抗HBsAg/RBC双特异噬菌体抗体的构建

目的 通过不同外壳蛋白的展示，构建抗HBsAag/RBC双特异噬菌体抗体。方法通过DNA重组技术，将抗HBsAg Fab与噬菌体基因8融合，抗RBC ScFv与噬菌体基因3融合，这2种融合基因以不同的启动子驱动，并克隆于同一噬菌体表达载体上，得到双特异噬菌体抗体表达载体，转化大肠杆菌后获取噬菌体抗体上清，用ELISA和红细胞凝集试验检测其双特异活性。结果ELISA和RBC凝集实验证明，本方法可形成双特异噬菌体抗体，可使含有HBsAg的RBC悬液产生凝集。用展示性能得到提高的蛋白8变种取代野生型蛋白8可提高双特异噬菌体抗体的活性。结论 HBsAb和RBC两种抗体分子能够通过不同噬菌体外壳蛋白同时展示于同一噬菌体表面，形成双特异噬菌体抗体。可用于人外周血HBsAg的快速血凝法检测。     

抗HBsAg和抗红细胞双特异Diabody的构建及表达

目的构建及表达抗乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和抗红细胞（ＲＢＣ）双特异Ｄｉａｂｏｄｙ，用于血清中ＨＢｓＡｇ的快速检测。方法将抗ＨＢｓＡｇ的人抗体轻重链可变区基因与抗红细胞的鼠抗体重轻链可变区基因交叉配对构建成两个杂合Ｄｉａｂｏｄｙ基因，并将两个配对基因组建在一个表达载体中，成为双特异Ｄｉａｂｏｄｙ表达载体，并在大肠杆菌中分泌表达。结果经ＥＬＩＳＡ检测和红细胞凝集实验测定，证明所表达的双特异性Ｄｉａｂｏｄｙ具有抗ＨＢｓＡｇ和抗ＲＢＣ双重功能，并可使含有ＨＢｓＡｇ的ＲＢＣ悬液产生血球凝集。结论所表达的双特异性Ｄｉａｂｏｄｙ具有双重抗体活性，可用于血清中ＨＢｓＡｇ的快速检测     

抗VEGFR2/抗CD3双特异单链抗体的表达及初步活性检测

目的:构建和表达抗血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)/抗CD3双特异单链抗体(bscVEGFR2×CD3),及亲和活性测定。方法:设计抗VEGFR2/抗CD3双特异单链抗体基因序列,由公司合成并亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),筛选高效分泌表达bscVEGFR2×CD3的克隆株。表达产物经Ni-NTA柱纯化,120 g/L SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定。应用流式细胞术(FCM)检测生物学活性。结果:bscVEGFR2×CD3重组表达载体测序证实序列正确。bscVEGFR2×CD3能够在CHO细胞中进行分泌表达,筛选出6株高表达克隆株。120 g/L SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)约56 000有1条带,与预期相符,Western blot证明anti-His抗体能与这条蛋白条带发生特异性结合。FCM检测bscVEGFR2×CD3能与CD3+jurkat细胞和VEGFR2+A375细胞特异性结合。结论:成功构建和表达抗VEGFR2/抗CD3双特异单链抗体,该抗体具有与VEGFR2、CD3特异性结合的免疫学活性。     

双特异单抗聚合体清除血液HBsAg及HBV的研究

目的　研究第二抗体交连的双特异单抗聚合体对乙肝病人血液HBsAg及HBV的清除能力 ,并初步探讨其机制。方法　用羊抗鼠IgG单抗将鼠抗人CR1单抗及鼠抗HBsAg单抗连接构建成双特异单抗聚合体 (heteropolymer,HP) ,将HP加入到乙肝病人枸橼酸钠抗凝全血中 ,离心测定血浆中HBsAg及HBV的含量变化 ;设立对照组 ,并采用放射免疫、荧光定量PCR以及细胞酶联等测定方法研究细胞结合的HBsAg及HBV的含量变化及红细胞膜CR1分子数量的变化。结果　由二抗构建的HP可在 5min内将全血中 95 %以上的HBsAg及 5 1%的HBV结合到红细胞上 ,使血浆中HBsAg的含量从 30 10ng ml降到 138ng ml;HBVDNA病毒也从 7.2× 10 1 1 copies L下降到 3.5× 10 1 1 copies L。红细胞在结合抗原物质的同时伴有CR1分子的丢失 ,但红细胞无溶血反应。结论　由二抗构建的HP与文献报道的生物素 亲合素构建的HP具有相同的生物学功能 ,并更有助于对抗原物质的结合与清除 ,以红细胞为载体的HP清除系统可能具有重要的医药或临床治疗研究价值。     

