体外构建组织工程化心肌片层的实验研究

探索以液态胶原作为支架材料,体外构建组织工程化心肌片层的可行性。用含0.04?TA的0.25%胰酶分离新生大鼠原代心肌细胞,然后与Ι型胶原M、atrigel和2×DMEM混合,注入方形模具内,制备心肌细胞-胶原复合体,体外培育1周后,施加外力,拉伸刺激条件下继续培养1周。通过光学显微镜下观察H、.E.染色、激光共聚焦和透射电镜观察等对构建的组织工程化心肌片层进行评价。结果表明:心肌片层在培养的第2天出现自发性的跳动,随时间的延长,跳动的区域逐渐增多,并于外力拉伸后的第4天形成一致跳动。激光共聚焦研究结果表明:在构建的工程化心肌组织中,肌原纤维显示排列有序,多数沿拉伸方向伸展,其形态类似于心肌组织。电镜观察显示:拉伸的心肌片层中的心肌细胞含有较多的肌原纤维,肌小节结构和Z带清晰可见。采用新生大鼠心肌细胞与液态Ι型胶原复合方式,可在体外再造出片层状心肌组织,构建的组织工程化心肌片层具有与心肌组织类似的结构和特性。     

体外构建工程化心肌组织的研究与应用

背景：“工程化心肌组织”是应用组织工程的方法,构建出具有天然心肌组织特征的心肌,将它移植到体内,最终修复或完全替代病损组织。但以往研究获得的工程化心肌组织存在较多的缺陷,仍不能满足实际需要。 目的：总结体外构建工程化心肌组织方法的研究进展。 方法：由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI：2000/2010)和Medline(2000/2010)数据库,检索词分别为“心肌,组织工程,心肌构建物”和“Myocardial Construction materials, Tissue Engineering, Myocardial”。从种子细胞、支架材料、体外培养环境和生物反应体系、工程化心肌组织的再血管化、移植实验5方面进行总结,对不同的种子细胞及生物支架材料和体外培养的环境、移植工程化组织的再血管化等方面进行了介绍。共检索到150篇文章,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入30篇文章。 结果与结论：适合心肌细胞生存和心肌细胞形成的新型生物活性支架,理想的种子细胞、体外培养环境与生物反应体系、移植工程化组织的再血管化,动物移植实验等方面都是组织工程化心肌组织再造的关键所在。构建的组织工程化心肌组织应同时具备良好的收缩功能、稳定的电生理特性、力学强度和柔韧性、无免疫原性及自身能血管化或在移植后能迅速血管化的条件,但未来还需进一步研究。     

初级组织工程小口径血管的制备

目的 探讨利用组织工程技术构建小口径组织工程化血管的可行性.方法 将犬骨髓细胞诱导为平滑肌细胞和内皮细胞后,用Brdu标记平滑肌细胞,DAPI标记内皮样细胞,观察细胞标记的成功率;血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞分层种植于胶原包埋PGA的复合支架表面:将细胞和支架的复合体种植于犬皮下,并设立对照组,分别于植入后的第4、6、8周取出植入皮下的组织工程化血管,进行相关检查分析.结果 免疫荧光提示Brdu、DAPI标记种子细胞效果良好;核呈蓝色荧光的内皮样细胞均匀排列在支架表面:组织工程化血管材料植入动物皮下取出后观察,实验组管壁结构比较清晰,细胞数量也已减少、胶原成分增多,管壁分层明显,可见内膜、中膜和外膜结构,对照组无此特点;免疫荧光观察,8周实验组组织工程血管壁内有Brdu标记的种子细胞存在.结论 以动物的皮下为生物反应器,采用静态培养的方式可强化组织工程血管壁,该组织的结构与天然血管相似,种子细胞同时参与初级组织工程小口径血管的构建.     

骨髓间充质干细胞构建组织工程化小口径血管

目的采用在动物体外构建初级组织工程化血管、体内强化的方法,探讨构建小口径组织工程化血管的可能性.方法体外培养骨髓间充质干细胞(BMSC),用含全反式维甲酸(AT-RA)、双丁酰环磷酸腺苷(db-cAMP)的DMEM-LG培养液和含血管内皮细胞生长因子(VEGF)的培养液诱导BMSC分别向血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞分化.免疫荧光观察平滑肌样细胞β肌动蛋白的表达和内皮样细胞vWF的表达.电镜观察超微结构的改变.诱导的血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞,分层种植于胶原包埋聚乙醇酸(PGA)的复合支架表面,将细胞和支架复合体种植于动物皮下,于植入后第4、8周再次麻醉动物,取出植入皮下的组织工程化血管,行组织学检查、压力实验及免疫荧光检查.结果诱导14 d后,BMSC能够分化为血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞:β肌动蛋白和vWF呈阳性表达,电镜证实细胞出现了相应的形态学改变.人工血管组织学观察见管壁结构清晰.单纯支架组可承受100～150 mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)的血管腔内压力,实验组则均可承受200mm Hg的血管腔内压力不破裂.实验组皮下培养8周Brdu标记细胞的免疫荧光结果显示部分细胞核呈现明亮的黄绿色荧光.结论以动物皮下为生物反应器可构建出组织工程化血管,其大体结构和天然血管相似.     

