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相似文献
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1.
目的:对现有常规提取血清microRNA的方法进行改良。方法:运用常规TRIzol法和改良后的血清microRNA提取方法分别提取健康人血清中的microRNA;利用反转录茎环引物及TaqMan探针进行实时荧光定量PCR检测miR-16和miR-21的含量,通过比较miR-16和miR-21的Ct值以鉴定不同提取方法对microRNA检测的影响。结果:改良后的血清microRNA提取方法可明显降低PCR检测中miR-16和miR-21的Ct值。结论:改良的血清microRNA提取方法可有效提高目的microRNA的检出水平。  相似文献   

2.
目的探讨和优化循环miRNA检测方法,为进一步研究循环miRNA作为生物标记物提供方法学基础。方法以miR-16和miR-21为检测目标,通过实时PCR的方法检测其表达量。比较传统Trizol法和miRNA提取试剂盒的miRNA提取效率;比较血清和血浆中miRNA含量;并对基于实时定量PCR(qPCR)的循环miRNA检测方法重复性和敏感性进行评价。结果 miRNA提取试剂盒的miRNA提取效率是传统Trizol法的16 435倍;血浆中miR-16和miR-21qPCR检测的Ct值为25.75±1.83、25.69±2.04,而血清miRNA检测Ct值为27.82±1.03、27.12±1.35,两者相比有显著差异;同一批血浆miR-16两次检测相关系数为0.8885,单个血浆样本10倍梯度稀释后Ct值拟合系数0.9865。结论 Trizol法提取循环miRNA效率低,血浆中miRNA含量较血清稍高,建议选取血浆为标本,通过miRNA提取试剂盒提取miRNA,然后行实时PCR检测其表达,该法具有较高的重复性和敏感性。  相似文献   

3.
目的探讨用实时荧光定量PCR检测急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者血清微小RNA(microRNA,miRNA)的表达并选择最优内参照基因。方法用实时荧光定量PCR检测40例ARDS患者及20例体检健康者血清中5个miRNA候选内参照基因miR-16-5p、miR-93-5p、miR-101-3p、miR-191-5p和U6,并用ge Norm法、Norm Finder法、bestkeeper法和相对△Ct法4种算法分析内参照基因稳定性,通过对4种算法稳定值进行排序并计算几何均数的方法分析综合稳定值。结果比较5个候选内参照基因在ARDS患者和体检健康者的表达水平,差异均无统计学意义(P均0.05)。4种算法综合分析显示,miR-16-5p以最小的稳定值1.32成为综合稳定性最高的内参照基因,其次是miR-101-3p、U6、miR-93-5p和miR-191-5p。结论实时荧光定量PCR法确定ARDS患者血清miRNA最优的内参照基因为miR-16-5p。  相似文献   

4.
目的 建立一种SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测血清miR-21方法,并初步探讨其对乳腺癌诊断的应用价值.方法 用Trizol试剂提取血清总RNA.用茎环引物将miR-16(作为miR-21内参基因)与miR-21分别逆转录成相应cDNA.再用SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR对cDNA进行扩增、检测.然后,通过信噪比(signal to noise ratio,SNR)分析试验的准确性;通过熔解曲线评价试验的特异性;通过标准曲线的R2评估试验的精确性;通过批内和批间差异计算试验的稳定性.另外,用自建方法检测33例乳腺癌患者、18例乳腺良性疾病和49名健康人群血清miR-21和miR-16水平,并根据乳腺癌组与健康对照组中miR-21相对表达量确定临界值,以评价其对乳腺癌诊断的敏感度、特异度.结果 通过PCR退火与延伸在温度和时间上的优化,本试验所建立方法SNR≥99.36%;熔解曲线为单峰;标准曲线R3=0.994 8;批内CV< 1.5%,批间CV< 4%.以miR-16为内参,用自建SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测乳腺癌组、良性疾病组与健康对照组血清miR-21的相对表达量分别为20.83±18.18、20.86±10.11和9.33±4.44,经Kruskal Wallis检验,3组间表达量差异有统计学意义(x2=16.92,P<0.001),且健康对照组与乳腺癌组、健康对照组与良性疾病组间的差异均有统计学意义(Z值分别为-2.58、-4.42,P均≤0.01),而乳腺癌组与良性疾病组血清miR-21表达量差异无统计学意义(Z=-0.51,P=0.608).以miR-21相对表达量18.32为临界值,其对乳腺癌诊断的敏感度为51.5%(17/33),特异度为93.9%(46/49).结论 建立了一种较敏感、特异、稳定的SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR检测血清miR-21方法,该方法对乳腺癌的诊断可能有一定价值.  相似文献   

5.
目的 检测窒息新生儿血清miR-21,miR-210和miR-424的表达水平,为microRNA在新生儿窒息的早期诊断和治疗提供理论依据.方法 运用RT-PCR方法检测62例窒息新生儿血清microRNA的表达水平.根据出生时Apgar评分,分为轻度窒息组45例,重度窒息组17例和30例健康孕妇脐血,以U6snRNA为内参,检测miR-21,miR-210和miR-424在血清中的表达水平.结果 3种microRNA在所有组中均可检测到,与对照组比较,miR 21和miR 210在窒息患儿血清中表达水平上调4.57±0.41和4.18±0.32倍(t=3.02,2.72,P<0.05),且重度窒息组高于轻度窒息组(t=2.23,2.25,P<0.05).miR 424表达水平无差异(1.34±0.19,t=0.29,P>0.05).结论 miR 21和miR-210在窒息患儿血清中表达上调,与病情严重性正相关,检测其在血清中的表达量对新生儿窒息的早期诊断与预后判断具有重要的临床意义.  相似文献   

