利用菲立磁细胞内标记恒河猴骨髓基质细胞的初步实验

目的:探索利用菲立磁和转染试剂体外磁性标记恒河猴骨髓基质细胞的可行性,为临床上应用磁共振成像追踪标记细胞奠定基础。方法:实验于2004-04/2005-05在南方医科大学珠江医院全军神经医学研究所完成。纳入健康恒河猴3只,无菌条件下取骨髓,梯度密度离心法分离获取恒河猴骨髓基质细胞,使用“菲立磁-多聚赖氨酸复合物”标记骨髓基质细胞,采用普鲁士兰染色、电镜和锥虫蓝排除实验等方法鉴定菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记恒河猴骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,并对菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估。结果:①菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞,标记效率在99%左右。②普鲁士蓝染色显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。③电镜结果显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记的骨髓基质细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。④与正常未标记的细胞相比较,菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的影响。结论:菲立磁可以用来体外标记恒河猴骨髓基质细胞。     

利用菲立磁细胞内标记恒河猴骨髓基质细胞的初步实验

目的：探索利用菲立磁和转染试剂体外磁性标记恒河猴骨髓基质细胞的可行性，为临床上应用磁共振成像追踪标记细胞奠定基础。方法：实验于2004—04／2005—05在南方医科大学珠江医院全军神经医学研究所完成。纳入健康恒河猴3只，无菌条件下取骨髓，梯度密度离心法分离获取恒河猴骨髓基质细胞，使用“菲立磁-多聚赖氨酸复合物”标记骨髓基质细胞，采用普鲁士兰染色、电镜和锥虫蓝排除实验等方法鉴定菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记恒河猴骨髓基质细胞的效率和细胞的活力，并对菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估。结果：①菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞，标记效率在99％左右。②普鲁士蓝染色显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。③电镜结果显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记的骨髓基质细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。④与正常未标记的细胞相比较，菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的影响。结论：菲立磁可以用来体外标记恒河猴骨髓基质细胞。     

菲立磁-多聚赖氨酸复合物体外标记免骨髓基质细胞

背景:为明确细胞移植后症状改善是否由移植所致,既往多采用侵袭性方法,但是这种方法不适用于动态追踪及人体研究.如果能够在合适示踪剂的帮助下,采用无创伤性影像学技术在活体识别、跟踪移植后细胞的存活状态,将显著提高细胞移植疗法的学术价值.目的:初步探讨菲立磁-多聚赖氨酸复合物体外磁性标记兔骨髓基质细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/08在珠江医院神经外科实验室完成.材料:2月龄新西兰大白兔8只,由广州中医药大学实验动物中心提供.菲立磁为Advanced Magnetic公司产品,多聚赖氨酸为sigma公司产品.方法:无菌条件下穿刺抽取兔股骨骨髓,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞,收集第2代细胞,加入含白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子及胎牛血清的神经干细胞培养摹诱导5 d.将50 mg/L菲立磁和1.5 mg/L多聚赖氨酸混合,振荡30 min后,将复合物加入到细胞培养基中进行标记,孵育细胞24 h.主要观察指标:骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化情况,细胞内铁的鉴定,菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对细胞增殖或分化的影响.结果:骨髓基质细胞诱导后可见少量细胞的胞体变圆变大,突起缩短,随时间延长,圆形细胞逐渐增多,部分聚集成簇、成球,FITC荧光染色示巢蛋白呈阳性表达.普鲁士蓝染色结果显示99%以上骨髓基质细胞的胞质内出现细小的蓝色铁颗粒.在含菲立磁-多聚赖氨酸复合物的培养基中,骨髓摹质细胞可继续增殖和分化,但增殖分裂后细胞质内铁颗粒数量较增殖前有所减少,经鉴定部分为神经元特异性烯醇化酶阳性细胞.结论:菲立磁-多聚赖氨酸复合物可在体外高效标记骨髓基质细胞,且标记后细胞的活性、增殖和分化能力不受影响.     