具有定向结构管状心肌组织工程支架的构建

心肌组织工程支架是心肌组织工程研究的重要内容之一.本文通过模仿天然心肌细胞外基质的材料组成和结构特征,采用＂胶原-壳聚糖-黏着＂蛋白的材料体系,设计并应用定向凝固后热致相分离的成形工艺,构建具有定向大孔和贯通小孔的管状心肌组织工程支架.扫面电镜观察结果表明,该心肌组织工程支架具有100μm左右定向大孔和10μm左右贯通小孔的孔隙特征,定向结构取向明显.生物学实验显示细胞与支架相容性良好,并可贴附支架沿孔隙生长.本文构建的具有定向结构的管状心肌组织工程支架,具有进一步用于组织工程心肌体外构建的潜力.     

组织工程化血管移植实验研究

目的 通过体外构建、体内培养的方法 构建组织工程化血管,并将其植入动物的股动脉,探讨利用小口径组织工程化血管进行血管移植的可能性.方法 首先用Brdu标记所有种子细胞,将血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞分层种植于胶原包埋PGA的复合支架表面;然后将细胞和支架的复合体种植于动物皮下构建组织工程化血管,并移植到股动脉;最后行HE染色及免疫荧光等相关检查,了解移植后血管的特点及细胞来源.同时以移植物为单纯支架在皮下培养所形成的管状结构作为对照组.结果 移植后组织工程化血管通畅无血栓形成.HE染色见血管壁和正常生理性血管壁的结构相似.可分内膜、中膜和外膜三层.种植2周后Brdu标记细胞的免疫荧光观察证实血管壁细胞来源于所种植的种子细胞.结论 利用骨髓间充质干细胞分化而来的种子细胞和胶原包埋的PGA支架可以构建组织工程化小口径血管,而且可以移植入动物体内.     

AngⅡ诱导大鼠BMSCs联合脱细胞牛心包体外构建工程化心肌组织的实验研究

目的：探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为心肌细胞的能力,及诱导后BMSCs体外联合脱细胞牛心包构建工程化组织心肌的可行性。方法分离培养大鼠BMSCs,用含0.1μmol/L AngⅡ的完全培养基诱导培养第3代BMSCs 24 h,然后换用完全培养基连续培养;对照组采用完全培养基连续培养。采用免疫荧光法检测诱导后的BMSCs表达心肌特异蛋白cTnT、β-MHC情况;透射电镜观察诱导后的细胞超微结构。用去污剂-酶消化法对新鲜牛心包行脱细胞处理,然后将诱导后4周的BMSCs接种于脱细胞牛心包生物支架上培养3 d后,对其进行观察检测。结果 AngⅡ诱导后的BMSCs向心肌细胞分化,可表达cTnT和β-MHC,对照组则不表达cTnT和β-MHC。电镜结果显示诱导后的细胞间可见类肌节组织及明显的桥粒连接;新鲜的牛心包经去污剂-酶联合四步法脱细胞处理及京尼平交联后,HE染色观察脱细胞的效率接近100%。扫描电镜观察发现脱细胞处理后的牛心包表面无细胞残留且表面排列杂乱,放大后可见有2μm小孔。观察体外构建的工程化心肌显示诱导后的BMSCs可良好地黏附于脱细胞牛心包生物支架表面并生长增殖,且少量可渗透到支架内部。结论 AngⅡ诱导的大鼠BMSCs可向心肌细胞方向分化,表达心肌特异蛋白cTnT和β-MHC。将其种植于脱细胞牛心包生物支架上,表面黏附良好,且可渗透到支架内部及血管周围,有望用于构建具有血管网络化的组织工程化心肌。     

采用灌注生物反应器构建的心肌组织中氧分布的数值模拟

目的　建立灌注生物反应器和心肌组织构建物中流体流动及氧传递和反应的稳态数学模型。方法　以工程化心肌组织体外多通道灌注培养系统为研究对象,利用计算流体力学方法,通过商业软件来求解数学模型,并考察两种细胞密度下灌注速率对氧分布的影响。结果　通过多通道灌注生物反应器模仿毛细血管,能部分提高及改善支架材料内的氧浓度分布。在细胞密度较低时多通道灌注方式可以满足细胞生长的需要;但由于通道的数目较少以及形状简单,在细胞密度较高时,仍无法满足细胞对氧的需求。结论　该模型能够用于优化支架材料的几何尺寸以及灌注速率等流动参数。     

心肌组织工程生物反应器研究进展

组织工程的研究主要围绕种子细胞、生物材料和组织构建这三个基本要素而展开。组织构建技术是组织工程研究的核心。组织工程生物反应器是一种体外构建人体组织的系统装置。心肌组织工程在替代和维持梗塞的心肌组织功能,并进而治愈疾病以最大限度地挽救病人生命方面可能发挥巨大作用。主要介绍了国内外工程化心肌组织体外构建技术,特别是用于构建工程化心肌组织的心肌组织工程生物反应器研究方面的进展。     

组织工程化组织收缩现象的研究进展

在组织工程的研究中发现,骨、软骨和肌腱等多种组织工程化组织在体外构建的过程中体积明显缩小,并证实其与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)有关系。α-SMA基因的表达并非细胞“去分化”现象,可能与体外培养条件有关系,并影响细胞外基质的分泌。组织材料体积的缩小影响组织的构建与修复,因此通过调节α-SMA基因的表达,以及提高支架材料抵抗收缩的能力来控制组织材料收缩是非常必要的。