异种骨材料浸提液对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

背景:如何在去抗原等处理基础上保留异种骨材料的生物学性能及成骨诱导活性成为研究热点之一。目的:探讨异种骨材料浸提液对骨髓间充质干细胞增殖迁移及成骨分化能力的影响。方法:SD大鼠骨髓间充质干细胞分别用异种骨材料浸提液(实验组)和含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养(对照组)。MTT法、Transwell小室法、流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞增殖能力、迁移能力、细胞周期变化。取第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞,实验组加入成骨诱导分化浸提液,对照组加入成骨诱导分化培养液,培养至第7,14天进行碱性磷酸酶染色,培养第21天进行茜素红染色,观察钙结节形成情况。结果与结论:实验组培养1,3,5,7 d的细胞增殖活性与对照组比较差异无显著性意义(P0.05),两组细胞周期差异无显著性意义(P0.05)。对照组迁移细胞数显著少于实验组(P0.05)。培养第7,14天时实验组碱性磷酸酶水平均显著高于对照组(P0.05),成骨诱导第21天进行茜素红染色可见两组均有钙结节形成,实验组钙结节面积更大。结果表明异种骨材料无细胞毒性,具有良好的细胞相容性,可以对骨髓间充质干细胞增殖迁移及定向分化成骨细胞产生有利的促进作用。     

富血小板血浆诱导兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

背景:对于骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化,目前大多存在诱导物价格昂贵、制备困难或细胞培养周期长、成骨能力低等缺点,近年研究发现浓缩血小板中存在的生长因子有诱导骨再生的作用。目的:观察富血小板血浆对体外培养兔骨髓基质干细胞的增殖和成骨细胞分化作用。方法:从8只兔双侧股骨大转子抽取骨髓,体外分离培养兔骨髓基质干细胞,传至第3代分为两组,实验组用含1%富血小板血浆的DMEM进行干预,对照组加入普通DMEM条件培养液。结果与结论:倒置显微镜下,原代培养细胞24～36h后开始贴壁,10～12d细胞融合成单层。实验组细胞培养第2天已贴壁,第6天细胞大部分融合;对照组细胞形态学变化较实验组晚出现1～3d。培养第2,6,10,14天,碱性磷酸酶活性测定和茜素红钙结节染色结果显示,体外培养的兔成骨细胞生长良好,生化指标稳定,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性,证实富血小板血浆能促进体外培养的兔骨髓基质干细胞增殖,并能促使其向成骨细胞分化。     

Shh在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用

 目的：研究Sonic Hedgehog（Shh）在雷奈酸锶（strontium ranelate,Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞分化中的作用。方法：采用全骨髓贴壁培养法分离、纯化、培养大鼠BMSCs,取第3~5代BMSCs加入成骨诱导液诱导成骨分化,再加入不同浓度Sr及Shh拮抗剂cyclopamine（Cy）,分别观察它们对BMSCs向成骨细胞分化的影响。酶标法检测成骨细胞分化早期标志物碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性;茜素红染色检测细胞钙化水平;Western blotting法检测Shh和Runx2蛋白的表达情况。结果：Sr（3 mmol/L）可以使细胞ALP活性增高,钙结节形成增加。Sr（0.1～5 mmol/L）作用BMSCs 7 d,可明显促进Shh和Runx2蛋白的表达,且Shh蛋白在1 mmol/L Sr作用时表达最多,而Runx2在3 mmol/L Sr作用时表达最多。1 mmol/L Sr作用BMSCs不同时间（1、3、5、7 d）,呈时间依赖性地上调Shh和Runx2蛋白的表达。Cy（10 μmol/L）不仅拮抗Sr对Shh和Runx2表达的上调作用,还抑制Sr对ALP和钙结节形成的促进作用。结论：Sr可通过上调Shh蛋白及成骨特异性转录因子Runx2的表达促进BMSCs向成骨细胞分化。     

