蛋白激酶C抑制剂GF109203X诱导角质形成细胞去分化形成表皮干细胞的初步研究

目的探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂GF109203X诱导角质形成细胞去分化形成表皮干细胞的可能性。方法采用酶消化法结合Ⅳ型胶原快速贴壁法获得人原代表皮干细胞及角质形成细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,免疫细胞化学染色法检测GF109203X诱导培养后角质形成细胞的表型及功能改变。同期分离培养的人在体表皮干细胞作为本次实验的阳性对照,原代角质形成细胞培养2 d后加等体积二甲基亚砜为阴性对照。结果表皮干细胞快速黏附,培养4 d后细胞呈圆形,形态规则,折光性强,明显克隆,β1整合素、CK19及CK14呈阳性表达,CK10阴性表达;已分化角质形成细胞不能快速黏附,培养4 d细胞呈类圆形,大小不一,折光性较差,无明显克隆,β1整合素、CK19及CK14呈阴性表达,CK10呈阳性表达。角质形成细胞经GF109203X诱导培养2 d后,实验组与阳性对照组细胞群β1整合素、CK19、CK14均呈阳性表达,但实验组较阳性对照组中细胞β1整合素、CK19、CK14阳性细胞数少,CK10均呈阴性表达;阴性对照组中细胞群β1整合素、CK19及CKl4呈阴性表达,CKl0呈阳性表达。结论 GF109203X能够诱导角质形成细胞去分化形成表皮干细胞。     

不同年龄人群毛囊干细胞K19和β1整合素表达的比较

探讨毛囊干细胞表面的K19、β1整合素是否随年龄增长表达减少而影响隆突区干细胞数目.采用粘附法分离毛囊干细胞,经免疫荧光染色后,从毛囊纵切面隆突区荧光染色强度反映干细胞密度.结果:免疫荧光染色后,青年组荧光染色强度明显强于老年组.隆突区毛囊干细胞(β1整合素/K19)随年龄增长而表达明显减少.     

毛囊干细胞研究进展

干细胞是一类具有高度增殖潜能和终生无限的自我更新能力的细胞亚群,毛囊干细胞主要位于毛囊隆突部位,能表达β1整合素,角蛋白(Keratin)K15、K19,转录因子p63等特异性表面标记,据此可以对其进行鉴定和分离。研究毛囊干细胞如何增殖与分化及其调控机制,不但有实现以毛囊干细胞作为种子细胞构建组织工程化皮肤及毛囊来分别治疗皮肤缺损和脱发的重大意义,而且也为治疗某些棘手的皮肤、毛囊疾病带来了希望。     

人表皮干细胞的体外培养与MSCs对其诱导的初步研究

目的：探讨人表皮干细胞体外分离培养的理想方法，初步研究骨髓间充质干细胞（MSCs）上清对其生长的影响。方法：采用中性蛋白酶-胰蛋白酶两步法收获表皮细胞，Ⅳ型胶原快速粘附分选表皮干细胞，用无血清培养基进行体外培养，采用SABC—FITC进行培养细胞鉴定。结果：胎儿皮肤和人包皮皮肤均可成功分离到表皮干细胞集落，且增殖能力强，细胞表达Bl整合素和角蛋白CK19。MSCs上清形成的条件培养基的诱导下，收集的表皮细胞形成花环样克隆，并形成成纤维样细胞。结论：用酶消化法、胶原快速粘附和无血清培养法是较理想的体外分离培养表皮干细胞的方法，MSCs可以诱导表皮细胞的定向分化。     

