实时荧光定量PCR检测血清miR-375表达及临床应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清miR-375,并进行临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-375ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,绝对定量血清中miR-375的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-375表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在103~106 copy/μL范围内有良好的线性关系(r2=0.997),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-375表达水平明显高于健康体检者,差异有统计学意义(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR能敏感、特异地检测血清中miR-375的表达水平,为下一步临床应用研究奠定了方法学基础。     

实时荧光定量PCR检测血清miR-7方法的建立及临床初步应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法检测血清miR-7,并作临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-7ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR Green Ⅰ实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,绝对定量血清中miR-7的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-7表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在10~3copies/uL至10~6copies/uL范围内有良好的线性关系(r~2=0.995),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-7表达水平明显高于健康体检者(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测血清中miR-7的表达水平,为下一步临床应用的研究奠定了方法学基础。     

poly(A)加尾的实时荧光定量PCR检测血清miR-124a表达及临床初步应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测血清微小RNA(miR)-124a,并作临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-124aploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR Green I实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,定量血清中miR-124a的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-124a表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在103~106 copies/uL范围内有良好的线性关系(r2=0.999),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-124a表达水平明显高于健康体检者(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green I实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测血清中miR-124a的表达水平,为下一步临床应用的研究奠定了方法学基础。     

血清标本检测miR-29a实时荧光定量PCR方法的建立及临床初步应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测血清miR-29a,并作临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-29a ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得c DNA,进行SYBR Green I实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,绝对定量血清中miR-29a的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-29a表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在10~3copies/μl至10~6copies/μl范围内有良好的线性关系(r~2=0.991),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-29a表达水平明显高于健康体检者(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green I实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测血清中miR-29a的表达水平,为下一步临床应用的研究奠定了方法学基础。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测类风湿关节炎患者血清miR-146a的表达及意义

目的用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测类风湿关节炎(RA)患者血清miR-146a的表达水平,探讨其在RA诊断中的意义。方法以U6为内参照,用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测RA患者48例(活动期30例、缓解期18例)、骨性关节炎(OA)患者22例和体检健康者25例血清miR-146a的表达水平,并进行ROC曲线分析;对各组进行红细胞沉降率(ESR)检测。结果 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测结果表明,活动期RA患者血清miR-146a水平为(2.42±0.75),显著高于缓解期RA患者(1.66±0.29)、OA患者(1.12±0.43)和体检健康者(1.01±0.34),差异均有统计学意义(P均0.05);miR-146a诊断活动期RA的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.914(95%CI:0.872~0.926);以1.96为cut off值,敏感性为95.0%、特异性为87.5%、准确性为91.9%。活动期RA组ESR为(37.5±5.2)mm/h,缓解期RA组为(14.4±4.7)mm/h,OA组为(11.6±5.1)mm/h,健康对照组为(9.6±3.9)mm/h,各组间差异有统计学意义(F=177.01,P0.01)。结论建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR可用于RA患者血清miR-146a的检测。miR-146a可用于诊断活动期RA。     

外周血检测miR-21方法的建立及在支气管哮喘中的应用

目的设计茎环结构引物,建立外周血检测微小RNA-21(miR-21)的检测方法,并初步应用于支气管哮喘患者外周血单个核细胞(PBMC)样本的检测。方法设计miR-21的茎环结构反转录引物和聚合酶链反应(PCR)扩增引物,以U6为内参照,利用SYBR green实时荧光PCR检测20例支气管哮喘患者和20名健康人的外周血miR-21的表达水平,并分析2组间的差异。结果 SYBR green实时荧光PCR检测U6和miR-21含量的熔解曲线单一,PCR产物特异。在外周血中20例哮喘患者的miR-21水平明显高于20名健康人(P<0.001)。结论本实验成功建立了SYBR green荧光定量PCR检测外周血miR-21表达水平的技术平台,为miR-21在支气管哮喘发生中分子生物学机制研究建立了基础。     

茎环引物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测miR-155表达及其临床初步应用

目的建立茎环状逆转录引物（简称茎环引物）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）,并作初步应用。方法应用SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR检测CD4＋T细胞株的miR-155,初步验证方法的可行性。用所建立的方法对60份临床宫颈刮取物标本进行检测,分析miR-155与宫颈癌及感染的高危型人类乳头状瘤病毒（HPV）基因型别的关系,其聚合酶链反应（PCR）反应产物通过电泳验证产物特异性。结果所建方法能特异的检测到miR-155的扩增信号,最低检出限为10^-7nmol/L,在10^-1-10^-6nmol/L之间有良好的线性关系,相关系数（r）为0.99,扩增后惟一的熔解曲线特异峰显示很好的特异性。CD4^＋T细胞株及60例临床宫颈刮取物标本miR-155均显示阳性,PCR反应产物电泳可获得单一条带。宫颈刮取物miR-155与宫颈癌有关（P〈0.05）,但与本研究涉及的HPV基因型别无关（P〉0.05）。结论所建立的茎环引物的SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR能快速、敏感、特异地检测细胞株和临床宫颈刮取物miR-155的表达水平,为进一步研究miR-155及其临床应用奠定了基础。     