大鼠脂肪源性干细胞来源的施万细胞特性分析

目的 探讨脂肪源性干细胞（ADSCs）及其分化的施万细胞（SCs）在形态、活性和标志物表达上的区别。方法 取SD大鼠腹股沟处脂肪制备ADSCs，用流式细胞术检测细胞表面标志；钙钴金属盐沉淀法检测碱性磷酸酶（ALP），茜素红染色观察矿化结节；油红O染色观察脂滴；随机分对照组和诱导组，加入条件培养基向SCs诱导分化；MTT法检测诱导后第2、4、6和8 d各时间点的细胞活性；扫描电镜及免疫染色观察S100的表达。结果 光镜下可见ADSCs呈梭形贴壁生长；ADSCs表达抗原分化簇90(CD90)和抗原分化簇105(CD105)，不表达抗原分化簇45(CD45)；成骨诱导后可见ALP呈强阳性表达，茜素红染色可见橘红色矿化结节，油红O染色可见胞内红染脂滴聚集；向SCs诱导后第4 d，可见多数细胞呈纺锤形，第8 d纺锤状细胞增多；MTT检测显示第4 d诱导组的吸光度明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；组内相比，诱导组和对照组的吸光度均随着时间的延长而逐渐增大，差异有统计学意义（P<0.05）；第6、第8 d诱导组与对照组吸光度差异无统计学意义（P>0.05）；扫描电镜...     

珍珠层水溶性提取物对人骨髓基质细胞成骨性分化的诱导作用

目的:探讨珍珠层水溶性提取物(WSM)对人骨髓基质细胞的诱导作用。方法:原代培养人骨髓基质细胞,条件培养基和WSM分别作用于第3代细胞,对照组不加处理因素。倒置显微镜观察细胞在施加处理因素后的生长状态;采用钙钴法染色检测AKP表达;应用RT-PCR方法检测BMP-2等生长因子表达;应用茜素红染色检测骨髓基质细胞的矿化结节形成情况。结果:施加处理因素第7d,WSM组、条件培养基组的BMP-2表达水平较对照组明显增加;WSM组及条件培养基组TGF-β1表达量较对照组相比未见差异。施加处理因素第7d,WSM组及条件培养基组骨髓基质细胞AKP染色明显,与对照组相比差异显著。每高倍视野阳性细胞数,条件培养基组、WSM明显多于对照组,差异具有显著性(P<0.01);加入处理因素18d,条件培养基组可见典型红色钙化结节形成,WSM组也可见到钙结节形成,但没有条件培养基组典型,对照组偶有零星钙化结节形成。结论:WSM可以促进体外培养的人骨髓基质细胞成骨性分化进程,具有一定的骨诱导作用。     

正弦交变电磁场促进体外培养成骨细胞成熟矿化的时间效应

研究正弦交变电磁场(SEMFs)促进体外培养成骨细胞(OB)成熟矿化的时间效应。OB培养后随机分成7组,其中6组用50Hz、1.8mT SEMFs处理,处理时间为每天0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0h,1组0h(对照组)。倒置相差显微镜下观察各组细胞形态;48h后检测细胞增殖情况;第3、6、9、12d测定碱性磷酸酶(ALP)活性,第10d茜素红钙化结节染色。磁场处理8d后形成漩涡样分布的钙化节结;各磁场处理组均抑制细胞增殖;ALP活性从0.5～1.5h依次递增,从1.5～3.0h依次递减,1.5h组的ALP活性始终高于对照组(P<0.05),第9d时显著高于其他各磁场处理组(P<0.05);茜素红染色结果显示,1.0、1.5和2.0h组的钙化结节数明显多于对照组。50Hz、1.8mT SEMFs抑制体外培养OB的增殖,但对其分化成熟和矿化过程有显著促进作用,此作用与磁场处理时间有关,尤以1.5h促分化效果最为明显。     

激素性股骨头坏死模型大鼠骨髓间充质干细胞增殖及定向诱导能力均降低

背景:近年来,干细胞治疗股骨头早期骨坏死已经成为一种可选的方法,但干细胞质量影响治疗效果。目的:评价激素性股骨头坏死模型大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力以及定向诱导分化能力。方法:20只SD大鼠随机分为对照组和观察组,每组10只,观察组构建激素性股骨头坏死模型,分离培养两组大鼠骨髓间充质干细胞。采用CCK-8法检测第3代骨髓间充质干细胞增殖情况。选择第3代骨髓间充质干细胞进行成骨、成脂定向诱导分化。成骨诱导7,14 d行碱性磷酸酶染色和茜素红染色,成脂诱导21 d行油红O染色。结果与结论:培养第1,3,5天观察组细胞吸光度值均低于对照组,差异均无显著性意义(P0.05);但第7天时观察组吸光度值显著低于对照组,差异有显著性意义(P0.05)。观察组碱性磷酸酶活性显著低于对照组(P0.05)。与对照组比较,观察组的钙结节和脂滴数量较少。以上结果表明激素性股骨头坏死模型大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力和成骨成脂诱导分化能力均减弱。     