菲立磁-多聚赖氨酸复合物体外标记兔骨髓基质细胞

背景：为明确细胞移植后症状改善是否由移植所致，既往多采用侵袭性方法，但是这种方法不适用于动态追踪及人体研究。如果能够在合适示踪剂的帮助下，采用无创伤性影像学技术在活体识别、跟踪移植后细胞的存活状态，将显著提高细胞移植疗法的学术价值。 目的：初步探讨菲立磁-多聚赖氨酸复合物体外磁性标记兔骨髓基质细胞的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2008-03108在珠江医院神经外科实验室完成。材料：2月龄新西兰大白兔8只，由广州中医药大学实验动物中心提供。菲立磁为Advanced Magnetic公司产品，多聚赖氨酸为sigma公司产品。方法：无菌条件下穿刺抽取兔股骨骨髓，梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞，收集第2代细胞，加入含白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子及胎牛血清的神经干细胞培养基诱导5d。将50mg／L菲立磁和1．5mg／L多聚赖氨酸混合，振荡30min后，将复合物加入到细胞培养基中进行标记，孵育细胞24h。主要观察指标：骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化情况，细胞内铁的鉴定，菲立磁多聚赖氨酸复合物标记对细胞增殖或分化的影响。 结果：骨髓基质细胞诱导后可见少量细胞的胞体变圆变大，突起缩短，随时间延长，圆形细胞逐渐增多，部分聚集成簇、成球，FITC荧光染色示巢蛋白呈阳性表达。普鲁士蓝染色结果显示99％以上骨髓基质细胞的胞质内出现细4、的蓝色铁颗粒。在含菲立磁-多聚赖氨酸复合物的培养基中，骨髓基质细胞可继续增殖和分化，但增殖分裂后细胞质内铁颗粒数量较增殖前有所减少，经鉴定部分为神经元特异性烯醇化酶阳性细胞。 结论：菲立磁-多聚赖氨酸复合物可在体外高效标记骨髓基质细胞，且标记后细胞的活性、增殖和分化能力不受影响。     

活体磁共振示踪磁标记大鼠神经干细胞

背景:要将神经干细胞替代治疗神经系统疾病应用于临床,必须解决一个重要问题,就是植入人脑内神经干细胞的存活、迁移、识别和动态监测.目的:拟建立菲立磁体外标记胎鼠神经干细胞的方法及检测于段,观察标记细胞移植后在活体上磁共振信号的改变.设计、时间及地点:MRI动态评估,体内实验,于2005-01/08在武警医学院附属医院完成.材料:孕13～18 d SD胚胎大鼠10只用于分离、培养大鼠胚胎源性神经干细胞,健康成年清洁级SD大鼠32只,用于制作局灶性脑缺血再灌注模型.方法:分离培养大鼠胚胎源性神经干细胞,使用菲立磁一多聚赖氨酸复合物标记神经干细胞.制作局灶性脑缺血再灌注模型,将菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记的神经干细胞分别移植入模型大鼠左侧脑内,右侧移植未标记的神经干细胞.主要观察指标:对标记细胞进行普鲁士蓝染色、电镜观察.细胞活体移植后1,5,14 d体内磁共振示踪.结果:菲立磁可以高效率地标记神经干细胞,普鲁上蓝染色显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记神经干细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒,电镜结果显示非立磁-多聚赖氮酸复合物标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡.磁共振成像检查发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变,移植第5天低信号物质沿胼胝体腹侧迁移.在移植第14天,对称平行的两个针道已经基本看不见,病灶侧侧脑室部位低信号物质向对侧迁移,左侧侧脑室部位低信号物质基本看不见.结论:菲立磁经多聚左旋赖氨酸转染后可体外标记神经干细胞,标记后体内移植的神经干细胞可以在磁共振上产生明显的低信号改变.     