茎环引物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测miR-155表达及其临床初步应用

目的建立茎环状逆转录引物(简称茎环引物)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR),并作初步应用。方法应用SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR检测CD4+T细胞株的miR-155,初步验证方法的可行性。用所建立的方法对60份临床宫颈刮取物标本进行检测,分析miR-155与宫颈癌及感染的高危型人类乳头状瘤病毒(HPV)基因型别的关系,其聚合酶链反应(PCR)反应产物通过电泳验证产物特异性。结果所建方法能特异的检测到miR-155的扩增信号,最低检出限为10-7nmol/L,在10-1~10-6nmol/L之间有良好的线性关系,相关系数(r)为0.99,扩增后惟一的熔解曲线特异峰显示很好的特异性。CD4+T细胞株及60例临床宫颈刮取物标本miR-155均显示阳性,PCR反应产物电泳可获得单一条带。宫颈刮取物miR-155与宫颈癌有关(P<0.05),但与本研究涉及的HPV基因型别无关(P>0.05)。结论所建立的茎环引物的SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR能快速、敏感、特异地检测细胞株和临床宫颈刮取物miR-155的表达水平,为进一步研究miR-155及其临床应用奠定了基础。     

荧光定量PCR检测血清微小RNA-21方法的建立及对乳腺癌诊断的初步应用

目的 建立一种SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测血清miR-21方法,并初步探讨其对乳腺癌诊断的应用价值.方法 用Trizol试剂提取血清总RNA.用茎环引物将miR-16(作为miR-21内参基因)与miR-21分别逆转录成相应cDNA.再用SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR对cDNA进行扩增、检测.然后,通过信噪比(signal to noise ratio,SNR)分析试验的准确性;通过熔解曲线评价试验的特异性;通过标准曲线的R2评估试验的精确性;通过批内和批间差异计算试验的稳定性.另外,用自建方法检测33例乳腺癌患者、18例乳腺良性疾病和49名健康人群血清miR-21和miR-16水平,并根据乳腺癌组与健康对照组中miR-21相对表达量确定临界值,以评价其对乳腺癌诊断的敏感度、特异度.结果 通过PCR退火与延伸在温度和时间上的优化,本试验所建立方法SNR≥99.36％;熔解曲线为单峰;标准曲线R3=0.994 8;批内CV＜ 1.5％,批间CV＜ 4％.以miR-16为内参,用自建SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测乳腺癌组、良性疾病组与健康对照组血清miR-21的相对表达量分别为20.83±18.18、20.86±10.11和9.33±4.44,经Kruskal Wallis检验,3组间表达量差异有统计学意义(x2=16.92,P＜0.001),且健康对照组与乳腺癌组、健康对照组与良性疾病组间的差异均有统计学意义(Z值分别为-2.58、-4.42,P均≤0.01),而乳腺癌组与良性疾病组血清miR-21表达量差异无统计学意义(Z=-0.51,P=0.608).以miR-21相对表达量18.32为临界值,其对乳腺癌诊断的敏感度为51.5％(17/33),特异度为93.9％(46/49).结论 建立了一种较敏感、特异、稳定的SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR检测血清miR-21方法,该方法对乳腺癌的诊断可能有一定价值.     

宫颈癌宫颈脱落细胞中miR-21的表达及其诊断价值的探讨

目的比较正常组与宫颈上皮内瘤变组、宫颈癌组宫颈脱落细胞中miR-21的相对表达水平是否在各组间存在明显差异。方法收集宫颈脱落细胞标本,正常对照组与宫颈上皮内瘤变组、宫颈癌组各30例,以U6为内参miRNA,用SYBR Green荧光定量PCR法测定各组中miR-21的表达水平,并评估miR-21对宫颈癌的诊断效能。结果宫颈上皮内瘤变组、宫颈癌组宫颈脱落细胞中miR-21的表达上调。miR-21区别正常组与宫颈上皮内瘤样病变组的ROC曲线面积为0.87(95%CI:0.7935-0.9621;P0.000 1),miR-21区别正常组与宫颈癌组的ROC曲线面积为0.92(95%CI:0.8590-0.9899;P0.000 1)。结论宫颈粘液脱落细胞中的miR-21对宫颈癌筛查诊断有潜在临床应用价值。     

