人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析

背景:现有的外泌体蛋白组学研究中,只有不同来源外泌体或者不同条件下分泌的外泌体之间的蛋白组学对比,没有外泌体和其母体细胞之间的对比分析。目的:对人脐带间充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学分析。方法:培养人脐带间充质干细胞并采用超滤序贯超离法提取外泌体,通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、蛋白质定量、蛋白质印迹法及蛋白组学分析等技术鉴定。结果与结论:(1)提取的外泌体分散度较好且均一,多为杯状圆形或类圆形的膜性小囊泡,可见囊泡的双膜性结构,中央为低电子密度成分,分布较集中且边界清晰;(2)外泌体粒径分布峰值为(129.5±8.7) nm,膜表面带负电荷,浓度为8.375×1010粒子/mL,平均zeta电位为(-28.1±3.6) mV;(3)外泌体有特征性膜蛋白CD9、CD63的表达;(4)蛋白组学分析外泌体中高表达的蛋白质大多参与RNA剪接、mRNA加工、蛋白折叠等生物过程,参与RNA/DNA等遗传物质及蛋白质的合成、加工、降解过程,参与组成多种细胞器及亚细胞膜结构,参与多条信号通路、细胞黏附、细胞外基质受体相互作用,与多种疾病和病毒致癌也密切相关;(5)通过分析认为外泌体与其母...     

胎盘间充质干细胞来源人工外泌体的一种制备方法

目的探讨一种利用小鼠胎盘间充质干细胞(mPMSCs)制备人工外泌体的方法。方法采用胶原酶消化法从小鼠胎盘组织中分离培养mPMSCs,采用流式细胞仪检测细胞表面抗原,鉴定其多向分化潜能;利用机械挤压法使mPMSCs依次通过孔径为10、5、1μm的径迹蚀刻膜,经离心纯化后得到人工外泌体;采用超速离心法分离mPMSCs来源的外泌体,并采用透射电镜对比观察形态结构、纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)检测粒径和浓度、蛋白免疫印迹法检测表面标志物。结果通过胶原酶消化法分离培养的小鼠mPMSCs,形态呈长梭型,较为均一,细胞表面高表达CD29、CD44、CD105,不表达CD45、CD34,具有成骨、成脂细胞诱导分化潜能;通过机械挤压法制备得到的人工外泌体在电镜下形态呈圆球形囊泡状,与mPMSCs来源外泌体形态类似;人工外泌体平均粒径为(130.7±5.7)nm,浓度为(5.01±1.08)×10~(11) particles/mL,mPMSCs来源外泌体粒径为(146.7±4.9)nm,浓度为(4.34±0.97)×10~9 particles/mL;蛋白免疫印迹法检测得到人工外泌体和mPMSCs来源外泌体表面均表达抗原CD63、CD81和Tsg101。结论通过机械挤压法可较高效获得人工外泌体,该人工外泌体与通过超速离心法提取得到的mPMSCs来源外泌体具有相似的生物学特性,这为后期将其作为药物载体奠定了一定的研究基础。     

间充质干细胞外泌体治疗肺部疾病的研究进展

间充质干细胞来源的外泌体(MSC-EXOs)携带着脂质、蛋白、核酸等信号物质,在细胞间通讯、免疫调节、血管再生中发挥着重大作用。MSC-EXOs在肺动脉高压、肺纤维化等肺部疾病中通过调控不同的信号通路、减少细胞炎性反应、调节免疫细胞功能、改善线粒体功能、促进血管生成、减轻肺血管重构等途径改善肺组织的功能,治疗肺部疾病,从而为今后难治性肺部疾病的治疗提供新思路。     