体外菲立磁标记恒河猴骨髓基质细胞自体移植入纹状体后磁共振对标记细胞形态学的示踪观察

目的:体外菲立磁标记的骨髓基质细胞经单细胞悬液微移植后,观察将其在恒河猴纹状体的存活、迁移、分化和整合状况,为细胞移植治疗疾病奠定基础。方法:实验于2004-04/2005-05在南方医科大学珠江医院全军神经医学研究所和解放军第四军医大学神经科学研究所完成。纳入健康恒河猴3只,离恒河猴骨髓基质细胞,利用神经干细胞培养基、白血病抑止分因子和碱性成纤维母细胞生长因子进行细胞扩增并诱导成骨髓基质源神经干细胞,再经体外菲立磁和活细胞荧光染料PK67标记后,采用微移植的方法,通过脑立体定位仪上用微玻璃针将干细胞分别植入脑纹状体内。细胞移植后1,4,8周应用核磁共振成像对脑内移植的细胞进行活体示踪,最后利用光镜和电镜观察标记细胞在脑内的形态学情况。结果:①体外菲立磁标记结果:骨髓基质细胞经微移植后可在脑内纹状体区域存活,移植的干细胞可向周围的脑实质内迁移和整合,迁移细胞沿特定的纹状体结构分布,少量细胞可分化成神经元。②核磁共振成像检查结果:发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变,未标记细胞侧脑组织无明显的低信号改变,与组织学切片结果基本相一致。结论:髓基质源神经干细胞移植后,可在脑内存活、迁移、分化和整合,骨利用核磁共振成像技术可以对脑内移植后的标记细胞进行初步的活体追踪。     

人骨髓间质干细胞的体外菲立磁标记

背景: 常规干细胞示踪的检测方法,需取实验动物组织进行检查,缺乏示踪的动态检测和无创性.目的: 通过体外菲立磁标记骨髓间质干细胞并进行磁共振成像扫描,明确不同浓度菲立磁对人骨髓问质干细胞细胞活性的影响和检测菲立磁标记的最佳浓度,并筛选出适合人骨髓间质干细胞磁共振成像扫描的成像序列.方法: 使用不同质量浓度菲立磁(100,50,25,12.5 mg/L)与生长状态良好第3代人骨髓间质干细胞孵育24～48 h,另设未进行标记的第3代细胞为空白对照组.两组细胞进行四甲基偶氮唑蓝法检测增殖生长情况并描绘生长曲线.细胞普鲁士蓝染色鉴定人骨髓间质干细胞的标记情况.进行磁共振成像检测,确定最佳磁共振成像序列.结果与结论: 质量浓度≤25 mg/L的菲立磁标记对人骨髓间质干细胞的增殖能力不会产生影响,并且以25 mg/L的标记效果最佳.而≥50 mg/L的菲立磁标记则明显抑制人骨髓间质干细胞的增殖.磁共振成像扫描显示菲立磁标记24,48 h或子代的人骨髓间质干细胞标本T1WI、T2WI以及T2*WI 3个序列上均可见信号降低,以T2*WI变化最为明显.证实菲立磁可用于体外标记人骨髓间质干细胞连续性研究.菲立磁标记对人骨髓间质干细胞增殖能力的影响存在浓度相关性,25 mg/L为最佳标记浓度.磁共振成像T2*WI序列更适合追踪菲立磁标记的人骨髓间质干细胞.     

体外菲立磁标记恒河猴骨髓基质细胞自体移植入纹状体后磁共振对标记细胞形态学的示踪观察

目的：将体外菲立磁标记的骨髓基质细胞经单细胞悬液微移植后，观察其在恒河猴纹状体的存活、迁移、分化和整合状况，为细胞移植治疗疾病奠定基础。方法：实验于2004-04／2005-05在南方医科大学珠江医院全军神经医学研究所和解放军第四军医大学神经科学研究所完成。纳入健康恒河猴3只，分离恒河猴骨髓基质细胞，利用神经干细胞培养基、白血病抑止因子和碱性成纤维母细胞生长因子进行细胞扩增并诱导成骨髓基质源神经干细胞，再经体外菲立磁和活细胞荧光染料PK67标记后，采用微移植的方法，通过脑立体定位仪上用微玻璃针将干细胞分别植入脑纹状体内。细胞移植后1，4，8周应用核磁共振成像对脑内移植的细胞进行活体示踪，最后利用光镜和电镜观察标记细胞在脑内的形态学情况。结果：①体外菲立磁标记结果：骨髓基质细胞经微移植后可在脑内纹状体区域存活，移植的干细胞可向周围的脑实质内迁移和整合，迁移细胞沿特定的纹状体结构分布，少量细胞可分化成神经元。②核磁共振成像检查结果：发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变，未标记细胞侧脑组织无明显的低信号改变，与组织学切片结果基本相一致。结论：骨髓基质源神经干细胞移植后，可在脑内存活、迁移、分化和整合，利用核磁共振成像技术可以对脑内移植后的标记细胞进行初步的活体追踪。     