毛囊各细胞体外的不同分离、培养及其生物学特性

目的进行毛囊各主要生长细胞的体外分离、培养及生物学特性的观察。方法对人头皮毛囊组织进行体外钝行分离、组织块法及酶消化来获得毛囊外根鞘细胞（ORSC）、毛乳头细胞（DPC）、毛囊真皮鞘细胞（DSC）,利用不同的体外培养条件分别对这三种细胞进行体外增殖培养,利用倒置显微镜及免疫组化的方法对细胞来源和生长特性进行观察。结果组织块法培养的上、下段毛囊：上段毛囊来源的ORSC增殖生长速度较下段毛囊ORSC快;酶消化法分离得到的ORSC,利用K-SFM培养液进行培养,整体细胞生长呈典型的“铺路石”样结构,可传4代;酶消化法分离得到的DSC,利用10％～15％低糖培养液进行培养,单个细胞生长状态呈长三角形,可传三代;经酶消化法,每3cm×3cm大小的头皮可以获得约500个完整毛乳头,利用10％～15％低糖培养液进行DPC培养,细胞由毛乳头边缘向四周呈放射状生长,成功传代8代,四代内的细胞“聚集性”生长状态明显。免疫组化细胞鉴定：ORSC CK19免疫组化染色呈阳性;DPC浆抗波形丝蛋白呈阳性显色;DSC胞浆内高表达波形丝蛋白。结论组织块法证明毛囊上段细胞生长情况更为活跃,再次验证毛囊干细胞可能存在于毛囊上段“隆突部”的假说;经钝行分离和酶消化法结合的方法来进行人头皮毛囊相关细胞的分离和培养,所获得三种细胞的细胞活性、生长增殖情况均较好,细胞鉴定证实细胞来源的可靠性。     

快速贴壁法分离小鼠皮肤干细胞的研究

目的 探讨小鼠皮肤干细胞分离和体外培养的方法.方法 利用快速贴壁法分离、培养皮肤干细胞,K15、β1整合素和CD34鉴定皮肤干细胞.结果 皮肤干细胞密度大,细胞呈圆形或多角形,细胞形态清晰,胞质均匀,可见有核分裂细胞,核质比例大.免疫组化显示K15、β1整合素胞质染色阳性,染色率为100％.CD34染色阴性.结论 利用快速贴壁法分离培养出来的皮肤干细胞符合干细胞的特性,是一种简易可行的方法.CD34表达阴性也从侧面说明了皮肤干细胞的多样性.     

应用表皮干细胞与去表皮的真皮体外构建组织工程皮肤

目的 用人皮肤表皮干细胞 （ESCs）接种至同种去表皮的真皮上，体外构建组织工程皮肤。方法 用两步酶消化法分离获得角质形成细胞，并用Ⅳ型胶原快速粘附法筛选ESCs并培养；进行细胞形态学观察和用免疫组化法对ESCs进行鉴定；将ESCs接种至去表皮的真皮上浸没培养7 d后转成气-液面培养，4周后取培养的组织工程皮肤切片分别做HE染色和角蛋白的免疫组化染色。结果 培养的ESCs呈铺路石样、克隆状生长；角蛋白K19和β1-整合素的免疫组化染色阳性。培养5周的组织工程皮肤可见有3 ～ 6层细胞，并可见角质层，表皮角蛋白染色阳性。结论 应用人皮肤的ESCs与去表皮的真皮可以体外构建组织工程皮肤。     

毛发研究的新模型——猪毛囊体外培养的研究

目的：对猪毛囊体外无血清培养的条件和方法进行了研究，并就其在体外培养中对环孢素A(CsA)、胰岛素生长因子-1（IGF-I）和转化生长因子β-1（TGF-β）的反应性进行观察。结果发现：（1）猪毛囊在Williams E加L-谷酰氨等成分的培养基上生长良好，从而建立了猪毛囊体外无血清培养模型，并使毛囊分离和培养的方法标准化。建立的猪毛囊体外培养模型毛囊生长曲线与人毛囊非常相似。（2）体外培养的猪毛囊对CsA、IGF-I和TGF-β1均有敏感的反应性，反应浓度与人毛囊体外培养的浓度相似。（3）猪毛囊体外培养中CsA明显促进毛囊细胞分裂增殖和抑制毛囊细胞凋亡。所以猪毛囊体外培养模型是研究毛囊生理较好的方法。     

不同培养条件对皮肤角质形成细胞和成纤维细胞增殖的影响

目的观察含不同血清浓度培养基对皮肤角质形成细胞和成纤维细胞体外活性的影响。方法体外培养、扩增皮肤角质形成细胞和成纤维细胞,按3×10^5／ml的密度接种于96孔板,加入含不同血清浓度的K-SFM培养基培养。并用MTY比色法观察细胞活性。结果应用K—SFM＋10％FBS组培养基培养成纤维细胞与DMEM＋10％FBS为对照组培养细胞的活性影响相同（P〉0．05）;应用K-SFM＋1％FBS培养基培养角质形成细胞与K—SFM为对照组培养细胞的活性影响相同（P〉0．05）;结论在构建人工皮肤体外模型时,角质形成细胞和成纤维细胞可分别加用含1％FBS、10％FBS的K—SFM培养基进行培养。     