间充质干细胞源性外泌体的检测方法

文题释义：外泌体：早期由多泡体通过膜内陷包裹内容物形成并在多泡体与细胞膜融合过程中被释放到胞外,是一类粒径为30-120 nm,内含来源细胞中部分蛋白质、核酸、脂质等成分的蝶形膜性囊泡。外泌体能分泌及转运多种生物活性成分并参与一系列生理病理过程。间充质干细胞源性外泌体：由间充质干细胞旁分泌所得,具有来源细胞的特性。间充质干细胞源性外泌体能促进受损区域细胞自我修复与组织再生,恢复组织内稳态,加速创面修复。不仅如此,间充质干细胞源性外泌体在血管损伤修复、急性肺损伤、缺血性脑卒中、骨关节炎、心肌梗死等各个系统疾病中都具有重要作用。背景：间充质干细胞源性外泌体因其众多优点被应用于多种疾病的诊断与治疗,因此精确有效以及低成本检测出间充质干细胞源性外泌体对将来疾病的诊断和治疗至关重要。目的：对间充质干细胞源性外泌体检测方法以及最新进展做一介绍。方法：检索万方、百度学术、维普、CNKI、PubMed、Web ofScience、Sinomed、Embase、Cochrane、Web of Knowledge等数据库1997年6月至2019年6月期间关于间充质干细胞源性外泌体检测方法的文献,检索词分别为“间充质干细胞”“外泌体”“检测方法”和“mesenchymalstem cells”“exosomes”“detection methods”。排除重复与相关性弱的文献,将检索到的文献进行整理,共纳入60篇文献来进行分析。结果与结论：①总结了间充质干细胞的定义、生物学特性及其旁分泌作用;②总结了间充质干细胞源性外泌体的定义、生物学特性及其在临床治疗中较好的应用前景,例如调节机体免疫功能、促进受损组织再生等;③总结了目前对间充质干细胞源性外泌体常用的检测方法以及最新研究进展;④上述研究为临床应用间充质干细胞源性外泌体治疗疾病及在组织损伤修复中发挥作用提供实验基础。ORCID:0000-0003-3297-2587(杨沁馨)中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

不同来源间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎疗效的比较

背景:在过去的数十年中,间充质干细胞作为组织工程种子细胞,在骨关节炎治疗中展现出了强大的疗效,在国内已开展了多项临床注册试验。研究表明,间充质干细胞主要依靠旁分泌效应释放外泌体等载体在体内发挥治疗作用。目的:比较骨髓间充质干细胞来源外泌体和脐带间充质干细胞来源外泌体治疗骨关节炎的效果。方法:采用超速离心法提取骨髓间充质干细胞来源外泌体和脐带间充质干细胞来源外泌体,采用透射电镜、Nanosight和Western blot鉴定两种外泌体;采用白细胞介素1β与软骨细胞共培养体外模拟骨关节炎环境,通过CCK-8、Western blot、qPCR评估两种外泌体对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡和细胞外基质分泌的影响;建立Ⅱ型胶原酶诱导的大鼠骨关节炎模型,通过大体和组织学染色评估体内注射两种外泌体治疗骨关节炎的疗效,ELISA检测关节液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平。结果与结论:(1)两种外泌体在透射电镜下均为典型的圆形或杯状,粒径在105-120 nm之间,均表达CD63、CD81和TSG1010特征性蛋白;(2)脐带间充质干细胞来源外泌体的产量和纯度均高于骨髓间充质干细胞来源外泌体;(3)...     

低氧预处理间充质干细胞来源外泌体的应用进展

<正>间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一种具有自我更新和分化特性的多能细胞,分布于人体许多部位,包括骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带和胎盘等。干细胞疗法已经在许多临床前研究中得到了很好的证明,但其植入率低、植入副作用多的弱点促使人们寻找改进方法。外泌体是目前干细胞领域较热门的方向之一。外泌体是直径30～150 nm的生物纳米囊泡,     

间充质干细胞外泌体在眼部疾病中的研究进展

眼部疾病病因复杂且种类多种多样,主要包括眼眶、角膜、虹膜、视神经、视网膜等疾病,如果不及时治疗或处理不当会导致视力模糊,严重的会导致失明.手术和药物治疗存在一定的局限性.近几年,由于间充质干细胞(MSC)具有免疫调节和促进血管生成等特性,在许多眼部疾病的细胞疗法中被广泛探索.随着无细胞疗法的兴起,间充质干细胞外泌体(M...     