超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞

背景:一些研究者利用超顺磁性氧化铁对骨髓间充质干细胞进行标记,并利用MRI技术对标记细胞肝内、肾内移植后进行初步的活体示踪,但是,对于超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞后,对其存活、增殖以及分化是否有影响研究较少.目的:观察超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞后,对其存活、增殖以及向神经细胞的分化是否有影响.方法:使用超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓间充质干细胞,采用普鲁上蓝染色法鉴定其标记率、锥虫蓝染色法检测细胞活力、MTT法检测标记干细胞的细胞增殖活力,以1 mmol/Lβ-巯基乙醇及无血清DMEM培养液体外诱导标记细胞向神经细胞分化并用免疫组织化学奠定诱导后细胞、再次使用普鲁上蓝染色法鉴定神经细胞内的铁颗粒.结果与结论:普鲁士蓝染色对干细胞的标记率接近100%,锥虫蓝染色显示标记细胞的存活率为97%:MTT法检测发现标记干细胞的增殖活力与未标记干细胞相比差异无显著性意义(P>0.05):以β巯基乙醇诱导后大部分骨髓问充质干细胞分化为神经元样细胞、免疫组织化学阳性,再次普鲁士蓝染色显示铁颗粒位于神经细胞的细胞浆内.提示超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞后,对于干细胞的存活、增殖以及向神经细胞的分化无影响.     

SPIO标记猪脂肪干细胞的生物学特性与多向分化潜能及体外3.0TMR成像

背景:不同种类细胞的最佳化标记方案需要大量实验证明,而每种细胞对应标记策略的安全性检测至关重要.目的:应用超顺磁性氧化铁联合多聚左旋赖氨酸标记猪脂肪干细胞,探讨磁标记对细胞生物学特性和多向分化潜能的影响以及标记细胞体外3.0T MR成像特性.方法:五指山小型猪皮下脂肪分离培养脂肪干细胞;超顺磁性氧化铁-多聚左旋赖氨酸复合物标记液标记脂肪干细胞;应用3.0T MR对不同浓度标记细胞进行T1WI、T2WI及T2*WI序列体外成像.结果与结论:普鲁士蓝染色显示标记细胞胞质内含有多少不等的蓝染铁颗粒,细胞标记率近100%;标记细胞向心肌、骨、脂肪方向诱导分化成功;不同浓度标记细胞MR扫描显示,随细胞浓度升高,3种序列信号变化率均增加;相同浓度细胞T2*WI信号变化率最大,T1WI最小,同一浓度3种MR序列间信号变化率差异均有显著性意义(P < 0.01);3.0T MR成像能检测到至少1×106 L-1标记细胞.结果显示应用超顺磁性氧化铁联合多聚左旋赖氨酸标记方案可有效标记脂肪干细胞,不影响细胞活力、增殖及多向分化能力;T2*WI序列检测标记细胞最敏感.     

铁羧葡胺磁化标记大鼠骨髓间充质干细胞的有效性及安全性研究

目的:探讨超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)铁羧葡胺(SHU555A,商品名为Resovist)标记大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的有效性及安全性。方法:分离培养大鼠骨髓MSCs,将其与50μg/mL Resovist共孵育24 h,并暴露于中心表面磁感应强度0.6 T磁场,采用普鲁士蓝染色、细胞透射电镜、原子吸收分光光度法检测细胞标记效率,采用细胞增殖试验及细胞活力检查观察细胞的标记毒性。结果:大鼠MSCs经Resovist标记后,普鲁士蓝染色显示,细胞内均可见大量着色颗粒,标记率接近100%;电镜检查显示,胞质内有含铁致密颗粒囊泡,未见氧化铁对细胞微细结构的破坏和毒性作用;原子吸收分光光度法测定结果显示,细胞平均铁含量(21.77±3.62)pg。Resovist标记和外加磁场对细胞增殖能力、细胞活力均无明显影响。结论:Resovist标记大鼠骨髓MSCs高效、安全,在细胞磁靶向方面具有临床应用潜力。     

