏感、特异的检测,在肺结核的早期诊断和疗效观察中将能发挥重要作用。     

结核分枝杆菌的检测及分子生物学技术应用评价

文中分析了几种传统的结核杆菌检测方法及分子生物学技术在结核分枝杆菌检测中的应用。PCR技术具有快速、敏感和特异性高的优点，但结果的精确性在各实验室之间仍存在着差异，尽管如此，PCR技术对结核分枝杆菌早期感染和MDR结核病的直接检测，仍具有其独特的优势。同时，指出了影响PCR结果精确性的因素，以及对新暴露的人群，在PCR检测阳性、结核菌素试验和结核杆菌培养结果阴性的情况下，阴性预测值（NPV）的研究比较有实用价值。     

PCR-SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的研究

目的探讨PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因作为新的分子药敏试验方法的价值。方法应用PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因核心区的突变，同时对片段长度为215bp的PCR扩增产物进行测序分析。受试菌为23株利福平敏感结核分枝杆菌以72．35株利福平抗性结核分枝杆菌。结果23株利福平敏感结核分枝杆菌分别用PCR—SSCP和PCR扩增片段测序均没有检测到巾0B碱基突变。而在35株利福平抗性菌株中，PCR—SSCP检测到31株与H37Rv标准株不同的带谱，PCR—SSCP检测基因突变的敏感度和特异度分别为88．6％（31／35）和100％（23／23）。对35株利福平抗性菌株PCR扩增产物进行测序分析，在其中32株中检出了基因突变。测序分析检测基因突变的敏感度和特异度分别为91．4％（32／35）和100％（23／23）。卡方检验，PCR—SSCP和PCR扩增片段测序两种方法的敏感度之间没有显著性差异（P〉0．05）。若以DNA测序为标准，则PCR—SSCP检测基因突变的准确度、敏感度和特异度分别为93．1％（54／58），96．9％（31／32）和100％（23／23）。结论PCR—SSCP检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变可用于利福平药物敏感度的快速测定。     

PCR—SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的研究

目的探讨PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因作为新的分子药敏试验方法的价值。方法应用PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因核心区的突变，同时对片段长度为215bp的PCR扩增产物进行测序分析。受试菌为23株利福平敏感结核分枝杆菌以72．35株利福平抗性结核分枝杆菌。结果23株利福平敏感结核分枝杆菌分别用PCR—SSCP和PCR扩增片段测序均没有检测到巾0B碱基突变。而在35株利福平抗性菌株中，PCR—SSCP检测到31株与H37Rv标准株不同的带谱，PCR—SSCP检测基因突变的敏感度和特异度分别为88．6％（31／35）和100％（23／23）。对35株利福平抗性菌株PCR扩增产物进行测序分析，在其中32株中检出了基因突变。测序分析检测基因突变的敏感度和特异度分别为91．4％（32／35）和100％（23／23）。卡方检验，PCR—SSCP和PCR扩增片段测序两种方法的敏感度之间没有显著性差异（P〉0．05）。若以DNA测序为标准，则PCR—SSCP检测基因突变的准确度、敏感度和特异度分别为93．1％（54／58），96．9％（31／32）和100％（23／23）。结论PCR—SSCP检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变可用于利福平药物敏感度的快速测定。     

结核分枝杆菌快速检测方法研究进展

中国结核病发病人数居世界第二位,是22个结核病高负担国家之一1].结核分枝杆菌检测是结核病防治的重点和难点[2],传统的检测方法如结核分枝杆菌培养法,虽然具有很高的特异性和准确性,但同时存在检测周期长,阳性率低等缺点而不能满足快速诊断的需要[3].目前临床实验室关于结核菌的诊断方法主要包括全自动培养法、免疫学方法、分子生物学方法、基因芯片法等,本文将对以上结核分枝杆菌快速检测新技术进行综述. 1全自动培养系统 全自动培养系统已进入临床应用,如BACTEC MGIT960系统、BACTEC9000 MB系统、ESP培养系统Ⅱ和MB/BacT系统等.BACTEC MGIT960系统具有高容量、安全、无交叉污染、无放射性污染、自动存储数据等优点.与之相比,BACTEC9000 MB系统由于MB系统含有较多培养基而使标本稀释,因而使检出率大大降低.ESPⅡ培养系统检测耗时长,假阳性率高[4].     

基于多重PCR-质谱微测序技术的结核分枝杆菌对一线治疗药物耐药性检测系统构建

目的 构建一种基于多重聚合酶链式反应-质谱微测序技术的结核分枝杆菌耐药基因多位点检测方法和检测模块，实现结核分枝杆菌对一线抗结核药物的高通量快速检测，为结核病诊疗提供一种新型技术支撑。方法 通过对5个单核苷酸多态性位点靶基因进行多重PCR扩增、单碱质量探针延伸及分子质量测定，同时完成16个突变位点、26种突变型的检测，实现结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、吡嗪酰胺和乙胺丁醇等一线治疗药物抗性的通量检测。采用40例结核分枝杆菌样本、50例呼吸道感染患者咽拭子样本进行检测体系准确性及特异性验证。结果 本研究构建了基于5重PCR-质谱联用的结核分枝杆菌对一线治疗药物的泛耐药检测方法，并开发了质谱配套检测系统。采用该系统，结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇抗性检测的准确率和特异性均为100.00%，且具有7 h内完成96个样本的检测通量。结论 本研究构建的方法有操作简便、低成本、高通量特点，耐药位点检测全面且准确，并具扩展性，可根据需要增添新突变位点，在结核分枝杆菌耐药性检测中具有良好应用前景。     