抗纤维蛋白和抗尿激酶双特异单克隆抗体的研制

利用分泌抗纤维蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经在８－氨鸟杂嘌呤内诱导突变，使其成为对ＨＡＴ敏感细胞株．以此突变株与用尿激酶免疫小鼠的脾细胞融合，经筛选获得一株分泌双特异单克隆抗体的杂交瘤细胞９Ｅｌｌ，在体外有明显的溶栓效果。经二年来检测证明，该细胞株是稳定的。     

抗纤维蛋白和抗尿激酶双特异单克隆抗体的研制

利用分泌抗纤维蛋白单克隆抗体的杂瘤细胞株，经在８－氨鸟杂嘌呤内诱导突变，使其成为以地ＨＡＴ敏感细胞株。以此突变株与用尿激酶免疫小鼠的脾细胞融合，经筛选获得一株分泌双特异单克隆抗体的杂交瘤细胞９Ｅ１１。在体外有明显的溶栓效果，经二年来检测证明，该细胞株是稳定的。     

微型双功能抗体抗CD3／抗CD20的构建和表达

目的：构建和表达抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并测定微型双功能抗体的生物学活性。方法：采用PCR和overlap PCR方法构建抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot和分了排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果：DNA序列测定结果表明：抗CD3／抗CD20微型双功能抗体已构建成功,表达可溶性产物的产量达1mg/ml以上,纯化产物中二聚体的比例达90％,具有与Jurkat(CD3^ 0和Daudi细胞（CD20^ ）结合的活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环。结论：利用Diabody形式,首次成功地构建了抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并获得较高表达,表达产物具有与相应2个靶抗原结合的活性。     

抗人卵巢癌×抗人CD3双特异单链抗体介导的效应细胞在体外对卵巢癌细胞的杀伤作用

目的　研究双特异单链抗体 (scBsAb)介导的Jurkat细胞 (CD3+ )及人外周血单个核细胞(PBMC)在体外对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞的杀伤活性 ,从而探讨其用于卵巢癌治疗的可能性。方法以抗人卵巢癌×抗人CD3scBsAb激活效应细胞 ,以SKOV3为靶细胞 ,用MTT法测定不同实验条件下的杀伤活性。结果　 (1)以重组白细胞介素 2 (rIL 2 )、抗CD3单克隆抗体、抗CD2 8重链单域抗体 (VH)预刺激Jurkat及PBMC细胞比单纯用scBsAb激活效应细胞杀伤活性高 ;(2 )以Jurkat细胞或PBMC细胞作为杀伤细胞可得到相似的杀伤活性 ,最高杀伤率均在 75 %左右 ;(3)杀伤活性与scBsAb的浓度、作用时间及效靶比有关。对于Jurkat细胞 ,在抗体终浓度为 2 1μg ml,反应时间为 4 8h ,效靶比为 10∶1时达到最大杀伤率 74 .8% ;对于PBMC细胞 ,在抗体浓度为 2 0 μg ml,反应时间为 72h ,效靶比为 1∶1时达到最大杀伤率73.1%。 (4 )多因子联合应用能有效提高杀伤活性。结论　scBsAb在体外能够有效介导效应细胞杀伤肿瘤细胞 ,有明显的抗癌作用 ,具有潜在的应用前景。     

抗Pgp/抗CD3双特异双链抗体的生物学活性研究

目的　研究抗Pgp 抗CD3双特异双链抗体介导的特异性靶向杀伤活性。方法　采用亲和层析法分离纯化本室构建的抗Pgp 抗CD3双特异双链抗体可溶性表达产物 ,并用SDS PAGE、Westernblot及抗活细胞间接免疫荧光法鉴定纯化产物 ;采用51 Cr释放试验测定其介导的体外靶向杀伤活性。结果　纯化的抗Pgp 抗CD3双特异双链抗体具有与Jurkat细胞 (CD3 )和K5 6 2 A0 2 (Pgp )细胞结合的活性 ;抗Pgp 抗CD3双特异双链抗体具有介导激活的T淋巴细胞杀伤Pgp表达阳性的耐药肿瘤细胞的作用 ,杀伤作用的强弱显示出效靶比和剂量依赖关系 ,且可被CD3ScFv或PgpScFv特异性的阻断。结论　抗Pgp 抗CD3微型双功能抗体有望成为治疗耐药肿瘤 ,特别是肿瘤残留灶和微小转移灶的治疗的一种新策略。     