BMP-2和FGF-2对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的:观察骨形成蛋白(BMP-2)和成纤维细胞生长因子2(FGF-2)对小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化的影响.方法:取3～18月雄性C57BL/6J小鼠(共50只)的骨髓细胞, 分离贴壁培养后, 用免疫磁珠法纯化, 并鉴定为MSCs后, 再进行贴壁培养24 h后, 分别在成骨细胞诱导培养液中加入100 μg/L BMP-2和0.5 nmol/L FGF-2持续诱导7、 14、 21 d后, 进行碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性检测, Vonkossa染色以及茜素红染色, 并用递转录荧光定量PCR法检测向成骨细胞分化的标志性基因(Runx2/cbfa1、 Alp、 collagen-1、 osteocalcin)的表达情况.结果:BMP-2刺激组的ALP活性以及钙化结节明显高于对照组, Runx2/cbfa1, ALP, collage-1, osteocalcin的mRNA呈高表达; FGF-2刺激组的ALP活性以及钙化结节也高于对照组, Runx2/cbfa1、 Alp、 collagen-1、 osteocalcin的mRNA表达量也高于对照组, 但不如BMP-2明显. 结论:BMP-2和 FGF-2在不同程度上促进体外培养的小鼠MSCs向成骨细胞方向分化.     

破骨细胞骨吸收上清液对骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的研究破骨细胞骨吸收活动中的分泌产物对骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。方法诱导小鼠脾脏细胞为破骨细胞,用抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)染色。破骨细胞与牛骨磨片共培养,扫描电镜观察骨吸收陷窝。收集骨吸收实验破骨细胞培养上清液作用于小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC),MTT法检测BMSC生长曲线;成骨诱导后钙化结节茜素红染色法检测BMSC成骨能力;成脂诱导后油红O染色检测BMSC成脂能力;Western blot法检测小鼠BMSC成骨相关蛋白RUNX2、碱性磷酸酶(ALP)及成脂相关蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达。结果 TRAP染色、扫描电镜显示脾脏细胞可诱导分化为具有骨吸收能力的破骨细胞;与对照组相比,加入破骨细胞培养上清液,BMSC的增殖受到抑制,成骨分化增强,成脂分化减弱(P0.05)。结论破骨细胞骨吸收上清液具有使BMSC增殖能力降低,成骨分化增强,成脂分化减弱的作用。     

梓醇促大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化的机制研究

目的:探讨梓醇促SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)骨向分化的作用机制。方法:(1)细胞分为对照组、成骨诱导组及梓醇组。4-氨基安替吡啉测酚法检测诱导第7、14和21天各组细胞上清碱性磷酸酶(ALP)活性,ALP染色法检测诱导第14天各组细胞ALP阳性染色率,茜素红染色法检测诱导第21天各组细胞矿化结节数;(2)运用real-time PCR法检测诱导第7、14和21天各组细胞中Runx2、骨钙素(osteocalcin)、β-连环蛋白(β-catenin)、Wnt3a、Wnt5a及Wnt11的mRNA表达水平。结果:(1)2.0 mg/L梓醇可增加BMSCs上清中ALP活性及细胞ALP的阳性染色率,同时促进BMSCs矿化结节的形成(P0.05)。(2)梓醇促BMSCs骨向分化时,Runx2的mRNA表达水平于第14天时达到峰值,随后开始下降,第21天时与对照组无统计学差异;osteocalcin的mRNA相对表达量在第7天时高于对照组,随后持续上升直至第21天。(3)与对照组相比,梓醇促BMSCs骨向分化时,β-catenin与Wnt3a的mRNA相对表达量均于第14和21天时升高并维持在较高水平,而Wnt5a及Wnt11的mRNA相对表达量在第14天达到峰值后开始下降,第21天时Wnt11 mRNA相对表达量显著低于对照组。结论:梓醇通过上调Runx2的表达,促使BMSCs向成骨细胞方向分化,同时还通过增加细胞ALP分泌及osteocalcin的表达,促进细胞矿化的发生,从而促使新生成骨细胞的成熟,此作用可能与其有序激活Wnt信号通路相关。     