毛囊干细胞与组织工程研究进展

毛囊干细胞研究取得突破性进展的标志是由孙同天、Lavker和Cotsarelis等提出了隆突激活假说,明确了其定位的部位,是少数几种成体干细胞首先被明确定位的干细胞之一,并逐步得到了验证。毛囊干细胞不仅可以分化为毛囊上皮细胞,而且可以分化为皮脂腺细胞、表皮角质形成细胞,其分化过程是干细胞分化为短暂倍增细胞,最后分化为终末分化细胞。近年来进一步证明了毛囊隆突部也是多种干细胞的居住地,包括黑素干细胞,和毛囊干细胞存在同步化激活的机制。Wnt/β-catenin是毛囊发育、再生循环的基本信号通路,使毛囊在再生过程出现着色一致的毛发。诱导和重建毛囊形成是组织工程皮肤最主要的目标之一,毛乳头细胞的凝集性生长特性是诱导毛囊形成的条件,因此,维持毛乳头细胞凝集性生长特性主要有细胞团块法、低黏附性培养板(或高分子材料膜)法、悬滴培养法和胶原凝胶成球法,以实现体外重建毛乳头的目的。毛囊组织工程在体外还不能真正诱导形成,现有的毛囊再生或新生的成功方法还是须移植到动物体内,才能形成完整毛囊并产生毛发。主要方法有移植小室法、混合游离细胞注射法和皮瓣法。诱导毛囊形成比较成功的细胞是啮齿类动物来源的胚胎或新生鼠毛囊细胞和人胚胎毛囊细胞,成年人头皮毛囊来源细胞目前仍未能诱导出毛囊新生或再生。     

复方透骨草酊对睾酮的抑制及促进毛发生长作用的初步研究

目的 探究复方透骨草酊对睾酮诱导的C57BL/6病理脱发模型小鼠的性激素水平、毛发生长及毛囊细胞凋亡情况的作用.方法 将40只小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、米诺地尔酊组、复方透骨草酊组,分别在脱毛区外给药,摘眼球取血法检测小鼠血清睾酮、雌二醇、双氢睾酮水平,原位杂交技术原位末端标记法(TUNEL)评价毛囊细胞凋亡...     

人头发毛囊外根鞘中有二个不同的K19阳性区:干细胞储库的统一假说?

至今，人生长期毛囊中干细胞的定位依靠三种互补的检查方法：即检测缓慢周期生长细胞、高集落形成细胞和分化细胞的免疫组化染色。由于干细胞既可以是位于隆突部位的长期标记的保留细胞，也可以是位于毛囊下三分之一处的高集落形成细胞，所以这些技术往往产生相互矛盾的结果。为了阐明毛发生长周期中人毛囊干细胞的分布情况，我们研究了通常被认为是上皮干细胞标志的细胞角蛋白19(K19)的表达。发现人生长期毛囊中有两个干细胞储库，分别位于毛囊的上、下三分之一处。这两个储库在毛囊的退行期一休止期的过渡阶段发生融合，在新形成的生长期毛囊中再次分开。     

齐墩果酸对体外培养人毛囊干细胞增殖的影响

目的:探究齐墩果酸对人毛囊干细胞增殖活性的影响。方法:取术中毁弃的人全层头皮标本,使用两步酶消化法分离提取毛囊干细胞进行体外培养,运用免疫荧光K15染色鉴定;将细胞以5×10~4个/mL的密度接种于96孔板,培养液中分别加入1×10~(-4)、1×10~(-3)、1×10~(-2)、0.1、1μg/mL梯度浓度齐墩果酸,于处理的24 h及48 h使用MTT法检测毛囊干细胞活性。结果:获得的毛囊干细胞呈典型的铺路石状生长,免疫荧光K15阳性,阳性率为(86.7±5.2)%(n=4)。与空白组相比,1×10~(-4)μg/mL及1×10~(-3)μg/mL齐墩果酸处理组在24 h及48 h的OD_(490)均有明显升高(P<0.05)。结论:齐墩果酸能够促进体外培养的人毛囊干细胞增殖。     