乙型肝炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及临床应用

目的建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的快速方法,并探讨其临床应用价值。方法根据GenBank公布的Hepatitis B virus gp1基因序列设计引物,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,并对反应体系和扩增程序进行优化。定量标准品通过基因克隆方法获得,同时以浙江省夸克公司HBV DNA定量检测试剂盒作对照,应用于随机选取的100份乙型肝炎患者血清检测。结果 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检出限范围为5×10~2copies/ml~5×10~8copies/ml,HBV DNA浓度与CT值有良好线性关系,无交叉反应,整个过程仅需2.5 h。在随机抽取的100份临床标本应用中,与浙江省夸克公司的HBV荧光定量PCR检测试剂相比,建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR体系灵敏度100%,特异度92.5%。结论 SYBR Green实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药,准确评价HBV感染者的病情。     

两种定量聚合酶链反应模式检测乳腺癌组织中缓激肽释放酶表达的比较

目的比较两种荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测乳腺癌组织中激肽释放酶6（KLK6）基因的表达。方法分别用TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料作为荧光指示剂,实时荧光定量PCR检测KLK6在乳腺癌中的相对表达水平,应用统计软件分析两种检测模式的差异。结果两种检测模式的检测结果均显示乳腺癌中KLK6的表达均高于正常组织,KLK6的相对表达水平无显著性差异。结论在扩增产物特异的条件下应用SYBR Green Ⅰ检测的效果同Taq Man探针,SYBR Green Ⅰ染料应用范围广泛,成拳低。     

miR-124与HLA-G在宫颈癌中的表达及变化研究

目的 探讨miR-124与人类白细胞抗原G(HLA-G)在宫颈癌中的表达及变化.方法 选取2018年1月至2019年1月该院住院治疗的65例宫颈癌患者作为研究组,另选取同期在该院进行子宫肌瘤切除的40例患者作为对照组,通过实时荧光定量PCR检测宫颈组织中miR-124相对表达水平,采用化学发光免疫检测血清HLA-G水平,观察miR-124与HLA-G在宫颈癌中的表达及变化.结果 研究组宫颈组织中miR-124相对表达水平低于对照组,研究组血清HLA-G水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);研究组宫颈组织中miR-124相对表达水平在国际妇产科联盟(FIGO)分期、淋巴结转移、腺体浸润及脉管浸润间比较,差异有统计学意义(P<0.05);而血清HLA-G水平在FIGO分期、淋巴结转移、脉管浸润间比较,差异有统计学意义(P<0.05).miR-124与HLA-G联合检测的灵敏度为87.18％,特异度为83.52％.结论 miR-124与HLA-G水平变化与宫颈癌FIGO分期、淋巴结转移及脉管浸润有关,二者联合检测有望成为宫颈癌诊断的新靶点.     

乙型肝炎病毒SYBR Green I 实时荧光定量PCR方法的建立及临床应用

目的 建立SYBR Green I实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的快速方法,并探讨其临床应用价值。方法 根据GenBank公布的Hepatitis B virus gp1基因序列设计引物,建立SYBR Green I实时荧光定量PCR,并对反应体系和扩增程序进行优化。定量标准品通过基因克隆方法获得,同时以浙江省夸克公司HBV DNA定量检测试剂盒作对照,应用于随机选取的100份乙型肝炎患者血清检测。结果 SYBR Green I实时荧光定量PCR检出限范围为5×10²copies/ml～5×10⁸copies/ml,HBV DNA浓度与CT值有良好线性关系,无交叉反应,整个过程仅需2.5 h。在随机抽取的100份临床标本应用中,与浙江省夸克公司的HBV荧光定量PCR检测试剂相比,建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR体系灵敏度100%,特异度92.5%。结论SYBR Green实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药,准确评价HBV感染者的病情。     

宫颈癌患者组织和血液miR-21和miR-34a表达及诊断意义

目的探讨miR-21、miR-34a在宫颈癌中的表达情况及对宫颈癌的诊断意义。方法手术治疗的宫颈癌患者56例为宫颈癌组,子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)患者82例为CIN组,其中CINⅠ级21例(CINⅠ组)、CINⅡ级30例(CINⅡ组)、CINⅢ级31例(CINⅢ组),子宫肌瘤患者49例为对照组。采用PCR法检测各组宫颈组织和血液中miR-21、miR-34a表达水平,血液与宫颈组织中miR-21、miR-34a表达的一致性采用Kappa检验;绘制ROC曲线,评估miR-21、miR-34a对宫颈癌的诊断价值。结果宫颈癌组宫颈组织和血液miR-21表达水平(5.17±1.36、3.11±0.49)高于对照组(1.24±0.33、0.97±0.22)和CIN组(1.43±0.28、1.14±0.32)(P0.05),miR-34a表达水平(0.20±0.05、0.29±0.08)低于对照组(0.90±0.31、0.96±0.21)和CIN组(0.62±0.16、0.65±0.17)(P0.05),对照组与CIN组比较差异无统计学意义(P0.05);宫颈癌组宫颈组织和血液miR-21表达水平均高于CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和对照组(P0.05),血液miR-34a表达水平低于CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和对照组(P0.05);宫颈癌组和CINⅢ组宫颈组织miR-34a表达水平低于CINⅠ组、CINⅡ组和对照组(P0.05);对照组、CIN组和宫颈癌组血液与宫颈组织中miR-21表达水平具有良好一致性(Kappa=0.796、0.751、0.773),miR-34a表达具有一般一致性(Kappa=0.724、0.738、0.715);当miR-21、miR-34a最佳截断值分别为5.75、0.30时,miR-21诊断宫颈癌的灵敏度为82.35%,特异度为83.66%,miR-34a诊断宫颈癌的灵敏度为81.19%,特异度为78.37%。结论宫颈癌患者宫颈组织miR-21表达上调、miR-34a表达下调,其与血液中表达变化具有一致性,miR-34a可能参与不同级别CIN的发展过程;miR-21、miR-34a对诊断宫颈癌有一定的意义。     