低氧预处理脐带间充质干细胞来源的外泌体对内皮细胞功能的影响

目的:探讨低氧预处理人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)后,其释放的外泌体对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移和小管形成的影响。方法:分离、培养并鉴定hUCMSCs和HUVECs。采用超速离心法提取hUCMSCs释放的外泌体,透射电镜观察外泌体的形态,纳米颗粒跟踪分析技术检测外泌体的粒径和浓度,Western blot检测外泌体表面特异性标志蛋白。将hUCMSCs分为常氧组和低氧预处理组,用CCK-8法检测细胞活力。将HUVECs分为对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组,用EdU法检测细胞增殖能力,细胞划痕和Transwell实验检测细胞迁移能力,小管形成实验检测细胞小管形成能力。结果:与常氧组相比,低氧预处理增强hUCMSCs活力,促进其外泌体释放。与常氧外泌体组相比,低氧预处理hUCMSCs释放的外泌体增强HUVECs的增殖、迁移和小管形成能力。结论:低氧预处理hUCMSCs分泌的外泌体增强HUVECs增殖、迁移和小管形成能力。     

单采血小板来源外泌体的提取与鉴定

目的研究单采血小板来源外泌体提取和鉴定的常见影响因素,为后续开展单采血小板来源外泌体研究提供参考。方法利用超速离心法分离提取单采血小板来源外泌体,并通过透射电镜、Western Blotting验证提取产物;利用BCA试剂盒测定外泌体总蛋白浓度。结果 5天组外泌体蛋白浓度(1822.2±11. 4μg/mL)明显高于1天组(775. 7±11. 5μg/mL),P <0.001;未冻存组蛋白浓度(1822.2±11.4μg/mL)明显高于不含DMSO冻存组(1153.6±2.6μg/mL)和含5%DMSO冻存组(1403.4±6.1μg/mL),P<0. 001。结论单采血小板来源外泌体含量随标本保存时间延长逐渐增加;冻存处理会一定程度上降低外泌体提取产量和影响其形态观察。     

间充质干细胞外泌体在神经系统疾病中的应用

外泌体是真核细胞分泌的纳米级脂质双分子层小囊泡,含有母源细胞相似的生物活性物质,是细胞间物质传递和信息交流的载体;近些年间充质干细胞(MSCs)在神经系统疾病的治疗中取得了显著成绩,外泌体的提出为其作用机制的研究提供了一个全新的角度.本文就MSCs外泌体的结构与功能以及在神经系统疾病中的应用作一综述.     

骨髓间充质干细胞来源外泌体对成肌细胞缺氧状态的影响北大核心

背景:细胞在缺氧条件下会发生功能的变化,而间充质干细胞分泌的外泌体可以缓解细胞缺氧带来的病理性损伤。目的:探讨不同浓度氯化钴对成肌细胞功能变化的影响,并进一步研究骨髓间充质干细胞来源外泌体对成肌细胞缺氧凋亡和活性氧产生的作用。方法:体外分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,通过超速离心法提取外泌体,采用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、Western blot对外泌体进行鉴定。应用0,50,100,200μmol/L氯化钴干预C2C12成肌细胞1,3,5,7 d,CCK-8检测成肌细胞增殖活性变化;干预5 d,qRT-PCR检测成肌分化基因MyHC、MyoD、MyoG的表达水平,改良吉姆萨染色观察成肌细胞融合情况;干预3,5 d,流式细胞仪检测细胞凋亡率;干预3 d,使用DCFH-DA染色观察细胞活性氧水平。成肌细胞分为4组:对照组(0μmol/L氯化钴),氯化钴组(200μmol/L氯化钴),外泌体组(200μmol/L氯化钴+50 mg/L外泌体),NAC组(200μmol/L氯化钴+2 mmol/L抗氧化剂NAC)处理,干预3 d,检测凋亡率和活性氧水平。结果与结论:①外泌体呈杯口状结构,粒径分布在30-150 nm之间,CD9、TSG101表达阳性;②氯化钴对成肌细胞的增殖、分化有显著抑制作用(P<0.05),并且促进了细胞凋亡(P<0.05),高浓度的氯化钴对成肌细胞的功能抑制作用更加明显;③外泌体能够降低200μmol/L氯化钴所诱导的成肌细胞缺氧凋亡和活性氧水平(P<0.05),并与抗活性氧试剂NAC具有相似的作用(P<0.05);④结果表明,氯化钴对成肌细胞的生理功能抑制作用具有一定的浓度和时间依赖性,而骨髓间充质干细胞来源外泌体与NAC具有相似的抗缺氧凋亡和降低活性氧产生的作用,其机制可能为外泌体通过降低活性氧产生的途径而缓解了成肌细胞的缺氧凋亡。     