7.0TMRI体外标记Gd-DTPA对骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究MRI对比剂钆-二乙烯三胺五乙酸（Gd．DTPA）标记骨髓间充质干细胞（BMSC5）的可行性及标记之后体外MR成像示踪的可能性,材料与方法骨髓间充质干细胞由SD大鼠双侧股骨骨髓中获取,培养、传代并纯化细胞,采用临床通用Gd—DTPA增强剂标记骨髓间充质干细胞;透射电子显微镜观察标记情况,并用台盼蓝染色方法及噻唑监（MTT）法测定标记细胞的活力及增殖能力;对标记的细胞进行体外7．0TMR成像。结果透射电子显微镜可清晰观察到Gd-DTPA颗粒大部分存在于骨髓间充质干细胞细胞浆中,少许贴附于细胞膜上。台盼蓝染色方法证实标记之后细胞的存活率没有受到影响,MTT法证实标记之后对BMSCs增殖能力没有影响体外试管扫描示标记细胞呈高T1W1信号强度,并且持续时间较久.结论Gd—DTPA标记细胞之后,BMSCs的活性及增殖能力没有受到影响,并且透射电镜结果证实Gd—DTPA颗粒存在于细胞胞浆内,在细胞胞膜上也有Gd-DTPA颗粒存在。标记的BMSCs在休外检测到明显的MRI信号强度改变。Gd-DTPA可以作为一种示踪剂用来MRI示踪研究。     

超顺磁性氧化铁纳米粒子标记人骨髓和脐带间充质干细胞：

背景：优化人源细胞安全、有效的标记参数及细胞移植后的定位是评价其治疗效果至关重要的环节。目的：比较核磁影像对比剂超顺磁性氧化铁纳米粒子体外标记入骨髓和脐带间充质干细胞的细胞活率、标记效率及核磁共振T2＊WI成像的效果,优化标记细胞处理细节。方法：培养第3代人骨髓和脐带间充质干细胞,以5-30mg／L菲立磁（FeridexIV）结合硫酸鱼精蛋白标记细胞。结果与结论：人骨髓和脐带间充质干细胞标记前后细胞的存活率接近（P〉0．05）。以530mg／L菲立磁标记骨髓间充质干细胞的阳性标记率差异无显著性意义（P〉0．05）：而5mg／L菲立磁标记脐带间充质干细胞的阳性标记率与20和30mg／L菲立磁标记的差异有显著性意义（P〈0．05）：10mg／L菲立磁标记脐带间充质干细胞的阳性标记率低于骨髓间充质干细胞（P〈O．05）。当≥20mg／L菲立磁标记细胞时,2种来源的细胞悬液中均出现不易洗脱和过滤去除的氧化铁颗粒。标记后细胞在3.0T MR GRE T2＊WI扫描均见随菲立磁的浓度升高,信号强度减弱。提示这2种组织来源的间充质干细胞,以10mg／L的菲立磁硫酸鱼精蛋白复合物标记是安全有效的,可用临床T2＊WI的MR成像观察。     

SPIO标记浓度对BMSCs生物学特性的影响及体外MRI表现

目的：观察不同浓度超顺磁性氧化铁（SPIO）标记对干细胞生物学特性的影响及SPIO标记后BMSCs体外的MRI特征。材料与方法分离、培养SD大鼠的BMSCs,取第四代的BMSCs,通过流式细胞仪检测表面抗原。不同浓度的SPIO标记液标记BMSCs,通过普鲁士兰染色检测标记效率,台盼兰活细胞计数检测细胞活力,MTT法检测细胞增殖活性。通过MRI检查,观察体外不同浓度SPIO标记细胞的信号变化情况。结果 SPIO在25～50μg/ml的浓度范围可以安全、高效地标记BMSCs,不会影响BMSCs的表型、活力和增殖等生物学特性;当SPIO浓度在75μg/ml以上时,BMSCs活性及增殖能力逐渐降低。随着SPIO标记浓度的增加,细胞内摄入的铁逐渐增多,而T2信号强度则逐渐降低;当SPIO浓度≥50μg/ml,标记细胞的T2信号强度与普通BMSCs相比较均有明显差异（P〈0.05）。结论适当浓度的SPIO标记BMSCs对其生物学活性没有明显影响,且MRI扫描能够有效检测其信号变化。     