菌阴肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变的检测

目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测菌阴肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种判定菌阴肺结核患者是否对利福平有无耐药性的方法。方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色、罗氏培养。结果112例活动性肺结核患者痰标本39例为菌阴(涂阴培阴),39例菌阴痰中套式PCR扩增18例呈阳性,产物DNA测序2例有rpoB基因突变,位点为第526发生了CAC→GAC突变和第531发生了TCG→TTG突变。20例非结核性肺部疾病患者标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%。结论套式PCR-DNA测序可望为直接检测菌阴肺结核患者临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

菌阴肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变的检测

目的 应用套式PCR-DNA测序方法直接检测菌阴肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种判定菌阴肺结核患者是否对利福平有无耐药性的方法.方法 采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况.同份痰标本同时做涂片抗酸染色、罗氏培养.结果 112例活动性肺结核患者痰标本39例为菌阴(涂阴培阴),39例菌阴痰中套式PCR扩增18例呈阳性,产物DNA测序2例有rpoB基因突变,位点为第526发生了CAC→GAC突变和第531发生了TCG→TTG突变.20例非结核性肺部疾病患者标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%.结论 套式PCR-DNA测序可望为直接检测菌阴肺结核患者临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法.     

聚合酶链反应-测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG基因突变的研究

目的应用PCR-DNA测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌分离株KatG基因突变,评价其在检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性方面的应用价值。方法47株耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株及30株结核分枝杆菌敏感分离株用PCR-DNA测序技术检测KatG基因突变。结果47株耐异烟肼结核分枝杆菌分离株中,有31株KatG基因检出有突变,突变检出率为66.0%(31/47);30株结核分枝杆菌敏感株检出1株KatG基因突变。结论PCR-DNA测序技术方法敏感、准确、特异,可快速检测结核分枝杆菌KatG耐药基因突变,有利于耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性的快速检测。     

聚合酶链反应-测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG基因突变的研究

目的 应用PCR-DNA测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌分离株KatG基因突变,评价其在检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性方面的应用价值.方法 47株耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株及30株结核分枝杆菌敏感分离株用PCR-DNA测序技术检测KatG基因突变.结果 47株耐异烟肼结核分枝杆菌分离株中,有31株KatG基因检出有突变,突变检出率为66.0%(31/47);30株结核分枝杆菌敏感株检出1株KatG基因突变.结论 PCR-DNA测序技术方法敏感、准确、特异,可快速检测结核分枝杆菌KatG耐药基因突变,有利于耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性的快速检测.     

焦磷酸测序技术检测耐多药结核分枝杆菌

目的利用焦磷酸测序技术,建立结核分枝杆菌菌株耐多药检测方法,并与Bactec MGIT 960药敏法进行比较。方法设计rpoB、katG基因PCR扩增引物和焦磷酸测序引物,建立结核分枝杆菌菌株焦磷酸测序检测方法。利用新确立的焦磷酸测序法检测202株临床分离的耐多药结核分枝杆菌的利福平、异烟肼耐药性。结果与BACTEC MGIT 960法检测药物耐药性结果比较,焦磷酸测序检测多耐药结核分枝杆菌临床分离株的敏感性与特异性为72.8%[95%可信区间(confidence in-terval,CI):66.3%~78.4%]及90.0%(95%CI:80.1%~95.1%)。结论新确立的焦磷酸测序技术可快速检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼的耐药性,其可作为耐多药结核分枝杆菌药敏有效的检测工具。     

荧光定量PCR检测抗酸染色涂片刮削物中结核分枝杆菌DNA的可行性

目的:分析荧光定量PCR技术检测抗酸染色涂片刮削物中结核分枝杆菌DNA的检测能力.方法:应用结核分枝杆菌(TB)核酸检测试剂(PCR-荧光探针法)检测80例阴性、25例1-9条/300视野、95例1+、40例2+、21例3+、20例4+抗酸染色显微镜检查结果的涂片刮削物结核分枝杆菌DNA,分析不同阳性等级涂片的靶DNA检出情况,并应用Spearman等级相关分析阳性等级与检出基因拷贝数的相关性.结果:在1-9条/300视野、1+、2+、3+、4+的涂片刮削物中,分别有7、48、31、19、20例结核分枝杆菌DNA检测阳性,阳性检出率分别为28.00％、50.53％、77.50％、90.48％和100.00％,总检出率为62.19％,阳性等级与靶基因拷贝数检测结果呈正相关(r=0.684,P＜0.001);80例阴性涂片刮削物检测结果均呈阴性.结论:荧光定量PCR技术对2+以上的抗酸染色涂片刮削物中的结核分枝杆菌DNA具有较好的检测效能,但对本属于荧光定量PCR技术检测灵敏度范围的1+涂片的低阳性检出率则需更进一步的研究.     