兔骨髓基质细胞的体外培养

目的　探讨兔骨髓基质细胞在体外的培养条件 ,为研制骨组织工程材料选择种子细胞奠定实验基础。方法　取兔新生仔长骨骨髓进行培养 ,观察其传代细胞生长特性和生长曲线 ,测定培养细胞分裂指数和贴壁率。结果　兔骨髓基质细胞生长至第 5代 ,性状稳定 ,生长曲线相似 ;第 4天分裂指数最高 ,为 92‰ ;传代后 10h贴壁率最高。结论　兔骨髓基质细胞在体外培养条件下 ,早期生长性状稳定 ,增殖速度快 ,适应性强 ,可作为骨组织工程学的种子细胞。     

骨髓基质细胞体外诱导分化成神经元和胶质细胞

目的　探索骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSC)体外诱导分化为神经元和神经胶质细胞的可行性 ,为BMSC在神经科学领域内的应用奠定基础。方法　以成年犬BMSC为实验对象 ,利用碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF)、维甲酸 (RA)、脑源性神经营养因子 (BDNF)、胶质细胞系来源神经营养因子 (GDNF)等作为增殖及分化诱导因子 ,进行增殖培养、分化诱导 ;免疫组化法进行细胞性质鉴定。结果　加入bFGF、EGF增殖培养 72h可见细胞分裂相 (成纤维细胞样细胞 )。加入RA、BDNF、GDNF诱导 3d ,部分细胞有NSE、GFAP成分表达 ;第 10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成 ,经细胞成分 (NSE、GFAP)鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论　BMSC在体外培养条件下 ,经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用 ,可以分化成神经元和神经胶质细胞     

软骨细胞上清液诱导BMSC向软骨细胞转化的实验研究

目的:体外定向诱导大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)向软骨细胞表型转化,并对诱导进行鉴定。方法:从SD大鼠中分别分离出BMSC和软骨细胞进行体外培养。收集软骨细胞培养上清液,作为BMSC诱导液从第2代开始进行诱导分化。7d后取出标本,甲苯胺蓝染色和Masson染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA表达。结果:镜下见细胞形态由梭形向多边多角形转化。甲苯胺蓝染色和Mas-son染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化检测阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达。结论:软骨细胞上清液可诱导BMSC向软骨细胞转化。     

骨髓间充质干细胞-脱细胞真皮基质对大鼠表皮缺损的修复

目的研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)-脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM)对SD大鼠皮肤表皮缺损的修复。方法培养SD大鼠骨髓细胞,增殖提纯传代至4代时,成骨成脂,流式细胞仪检测鉴定BMSC,然后将其接种到ADM,2d后移植到皮肤表皮缺损的SD大鼠体内,连续5周观察其修复效果。结果 BMSC-ADM修复SD大鼠皮肤表皮缺损效果良好,5周后,肉眼可见材料与组织结合紧密,有弹性,颜色接近皮肤。结论 BMSC-ADM可以作为修复SD大鼠皮肤表皮缺损的组织工程材料。     

Modulation of prostate cancer cell gene expression by cell-to-cell contact with bone marrow stromal cells or osteoblasts

After prostate cancer cells (PCa) arrive in bone, interactions with cells that include long bone osteoblasts (LBOB) and bone marrow stromal cells (BMSC) lead to metastasis formation. The effect of heterotypic cell–cell contact between PCa cells and BMSC or LBOB on PCa cell gene expression is poorly understood. To establish the role of heterotypic contact in bone metastasis formation, we mixed and co-cultured PC3 cells with rat BMSC, LBOB, or human prostate stromal cells (PS15). PC3 cells were then re-isolated for gene array analysis, and imaged using in situ hybridization to confirm that heterotypic contact regulates gene expression. The gene expression was examined using focused gene arrays containing 96 each of tumor metastasis genes or osteogenesis genes. A total of 18 out of 192 genes in PC3 cells were found to be under or over expressed subsequent to heterotypic contact with BMSC when analyzed. A total of 15 genes out of 192 were regulated in co-culture with LBOB, and 19 genes with PS15. Only two genes, uPA and Collagen III, were regulated by contact with BMSC or LBOB (both are bone derived cells), but not by contact with PS15. The relationship between cell–cell contact and uPA expression was further explored by varying cell ratios in co-culture. uPA over-expression in PC3 was related to the BMSC:PC3 ratio, and was maximum at a 10:1 ratio, where most PC3 cells would be in contact with BMSC, as predicted by a theoretical model of heterotypic contact. In situ staining of micropatterned PC3 and BMSC cells showed that uPA over-expression localizes to regions of heterotypic cell–cell contact. Taken together, our results suggest that heterotypic cell-to-cell contact between PC3 and BMSC proportionally enhances gene expression for uPA, providing a mechanism for localized control of invasiveness.     