荧光活性染料DiI标记的大鼠骨髓基质干细胞生长增殖及其成骨分化

背景：目前关于骨髓基质干细胞的标记报道较多,各有其优缺点,寻找一种有效、简便的细胞标记与示踪的方法尤为关键。目的：观察经荧光活性染料DiI标记的大鼠骨髓基质干细胞生长增殖与成骨分化情况。设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-09/12在南方医科大学组织工程研究中心完成。材料：SD大鼠10只,由南方医科大学实验动物中心提供。DiI应用液为美国Molecular ProbeInc公司产品。方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞,加入无血清的DMEM制成细胞悬液,再加入1×109L-1的DiI应用液5μL,37℃下孵育25min,清洗离心后,加入DMEM高糖完全培养基,荧光显微镜观察细胞荧光强度及形态变化。另取传至第3代细胞,加入含地塞米松、维生素C、β-磷酸甘钠、体积分数为10%胎牛血清的成骨诱导剂进行诱导分化。主要观察指标：DiI标记后细胞形态变化,XTT比色法测定细胞增殖状况,细胞上清液中乳酸脱氢酶活性,成骨诱导后细胞碱性磷酸酶活性及成骨分化能力。结果：锥虫蓝染色见骨髓基质干细胞活力好,仅偶见蓝染细胞,荧光显微镜下DiI标记后全部细胞的胞浆、胞膜均显红色荧光,标记的骨髓基质干细胞呈梭形,胞浆丰富,保持了良好的正常形态,DiI标记阳性率为100%,标记早期细胞形态呈荧光环状,48h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光。与未标记细胞比较,DiI标记的骨髓基质干细胞增殖吸光度、培养上清液乳酸脱氢酶活性、碱性磷酸酶活性均无明显变化（P〉0.05）。成骨诱导7d后,钙钴法染色两组骨髓基质干细胞均见不同程度的胞质呈棕黑色改变。结论：DiI能有效标记体外培养的骨髓基质干细胞,并在细胞内稳定表达,且标记细胞形态良好,对活体细胞无毒性作用;此外,DiI标记不影响骨髓基质干细胞的生长、增殖及成骨分化能力。     

大鼠骨髓间充质干细胞的PKH26标记和示踪

背景：骨髓间充质干细胞标记是体内迁移分化研究的重要环节。目的：对大鼠骨髓间充质干细胞进行PKH26标记,探讨PKH26标记对骨髓间充质干细胞的生长特征、分化的影响及体内示踪情况。方法：培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞,第2代细胞按PKH26标记程序进行细胞标记,观察标记组和未标记组细胞的增殖、周期和凋亡情况,对标记组细胞行成骨成脂体外诱导分化。尾静脉移植PKH26标记细胞,6周后荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在子宫内膜的分布情况。结果与结论：PKH26标记对细胞增殖、凋亡和周期无明显影响,不影响成骨成脂诱导分化。子宫内膜组织中PKH26标记阳性的细胞分布于腺上皮和间质细胞。PKH26标记技术可用于示踪骨髓间充质迁移转归和干细胞移植方面的实验研究。     

不同种类超顺磁性氧化铁标记猪骨髓间充质干细胞的体外MR成像

背景:干细胞磁性标记是新近开展的一项干细胞体外标记技术,结合MR成像设备可以活体监控移植入体内的干细胞.目的:明确超顺磁性氧化铁粒子体外标记猪骨髓间充质干细胞的方法、不同种类超顺磁性氧化铁标记细胞经MR成像的特征及可成像的最低标记细胞量.设计、时间及地点:对比观察,于2006-09/2007-03在苏州大学医学部心血管外科实验室及苏州大学附属第一医院影像中心完成.材料:猪髂骨骨髓由太湖梅山猪新鲜采集:超顺磁性氧化铁纳米颗粒为德国Schering公司产品;超微型超顺磁性氧化铁纳米颗粒由苏州大学化学与化工学院提供:铁颗粒晶核表面包被葡聚糖,3种超微型超顺磁性氧化铁包被葡聚糖后根据颗粒大小(12,15,20 nm)分别依次简称为1#,2#,3#.方法:分离、纯化、培养猪骨髓间充质干细胞,体外进行不同种类超顺磁性氧化铁标记,染色及荧光显微镜观察;测量并绘制未标记细胞和标记细胞的MTT生长曲线;选取不同的细胞量组(Feridex标记细胞分别选取1×106、5×105及1×105L-1量组,未标记细胞选取5×105L-1量组,1#、2#及3#超微型超顺磁性氧化铁标记细胞均选取5×105L-1量组)进行标记后MR成像,测量不同扫描序列标记细胞管的信号强度改变,并进行统计学分析.主要观察指标:超顺磁性氧化铁标记干细胞的普鲁士蓝染色检测标记率:标记干细胞的MTT生长曲线;双染色法检测细胞凋亡;不同Ependoff管内细胞团T1WI、T2WI和FFE图像的信号强度.结果:应用多聚赖氨酸介导干细胞磁标记方法标记骨髓间充质干细胞有效率为100%,普鲁士蓝染色见细胞浆内有多少不等的蓝染铁颗粒;超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在T2WI尤其是FFE(T2WI)序列信号明显降低;在25 mg/L Fe培养液标记浓度下,MR成像的最低细胞量为1×105;在不同种类超顺磁性氧化铁标记下,2#、3#USPIO与Feridex在T2WI及T2*WI上有显著性差异(P<0.01);而1#USPIO与Feridex在T2WI及T2WI上差异无显著性意义(P>0.05):Feridex标记间充质干细胞在T2WI及T2WI上与T1WI相比,差异均有显著性意义(P<0.01).结论:超顺磁性氧化铁可以简便标记间充质干细胞并且在适当浓度下对间充质干细胞的生物学活性没有影响,MR T2WI和T2*WI序列可敏感显像磁性标记的干细胞.     