间充质干细胞及其外泌体在脊髓损伤中的研究进展

脊髓损伤(SCI)往往给患者带来巨大的心理、经济负担。随着研究的深入,人们对SCI的病理生理机制逐步有了清晰的认识。细胞移植治疗给SCI患者带来了新的希望,诸多研究表明间充质干细胞(MSCs)移植能够对SCI的各个病理生理过程产生一定积极的作用。但SCI极其复杂的病理生理机制加之MSCs移植本身也存在一定局限性,使得MSCs移植疗法陷入了瓶颈。近年来,针对外泌体的研究兴起为MSCs治疗SCI提供了新的思路,从过去的"细胞移植疗法"中诞生出了"无细胞疗法"。     

间充质干细胞来源外泌体的生物学特性及免疫调控作用北大核心

背景:阐明间充质干细胞来源外泌体的合成、调控作用,对未来外泌体的研究及应用有重要意义。目的:综述不同间充质干细胞来源外泌体的生物学特性及其在免疫调控中的作用,希望为未来外泌体的研究寻找新的突破点以及无细胞治疗提供思路。方法:检索PubMed数据库、万方数据库、CNKI中国期刊全文数据库收录的相关文献。英文检索词为“stem cell,mesenchymal stem cells,exosmes,immunomodulation,inflammatory mediator,biological characteristics of exosomes,biological characteristics of mesenchymal stem cells,regeneration”,中文检索词为“干细胞,间充质干细胞,外泌体,免疫调控,炎性因子,外泌体生物学特性,间充质干细胞生物学特性,再生”,最终纳入105篇文献进行归纳总结。结果与结论:间充质干细胞是广泛存在于机体各组织的一种多潜能干细胞,其除了具备干细胞特性外还具有免疫调控作用。间充质干细胞已被大量应用于临床,包括治疗新型冠状病毒肺炎患者,并取得较好的治疗效果。外泌体是一类起源于核内体、直径在40-200 nm的胞外囊泡,间充质干细胞来源外泌体具有与其母源细胞相同的免疫调控功能,例如携带免疫抑制因子、影响巨噬细胞向M2型极化、调节T细胞的分化及抗原提呈等作用。     

间充质干细胞及其外泌体在肝再生领域的应用

背景:已有许多研究表明了间充质干细胞在疾病治疗和再生医学领域具有广阔的应用前景,另外,除了间充质干细胞本身,来源于间充质干细胞的外泌体也成为研究者关注的热点,有望成为新的疾病诊疗方法。目的:综述间充质干细胞及其外泌体在肝再生领域中的应用、挑战及前景,深入了解其发挥作用的治疗机制。方法:以"mesenchymal stem cells,MSCs,exosomes,liver,regenerate""间充质干细胞,外泌体,肝,再生"为检索词,检索PubMed数据库、万方数据库、CNKI数据库中发表的相关文献,通过筛选整理,排除与研究内容无关的文献、重复性研究和过早发表的文献,最终保留85篇文献进行综述。结果与结论:通过对现有的研究总结了间充质干细胞及其外泌体能够发挥肝脏保护作用并延缓疾病进展,具体机制包括减少肝细胞凋亡、调节自噬、改善炎症反应、改善氧化应激、抑制纤维化、促进血管生成等,可作为肝损伤相关疾病治疗研究的新方向。     