牵张应力对体外骨髓间充质干细胞形态、排列及迁移的影响

目的观察牵张应力对体外骨髓间充质干细胞(BMSC)的细胞形态、排列及迁移生物学行为的影响。方法利用应力装置对体外培养的BMSC施以周期性牵张应力刺激,在相差显微镜下观察细胞形态、排列及迁移的变化,借助计算机图像处理和分析系统(ImageJ软件)进行定量分析。结果 BMSC受力后,形态明显变长,轮廓鲜明。强度为12%应力干预BMSC12h后,细胞长度增长1.56倍;干预24h后,细胞长度增长1.66倍。BMSC受力刺激后,细胞排列规则,沿受力环切线方向分布。受力12h及24h后,BMSC与切线夹角统计值分别为9.48°±2.83°、8.30°±6.03°,与切线夹角<10°的细胞比例分别为88.52%±6.43%,92.33%±4.98%,明显较对照组规律,并且细胞的迁移速度明显快于对照组。结论 BMSC加载应力刺激后,其形态学及细胞迁移速度均发生明显变化。     

猪脱钙骨基质作为组织工程人工肋骨支架的可行性研究

目的评估异体脱钙骨基质作为组织工程化人工肋骨支架的可行性．为今后全胸壁缺损的骨性修复提供理论基础和实验依据。方法通过Micro-CT、扫描电镜观察猪脱钙骨基质的大体三维结构。通过细胞黏附实验观察猪脱钙骨基质对于异种骨髓基质干细胞的黏附情况．最后通过比较正常人肋骨与猪脱钙骨基质的力学性能评估其作为组织工程人工肋骨支架的可行性。结果Micro-CT和扫描电镜示猪脱钙骨基质具有良好的孔隙率和互相连通的孔径结构。细胞黏附实验显示细胞在猪脱钙骨基质表面生长良好。力学测试显示猪脱钙骨基质具有良好的力学性能．与人正常肋骨相比差异无统计学意义（P〉0．05）,因此可以用于修复具有弧度的肋骨缺损。结论猪脱钙骨基质可以作为组织工程人工肋骨的支架。     

miR-146a调控骨髓间充质干细胞成骨分化的机制研究

目的探讨miR-146a调控骨髓间充质干细胞(BMSC)成骨分化的作用及其分子机制。方法贴壁法分离培养小鼠BMSC,检测成骨分化早期标志物Runx 2的变化,观察BMSC体外成骨分化,利用miRNA特异性的聚合酶链式反应(miRNAspecific qPCR)观察miR-146a的变化情况,并干预miR-146a表达,明确miR-146a对BMSC成骨分化的调控作用。结果成功建立了稳定的BMSC体外培养体系,该细胞能够成功分化为脂肪细胞和成骨细胞;在成骨诱导培养条件下,随着成骨分化,miR-146a水平降低,过表达miR-146a,成骨分化早期标志分子Runx 2表达降低;转染miR-146a拮抗体antago-miR-146a可以补救Runx 2表达的降低。结论 miR-146a负向调控BMSC成骨分化,拮抗miR-146a可以补救BMSC成骨分化的降低。     

骨髓间充质干细胞移植对缺血心肌的血管新生及增殖-凋亡影响

 目的 探讨骨髓间充质干细胞（BMSC）移植对缺血心肌的血管新生及增殖-凋亡的影响。方法 将雄性小鼠BMSC经尾静脉输入异丙肾上腺素性心肌缺血雌性小鼠（BMSC组）。另设正常对照组和未治疗组。5周后处死小鼠,荧光定量PCR检测心肌Y染色体鉴别基因(SRY)、血管内皮生长因子（VEGF）的表达。天狼猩红染色分析心肌胶原含量。免疫组织化学染色观察心肌VEGF、核增殖抗原(PCNA)和细胞凋亡蛋白酶（caspase-3）的分布。 结果 BMSC组心肌SRY表达明显升高（11.22±0.90 vs 1.05±0.47, P<0.05）。与未治疗组相比,BMSC组的心肌胶原沉积减少(3.44±0.84 vs 8.44±1.09, P<0.05),VEGF(14.19±0.37 vs 11.88±0.28, P<0.05)和PCNA(4.08±0.18 vs 0.64±0.05, P<0.05)表达上调,caspase-3降低（0.46±0.11 vs 3.12±0.28, P<0.05）。 结论 BMSC能归巢至缺血心肌并促进微血管新生,改善心肌增殖-凋亡状态。