嗅鞘细胞体外CFSE染色的标记方法研究

目的:建立荧光活性染料CFSE以适宜终浓度标记体外培养的嗅鞘细胞的染色方法。方法:CFSE以2、5、10μM 3种不同终浓度标记原代培养的嗅鞘细胞,通过流式细胞术、台盼蓝染色和荧光显微镜,检测和观察CFSE染色的阳性细胞率、细胞活力、生长形态特点和增殖情况。结果:3种终浓度CFSE标记嗅鞘细胞的阳性标记率均>99%;2μM CFSE标记的细胞活力最高(P<0.05),细胞生长增殖较快,但随时间推移荧光强度明显减弱。结论:CFSE可用于标记嗅鞘细胞,本研究条件下,2μM的终浓度较为适宜。     

Gd-DTPA标记骨髓间质干细胞在脊髓损伤模型中的磁共振示踪研究

目的 探讨用钆-二乙烯三胺五乙酸(Gd-DTPA)标记大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)用于细胞示踪的可行性.方法 用jetPEITM-FluoF结合Gd-DTPA形成顺磁性颗粒,标记MSCs,电镜观察标记情况,并用MTT法测定标记细胞的活力.对标记的细胞进行体外和大鼠脊髓内磁共振成像(MRI).结果 Gd-DTPA可高效标记MSCs,同时对MSCs生长无影响.体外及MSCs移植大鼠脊髓损伤模型MRI T1wI均显示,标记细胞呈高信号强度.结论 Gd-DTPA成功标记的MSCs在体外和大鼠脊髓组织内均可检测到明显的MRI信号强度改变.Gd-DTPA可以用于MSCs标记的MRI示踪.     

超顺磁性氧化铁和DAPI双标记骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞目前已经成为重要的组织工程种子细胞,而若想深入研究其在体内外增殖、分化的规律,首先需要解决如何能高效、安全地标记骨髓间充质干细胞。目的：观察超顺磁性氧化铁及DAPI对大鼠骨髓间充质干细胞的双标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响。方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用超顺磁性氧化铁及DAPI双标记后分别用普鲁士蓝染色法和激光共聚焦显微镜观察其铁标记率及荧光标记率。用锥虫蓝检测细胞活力;MTT法检测标记干细胞增殖力;Calcein-AM/PI以及AO/PI双染细胞,检测细胞存活率以及凋亡率。结果与结论：超顺磁性氧化铁及DAPI在体外双标记大鼠骨髓间充质干细胞效率高,可达100%;锥虫蓝染色显示标记细胞的存活率为97%;MTT法检测发现双标记干细胞组的活力以及增殖力与未标记干细胞组相比差异均无显著性意义（P〉0.05）;Calcein-AM/PI染色,未标记细胞及双标记细胞的存活率分别为96%和95%;AO/PI染色,未标记及双标记细胞的凋亡率均为1%。提示超顺磁性氧化铁和DAPI双标记大鼠骨髓间充质干细胞后,对于干细胞的存活、增殖以及凋亡无影响。