褪黑素预处理的骨髓间充质干细胞外泌体促进骨髓间充质干细胞成骨

背景:骨质疏松是一种以骨量减少、骨微结构改变为主要特征的全身性代谢疾病,现有的药物治疗效果有限且不良反应明显,而骨髓间充质干细胞来源外泌体因其非免疫原性等优势,有望成为治疗骨质疏松的新方法.目的:探讨褪黑素预处理骨髓间充质干细胞后提取的外泌体对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及作用机制,分析其作为无细胞方式促进成骨治疗骨...     

人羊膜间充质干细胞的生物学特性鉴定

目的分离提纯的人羊膜间充质干细胞的生物学特性鉴定。方法剥去38～40周孕妇剖腹产术后羊膜,用消化酶消化后制备人羊膜间充质细胞（hAMCs）悬浮液。利用流式细胞分选技术从hAMCs中分离提纯干细胞（hAMC-SP细胞）,并对于细胞抗原进行鉴定。结果从hAMCs中分离的hAMC-SP细胞,约占AMCs总数的0．3％。传代培养4～10代后的hAMC-SP细胞表达Nestin、Vimentin、整合素家属成员（CD49b、CD49c、CD49d、CD49e）、CD9、CD13、CD19、CD29、CD44、CD46、CD51、CD59、CD166及干细胞相关的Oct-3／4抗原。HLA-ABC、TRA-1-81及SSEA-4为弱表达;相反CD34、CD45、CD117、CD56、CD90、CD105、CD106、CD133、Fit-1、Musashi 1及HLA-DR无阳性结果,同样TRA-1-60及SSEA-3也表达阴性。体外转化实验表示hAMC-SP细胞在琼脂糖培养基上不形成细胞集落,但阳性对照组的HepG2形成多数细胞集落。结论hAMC-SP细胞表面标记符合骨髓及脂肪间充质等来源的干细胞特点;hAMC-SP细胞迅速而稳定扩增,无致瘤性。由于来源充足,hAMC-SP细胞在消除HLA-ABC阳性细胞亚群下,同种异体移植在内的广泛的再生医学领域中能成为理想的细胞来源。     

一种绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞源性外泌体的构建及鉴定

目的:构建稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs),获得GFP标记的MSCs源性的外泌体(exosomes)。方法:全基因合成CD63序列,连接到穿梭载体,酶切验证后转染293T细胞,测定病毒滴度后感染MSCs,72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞。荧光定量PCR检测CD63在MSCs中的表达。取其无血清培养72 h的上清液,获得提取物,经透射电镜和Western Blot验证。结果:提取物为类圆形囊泡,大小约为40~100 nm,具有CD63和Alix表达。结论:成功构建携带GFP标记的MSCs源性的外泌体,为研究外泌体在细胞中的摄取及信号传递提供了工具。     

脉冲电磁场调控间充质干细胞外泌体抑制软骨细胞凋亡的研究

本研究旨在探索脉冲电磁场（PEMF）调控间充质干细胞外泌体（MSCs-Exo）对软骨细胞凋亡的作用。采用强度1 mT,频率15、45、75 Hz的PEMF在体外干预MSCs 30 min后提取外泌体并鉴定。荧光标记PEMF干预前后的MSCs-Exo,并分别与星形孢菌素（STS）诱导的软骨细胞共培养24 h,观察软骨细胞对MSCsExo的摄取、细胞的凋亡及细胞内aggrecan、caspase-3和collagenⅡA的基因和蛋白表达变化。与15 Hz组和45 Hz组相比,75 Hz的PEMF显著增强了MSCs-Exo抑制软骨细胞凋亡、促进细胞外基质合成的作用。本研究为应用PEMF调控MSCs-Exo的生物学功能提供了研究基础,为优化利用MSCs-Exo抑制软骨细胞凋亡提供了新的研究方向。     