皮肤科学基础

20120001 人原代表皮干细胞及其传代细胞生物学特性的比较/王元元(三军大大坪医院野战外科研究所皮肤科重庆市创伤愈合与组织工程研究所),杨桂红,杨涛…//第三军医大学学报.-2011,33(1).-24 ～27选择2009年5 -12月在该科医学美容门诊行包皮环切术后的包皮标本共20例,从包皮标本获得人原代表皮干细胞,利用0.25％胰蛋白酶冷消化4h获得传代细胞,利用CASY系统计数后计算细胞的黏附率,倒置相差显微镜下观察原代干细胞及传代细胞的形态学变化,观察干细胞表面标志物整合素β1和CK19,细胞分化的表面标志物CK10的表达,以及各代细胞基因组的表达差异.结果:原代干细胞的黏附率为(55.44±2.42)％,随着传代次数的增加,2代、4代及6代细胞的黏附率分别为(44.30±2.76)％,(30.95±2.24)％和(20.64±1.37)％,与原代细胞相比,差异有统计学意义(P＜0.05).细胞生长融合时间随着传代次数而增加.各代细胞均表达整合素β1;原代、2代及4代细胞表达CK19,但6代细胞不表达CK19;部分6代细胞表达CK10.原代及4代细胞基因组比较结果相近,但与6代细胞结果差异较大.提示与原代干细胞相比,体外培养的人表皮干细胞在4代以后生物学特性发生改变,体外实验宜选用4代以前的细胞.     

复方青黛饮含药血清对体外HaCaT细胞增殖和凋亡的影响

目的体外观察复方青黛饮大鼠含药血清对人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,并探讨其作用机制。方法根据中药血清药理学方法,用SD大鼠制备实验血清,采用MTT法、流式细胞术、免疫荧光Hoechst染色,观察含药血清对细胞生长抑制率、凋亡率、细胞周期分布及细胞形态学的影响。结果体外培养HaCaT细胞24h和48h后,复方青黛饮高、中、低三个剂量不同浓度的含药血清组,对HaCaT细胞的生长均有不同程度的抑制,与空白血清组相比,差异有统计学意义(P<0.05),其中高剂量组抑制作用最明显。复方青黛饮含药血清组细胞凋亡率和G0/G1比例明显增加,与空白血清组相比,差异有统计学意义(P<0.05),在镜下呈现凋亡的特征性形态改变。结论复方青黛饮大鼠含药血清对体外培养的角质形成细胞株HaCaT细胞有生长抑制和诱导凋亡作用,并对细胞周期有一定的影响。     

系统性红斑狼疮患者皮损及血清粘附分子的检测

目的：探讨血管内皮细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、细胞黏附分子-1（VCAM-1）、sE-选择素水平在皮损表达及血清水平与系统性红斑狼疮（SLE）活动性的关系。方法：用ELISA试剂盒测定血清细胞黏附分子,应用SABC免疫组化技术检测细胞黏附分子的表达。结果：实验组血清可溶性ICAM-1（sICAM-1）和可溶性VCAM—1（sVCAM-1）的水平均较高于对照组,差异有统计学意义（均P〈0．01）;实验组活动期ICAM-1水平较非活动期升高（P〈0．01）。SLE患者活动期皮损血管内皮细胞ICAM-1、VCAM-1、E-选择素的表达高于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。SLE血管内皮细胞各黏附分子表达的水平依次为VCAM-1〉ICAM-1〉E-选择素。结论：VCAM-1、ICAM-1、E-选择素等粘附分子可能在SLE的发生、发展中起重要的组织损伤作用。     

胎儿皮肤β1整合素与基质金属蛋白酶-2及其组织抑制因子-2表达的意义

目的：探讨胎儿皮肤中β1整合素与基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和基质金属蛋白酶组织抑制因子-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）表达的意义。方法：选取11-25周胎儿背部皮肤25例，采用苏木精-伊红染色、免疫组化和反转录（RT）-PCR分别从蛋白质、mRNA水平检测B1整合素与MMP-2及TIMP-2的表达情况。结果：13—21周胎儿的皮肤表皮由3层逐渐发展为4层，毛囊和皮脂腺等皮肤附属结构由开始发育到结构的形成，基底层细胞β1整合素均为阳性，表皮外层角蛋白（K）10染色阳性细胞数逐渐增多，胎龄11～13周与23—25周时相比差异有统计学意义（P〈0．01）。MMP-2与TIMP-2表达水平均呈逐渐升高趋势，两种基因在胎龄11～13周与23—25周时相比差异均有统计学意义（P=0．000）。结论：人胎儿期表皮基底层增殖细胞主要为表皮干细胞，随胎龄增加，终末分化细胞的比例明显增高。MMP-2和TIMP-2对皮肤的生长发育、结构功能的维持具有重要的调节作用。     