6.
7.
田国忠 《疾病监测》2020,35(3):246-250
目的建立一种具有灵敏性高,特异性强的巢式聚合酶链式反应(PCR)方法检测血液标本中布鲁氏菌核酸DNA。方法使用细菌基因组提取试剂盒提取纯菌核酸DNA;使用血液等组织基因组核酸DNA提取试剂盒提取血液标本核酸DNA,对提取的核酸DNA先行常规PCR预扩增,以扩增的PCR产物为模板进行荧光定量PCR第二次扩增(即巢式PCR)。对纯菌提取的核酸DNA进行灵敏度和和特异性测试,构建巢式PCR的Ct值与核酸DNA拷贝数之关系曲线;检测临床血液标本核酸DNA,同时比较常规两种PCR方法检测结果。结果常规PCR检测的灵敏度为512个核酸DNA拷贝数;巢氏PCR检测有效范围为921.6 ng/μl^6.8 fg/μl,对应的Ct值为12.04~37.50,其指数关系为:y=(e-0.695x)×1012;R2=0.9986,巢式PCR扩增效率为2.28×109倍,检测限为2个布鲁氏核酸DNA拷贝数。巢式PCR的灵敏度为91.67%,特异度为93.10%,阳性预测值为91.67%,阴性预测值为93.10%。对一起羊养殖场采集的25份血液标本应用巢式PCR方法检测,结果阳性率为92.00%(23/25);27份健康人群血液标本没有检测出(无Ct值)。结论巢式PCR具有较好的灵敏性和特异性,特别适合于血液标本布鲁氏菌核酸DNA的检测。  相似文献   

8.
microRNA(miR)与急性白血病的发生密切相关.为分析急性白血病患者与正常人骨髓细胞中miR-143的差异表达情况,常规提取50例急性白血病患者及20例正常人骨髓细胞中的总RNA,应用实时荧光定量PCR的方法检测标本中miR-143的表达状况.结果表明:急性白血病患者骨髓细胞中miR-143表达明显下调(p<0.05);化疗缓解后表达明显上调;miR-143的表达与靶基因DNMT3A呈负相关.结论:miR-143在白血病病人骨髓细胞中的表达下调,这可能与白血病的发生发展有关.  相似文献   

9.
目的比较不同抗凝(EDTA抗凝、枸橼酸钠抗凝、不抗凝)所获得的血浆或血清对心梗后循环microRNA (miRNA)检测的影响.方法分别提取不同抗凝剂处理的胸痛6小时内的心梗患者和健康人的血样中的循环miR-NA,利用TaqManqRT-PCR方法分别检测EDTA抗凝血浆、枸橼酸钠抗凝血浆,以及血清中的miR-1、miR-133a的含量.结果心梗患者血浆和血清中都能有效检测 miR-1和 miR-133a的浓度.ROC曲线显示,EDTA血浆中的miR-1的AUC为0.885,miR-133a的AUC为0.797,高于血清及枸橼酸钠抗凝血浆中miR-1和miR-133a的AUC.结论 EDTA抗凝的血浆是检测心梗后miR-1和miR-133a含量的理想样本,其中miR-1在诊断心梗方面具有更好的特异性和灵敏性.  相似文献   

10.
目的对3种血浆微小RNA(miRNA)提取方法进行评价。方法运用国产、进口硅胶吸附柱法和TRIzol法分别提取20名志愿者血浆中的miRNA;利用TaqMan聚合酶链反应(PCR)检测提取物中的β-globin基因含量,观察提取物中RNA的纯度;利用反转录茎环引物及TaqMan-MGB探针q PCR检测提取物中miRNA-21含量,观察miRNA提取的效率。结果国产、进口硅胶吸附柱法及TRIzol法提取液中β-globin基因的Ct值分别为35.487±0.356、35.591±0.332和33.529±0.499,3种方法的Ct值差异有统计学意义(P0.001);国产和进口硅胶吸附柱方法的β-globin基因Ct值均明显高于TRIzol法(P0.000 1);而国产与进口硅胶吸附柱法β-globin基因Ct值差异无统计学意义(P=0.345 4)。国产、进口硅胶吸附柱法和TRIzol法miRNA-21的Ct值分别为26.527±0.158、26.653±0.201和28.169±0.385,3种方法的Ct值差异有统计学意义(P=0.000 3);国产和进口硅胶吸附柱法miRNA-21的Ct值均明显低于TRIzol法(P0.000 1);国产硅胶吸附柱法miRNA-21的Ct值低于进口硅胶吸附柱法(P=0.033 7)。结论硅胶吸附柱法可有效提高miRNA的提取效率和纯度。国产硅胶吸附柱法完全可以取代进口硅胶吸附柱法。  相似文献   

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