间充质干细胞来源外泌体与再生医学：无细胞疗法临床应用的未来

文题释义：外泌体：是一种区别于微泡,具有特异脂质、蛋白、信使RNA和微小非编码RNA的微小膜性囊泡结构,其大小均一,直径为40-100 nm,密度为1.10-1.18 g/mL,可通过细胞内吞泡膜向内凹陷形成多泡内涵体并与细胞膜融合后而释放。外泌体内主要含有核酸、蛋白质和脂质等,并可在清除废弃物质、介导细胞间信息传递、产生免疫耐受、肿瘤治疗疫苗及组织修复再生等方面发挥作用。 再生医学：是指使功能无法自行恢复的病变组织、器官通过临床治疗措施得到结构和功能的重建,其研究的主要内容是干细胞如何发育成组织并应用干细胞潜能进行组织替代疗法,旨在改善受损、功能障碍和缺失的组织及器官的再生。间充质干细胞是目前再生医学研究中广泛使用的细胞类型,而其发挥作用在很大程度上是由其旁分泌主导而实现的。 背景：外泌体是一种微小的膜性囊泡结构,是间充质干细胞旁分泌的重要组成部分,可将信息传递至损伤的细胞或组织从而参与组织再生。 目的：将外泌体及其在再生医学中的研究进展进行综述。 方法：在PubMed、CNKI数据库中进行相关文献检索,以“exosomes,mesenchymal stem cells,tissue regeneration and repair”及“外泌体,间充质干细胞,组织再生修复”为关键词进行检索,通过阅读文题和摘要进行初步筛选,排除与文章主题不相关的文献,最终纳入63篇文献进行结果分析。 结果与结论：外泌体内含多种成分,其提取方法多样,具有清除废弃物质、介导细胞间信息传递、产生免疫耐受及作为肿瘤治疗疫苗等众多功能。间充质干细胞来源外泌体在组织再生与修复中发挥重要作用,具有较好的应用前景,但若要作为无细胞疗法投入临床使用,还需更多深入研究和探索。 ORCID: 0000-0002-9862-334X(杨琨) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

骨髓间充质干细胞来源的外泌体用于大鼠脊髓损伤修复的初步探索

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的外泌体(exosomes)对脊髓损伤大鼠行为学、损伤处活化星形胶质细胞和残余神经元数量的影响,初步探索BMSCs-exosomes作为脊髓损伤的细胞替代疗法的可行性。方法 :采用全骨髓培养法培养BMSCs,流式细胞术鉴定其表面标志CD90和CD34。收集BMSCs上清液,超速离心法提取并标记外泌体,电镜观察其结构,Western blot法检测其CD63和CD9的表达水平。将外泌体作用于脊髓损伤大鼠,于损伤后各时点进行后肢运动功能评价,并于预定时点处死大鼠取损伤脊髓段,尼氏染色法观察损伤脊髓形态,免疫荧光法检测反应性星形胶质细胞和残余神经元的数量。结果:BMSCs分泌的外泌体电镜下呈"茶托状"结构,Western blot法检测其阳性表达CD63和CD9。脊髓损伤后14d和28 d治疗组神经功能有一定程度改善,与损伤组间差异有统计学意义(P0.05)。损伤后14 d治疗组较之损伤组的尼氏体结构更完整、分布更匀称,崩解凝聚减少。治疗组损伤后7 d、14 d和28 d反应性星形胶质细胞数量较损伤组明显降低(P0.05)。损伤后7 d、14 d和28 d治疗组残余神经元数量高于相应时点损伤组(P0.05)。结论:BMSCs分泌的外泌体可减少脊髓损伤区域反应性星形胶质细胞的数量,减少神经元的死亡,有利于损伤后后肢运动功能改善。