血清miR-6801在非小细胞肺癌辅助诊断中的临床意义

目的探讨血清miR-6801在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的表达水平及其在NSCLC辅助诊断中的临床意义。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测40例健康人和78例NSCLC患者血清中miR-6801的表达量,并构建受试者操作特征(ROC)曲线计算血清miR-6801的灵敏度和特异度。结果 NSCLC患者血清中miR-6801的表达水平显著低于健康者,差异有统计学意义(P0.05);血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期中的表达水平显著低于Ⅰ期+Ⅱ期(P0.05);血清miR-6801对NSCLC检测的灵敏度为51.9%;miR-6801对Ⅰ期、Ⅱ期NSCLC检测的灵敏度为40.6%。结论 NSCLC患者miR-6801的检测对于NSCLC的辅助诊断和早期诊断有一定的临床应用价值。     

SYBR Green Ⅰ Real time PCR检测胃癌组织中LIN28基因方法的建立

目的 建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR方法,测定LIN28基因在胃癌组织中的表达水平,并进行实验室方法学评价.方法 采用RT-PCR扩增LIN28 基因片段 ,将该片段克隆到质粒载体PMD18-T上, 转化入大肠埃希氏菌(DH5a)中,PCR鉴定后,提取重组质粒,以阳性质粒为模板,建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线,以β-actin为内参,运用Rotor-Gene 6000series software做相对定量分析,检测30例胃癌患者的癌组织中LIN28的表达水平.结果 用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,内参β-actin和LIN28标准曲线相关系数分别为0.999 7和0.999 1,其最低的检测拷贝数为1,LIN28溶解曲线呈单个特异峰.结论 成功地构建了LIN28的原核表达载体.建立的SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR法特异度、敏感度高,稳定性好,可用于定量测定胃癌组织中LIN28的表达水平.     

实时荧光定量PCR技术运用于肝癌患者基因检测

目的探讨实时荧光定量PCR SYBR Green I探针技术在研究肝癌患者中基因表达情况的可行性。方法运用实时荧光定量PCR SYBR Green I技术,检测肝癌患者癌组织及癌旁组织RAP1GAP基因表达情况。结果实验组和对照组有明显的统计学差异。结论Real-time PCR技术检测目的基因的表达是非常方便快捷准确的方法。     

p53基因第8外显子实时荧光PCR方法的建立

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测p53基因第8外显子的方法。方法用酚-氯仿抽提法提取云南省中医院的常规体检患者的DNA,应用SYBR GreenⅠ作荧光染料,通过检测PCR产物中荧光讯号的强度来定量p53基因,重复测定该标本18次,以此建立检测p53基因的实时荧光定量PCR方法。结果融解曲线分析表明该方法特异可靠。结论该研究建立了p53基因实时荧光定量PCR检测方法,该方法简便、特异、重复性好、可信度高,为p53基因第8外显子的定量研究提供了理想的检测方法。     

非小细胞肺癌血清miR-125b水平变化及其临床意义

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清中miR-125b的表达水平变化及其在NSCLC辅助诊断和疗效评估中的临床应用价值。方法采用实时荧光定量PCR法检测102例NSCLC患者、45例肺部良性疾病患者和42例健康对照者血清中miR-125b的表达量。结果 NSCLC患者化疗前血清中miR-125b的表达水平明显高于健康人和肺部良性疾病组(P0.05);血清miR-125b在Ⅲ期+Ⅳ期中的表达水平显著高于Ⅰ期+Ⅱ期(P0.01)。与化疗前比较,晚期NSCLC患者化疗2个周期后,血清中miR-125b的表达量明显降低(P0.05)。结论血清miR-125b的检测对于NSCLC的辅助诊断和化疗疗效评价有一定的临床应用价值。