人毛囊干细胞的定位及增殖特性

目的 探讨人毛囊干细胞定位和增殖特性.方法 取人枕部头皮毛囊进行角蛋白19(K19)免疫组化染色,并测量阳性段距毛囊下端的距离;将包含毛球部上方阳性段的毛囊上皮组织分别置于含有和不含有间质细胞的凝胶表面气液界面培养,当出现增殖灶时,测量其距毛囊下端的距离,分析K19阳性部位与培养出现的增殖灶之间的关系,并通过透射电镜观察增殖灶的超微结构.结果 人枕部头皮毛囊有两个K19阳性区域,即隆突部和毛球部上方一段外根鞘,毛囊下段上皮组织只在含有间质细胞的凝胶表面培养时毛球部上方出现一增殖灶,统计学分析支持毛球部上方的K19阳性部位和毛囊下段上皮组织培养出现的增殖灶为同一部位.透射电镜显示增殖灶含有幼稚细胞、成熟角质形成细胞和凋亡细胞.结论 人头皮毛囊可能有两个干细胞库,即隆突部和球部上方外根鞘的一个局限区域,干细胞的增殖需要间质细胞(如毛乳头细胞)的存在,增殖的干细胞可能向形成新的干细胞、成熟角质形成细胞和凋亡细胞三个方向演变.     

生肌白玉膏对大鼠深Ⅱ度烧伤创面β1整合素及角蛋白19的影响

目的探讨生肌白玉膏对大鼠深Ⅱ度烧伤创面β1整合素及角蛋白19阳性细胞数量和分布的影响及其与创面愈合之间的关系。方法制备深Ⅱ度烫伤大鼠模型。分别在药物治疗组、阳性对照组、模型组创面涂抹生肌白玉膏、美宝湿润烧伤膏、生理盐水,正常对照组不涂任何药物,第3,7,14,21天比较三组创面愈合率及β1整合素及角蛋白19阳性细胞数量和分布。结果第3天三组β1整合素及K19阳性细胞数比较差异无统计学意义(P0.05);第7,14,21天药物治疗组与模型组比较差异有统计学意义(P0.05),阳性对照组与模型组差异有统计学意义(P0.05),药物治疗组与阳性对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。创面内表皮干细胞的数量与创面愈合率的关系呈正相关。结论生肌白玉膏调节皮肤创面组织中β1整合素及角蛋白19的表达,对烧伤创面的修复有促进作用。     

皮肤科学基础

20 0 2 2 74 4　表皮干细胞体外分离和培养 /李建福 (解放军第 30 4医院 )…∥解放军医学杂志 .- 2 0 0 2 ,2 7(5 ) .-386～ 387采用酶消化法把幼鼠表皮制成单细胞悬液 ,以表皮干细胞培养基置孵箱培养。再经消化接种于鼠 型胶原包被的培养瓶中 10～ 15 min,留快速贴壁细胞继续培养 ,可见克隆性生长 ,电镜示非成熟细胞特性 ,β1整合素、k19阳性 ,具备干细胞的特征。图 2参 7　 (卢涛 )2 0 0 2 2 74 5　不同发育阶段人皮肤表皮干细胞增殖分化特征及其与创面修复结局关系的研究 /赵志力 (解放军30 4医院 )…∥解放军医学杂志 .- 2 0 0 2 ,2 7(5 ) .- 388～389妊娠 2 2～ 2 4周龄胎儿皮肤 β1整合素和 k19染色均强阳性 ,4～ 12岁少儿表皮基底层 6 0 %～ 80 %表达β1整合素和 k19,35～ 5 3岁成年人基底层二指标进一步减少 ,染色较弱。这种差异可能与同期皮肤损伤的完全和不完全修复有关。图 3表 1参 7　 (卢涛 )2 0 0 2 2 74 6　表皮生长因子、基质金属蛋白酶与汗腺发生相关性的实...