基于DPO的四重荧光PCR检测常见分枝杆菌方法的建立与应用

目的 利用多重荧光PCR技术,建立一种快速、准确、特异的检测常见分枝杆菌的方法.方法 以分枝杆菌16S rRNA作为检测靶基因,设计双启动寡核苷酸(DPO)引物和TaqMan探针,探针的5’端分别用FAM 、ROX、HEX和JOE进行荧光标记,3’端标记淬灭荧光.通过对4种分枝杆菌标准株基因组DNA的扩增,评价多重荧光PCR方法的特异性和灵敏度.采用建立的多重荧光PCR方法,采用该方法检测2010年6至12月杭州市红十字会医院68例结核科住院患者清晨痰液标本,结果与细菌培养和抗酸染色镜检进行比较.采用x2检验比较3种方法的阳性率.结果 该方法可准确、特异地鉴定结核分枝杆菌和3种常见非结核分枝杆菌,检测灵敏度均为1 ×101 cfu/ml.对68份痰液标本进行检测,结果显示31份检测结果阳性,阳性率45.6％,明显高于涂片染色镜检(阳性率14.7％),差异具有统计学意义(x2=15.4,P ＜0.05),其中28例为结核分枝杆菌,1例为鸟分枝杆菌,2例为胞内分枝杆菌,与细菌培养鉴定方法一致.1例培养阳性而PCR检测结果阴性标本经16SrRNA扩增测序鉴定为龟分枝杆菌.结论 本研究建立的多重荧光PCR方法敏感、特异、快速,能有效检测结核分枝杆菌和常见非结核分枝杆菌,可用于分枝杆菌感染者的实验室快速诊断.     

Xpert MTB/RIF在儿童肺结核诊断中的研究进展

儿童肺结核因其特殊性如临床表现缺乏特异性、痰结核分枝杆菌量少等特点,早期诊断儿童肺结核相对困难。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF)以全自动半巢式实时PCR技术为基础,以rpoB基因为靶基因,用探针杂交方法检测合成rpoB基因是否存在突变,用于检测痰或肺泡灌洗液及粪便等多种标本结核分枝杆菌及耐药情况。该技术是结核诊断领域的创新,在儿童肺结核早期诊断中具有较高价值。     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术快速筛选结核杆菌的利福平耐药性

目的：探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌利福平（RFP）药物敏感性的可行性。方法：应用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术分别检测了40株RFP药物敏感及耐药的结核分枝杆菌临床分离株。先用PCR扩增rpoB基因，随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变，并与药敏试验结果作对照分析。结果：所有临床分离株均观察到rpoB基因PCR扩增产物。40株RFP敏感的临床分离株SSCP带谱与结核分枝杆菌H37RV标准株相同，40株RFP耐药株中37株检测到突变图谱。与Bactec结果对照，用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌RFP耐药性的敏感性为93％，特异性为100％。结论：结核分枝杆菌耐RFP是其rpoB基因突变所致。PCR-SSCP技术可用于结核分枝杆菌RFP药物敏感性的直接快速检测。     

结核分枝杆菌荧光定量聚合酶链反应对结核性脑膜炎的早期诊断价值

目的:探讨荧光定量聚合酶链反应(荧光定量PCR)检测技术对诊断结核性脑膜炎的应用价值。方法:对165例确诊为结核性脑膜炎患者和38例非结核性脑膜炎患者行腰椎穿刺术,标本送检结核分枝杆菌的荧光定量PCR、结核分枝杆菌培养、涂片找抗酸杆菌,比较各种检测方法的敏感性和特异性。结果:荧光定量PCR反应检测阳性率52.7%,明显高于脑脊液涂片找抗酸菌(1.2%)及结核分枝杆菌培养(11.5%)。荧光定量PCR与抗酸杆菌培养方法对比,P<0.01,差异有统计学意义,PCR检测明显优于细菌学培养。结论:结核分枝杆菌的荧光定量PCR对结核性脑膜炎诊断特异性高,分析周期短,在早期诊断结核性脑膜炎方面有重要的参考价值。     

应用聚合酶链反应—反相膜杂交技术检测结核分枝杆菌

目的：探讨应用聚合酶链反应（PCR）－反相膜杂交技术检测结核分枝杆菌的价值。方法：收集52例活动性肺结核病人和12例非结核病人的痰标本,以双盲法进行痰涂片抗酸染色检查、结核菌培养、PCR－反相膜杂交技术,PCR－琼脂糖凝胶电泳技术检查对比。结果：涂片法、培养法、PCR－反相膜杂交法的敏感性分别为28．8％、42．3％、82．7％,PCR－反相膜杂交法的敏感性显著高于培养法和涂片法（P＜0．01）。PCR－反相膜杂交法和PCR琼脂糖凝胶电泳法的敏感性分别为82．7％和84．6％,特异性分别显91．7％和83．3％,前者特异性与后者相比差异有显著性（P＜0．01）。结论：PCR－反相膜杂交技术可应用于临床检测检测结核分枝杆菌。