抗人RBC血型B抗原双价小分子抗体基因的构建与表达

目的： 分离抗人红细胞血型Ｂ抗原单克隆抗体（ｍＡｂ） ５Ｄ１２ 可变区基因, 构建并表达其双价小分子抗体（ｄｉａｂｏｄｙ） 融合蛋白, 为用原核细胞生产抗血型Ｂ抗原工程抗体进行基础研究。方法： 设计合成抗体重、轻链可变区引物, 通过加端ＰＣＲ技术, 在ｍＡｂ ５Ｄ１２ ＶＨ 和ＶＬ基因两端引入连结短肽和适当的限制性酶切位点,体外连接构建５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 基因, 并将其克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ２ 中, 在Ｅ－ｃｏｌｉ ＴＧ１ 中表达。运用ＰＣＲ和双脱氧核苷酸链末端终止法分析其核苷酸序列。结果： ＤＮＡ 序列分析表明, ５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 基因全长为６９９ｂｐ;其中ＶＨ 长３５１ｂｐ , 编码１１７ 个氨基酸; ＶＬ 长３２４ｂｐ , 编码１０８ 个氨基酸, 两者以五肽连接头相连; 重组体表达产物经ＳＤＳＰＡＧＥ显示, ＧＳＴ５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 表达产物的相对分子质量（ Ｍｒ） 为５１ ０００ 左右, 与预期结果相符。光密度扫描结果表明, ＧＳＴ５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 融合蛋白占菌体总蛋白的２４－６％ , 表达产物主要以不溶性的包涵体形式存在。结论： 成功地构建并表达了５Ｄ１２ 双价小分子抗体基因, 在原核细胞中获得较高水平     

抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体制备及体外效应研究

目的：研究制备抗人膀胱癌和抗血管内皮生长因子的双功能抗体，用以导向抑制肿瘤新生血管的形成。方法：在制备抗人膀胱癌和抗血管内皮细胞生长因子单克隆抗体的基础上制备双功能抗体。结果：双功能抗体的IC50为10^-9.5，抗血管内皮生长因子抗体的IC50为10^-8.9，抗人膀胱移行细胞癌单克隆抗体的IC50为10^-8.3。结论：双功能抗体的有效率明显高于单克隆抗体。     

双特异性抗体对LAK细胞增殖和细胞毒作用影响的体外研究

将抗ＣＤ３与抗ＨＢｓ的单克隆抗体经化学偶联得到双特异性抗体，观察该双特异性抗体对ＬＡＫ细胞增殖和增强细胞毒性的作用。结果显示双特异性抗体显著提高ＬＡＫ细胞与２．２．１５细胞结合率；促进淋巴细胞增殖。１２５Ｉ－ＵｄＲ释放试验检测发现双特异性抗体增强ＬＡＫ细胞对２．２．１５细胞的细胞毒性且与抗体浓度呈正相关。进一步对抗体的特异性研究表明，加入双特异性抗体后ＬＡＫ细胞对２．２．１５细胞毒性作用显著高于对照组。     

利用纳米颗粒偶联双特异性抗体提高其功能及稳定性的研究

目的用PLGA纳米颗粒提高CD16-MUC1双特异性抗体的抗肿瘤功能及稳定性。方法利用原核生物表达的方法制备CD16-MUC1双特异性抗体,并利用可降解材料PLGA纳米颗粒偶联,然后利用NK细胞对癌细胞的杀伤实验来检测其功能。结果成功表达具有生物学活性的CD16-MUC1双特异性抗体,并经PLGA纳米颗粒偶联得到稳定性和功能均更优的双特异性抗体。结论经纳米颗粒偶联后的CD16-MUC1可提高其抗肿瘤功能及稳定性。     

双特异性单链抗体介导的T细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用

目的 研究并比较两种抗人γ-精浆蛋白/抗CD3双特异性单链抗体介导T细胞杀伤前列腺癌细胞的作用.方法 利用流式细胞仪分析双特异性单链抗体(BsAb)及多价双特异性单链抗体(mBsAb)与LNCaP细胞和Jurkat细胞的亲和力;将LNCaP细胞作为靶细胞,分为抗体浓度固定组和效应细胞/靶细胞比例固定组,利用51Cr释放试验评价两种双特异性单链抗体在体外介导T细胞杀伤靶细胞的能力;将Jurkat细胞种植裸鼠后,建立裸鼠前列腺癌模型,并分为非治疗组、对照组、BsAb组和mBsAb组,进一步评价两种双特异性单链抗体在体内介导T细胞杀伤靶细胞的能力.结果 流式细胞仪结果显示:BsAb和mBsAb均可特异性结合LNCaP细胞和Jurkat细胞,阳性结合率分别为56.3%、55.4%和74%、83%.51Cr释放试验结果显示:在体外,BsAb和mBsAb均可介导T细胞对前列腺癌细胞的杀伤,并且T细胞的杀伤效率与抗体浓度和效应细胞/靶细胞比例呈正相关.与非治疗组和对照组比较,接种前列腺癌细胞的裸鼠在体内注射激活的细胞毒T细胞的同时分别接受两种抗体的治疗后,肿瘤生长均明显受到抑制(P＜0.05).另外,体外介导杀伤作用和体内抑制肿瘤生长等方面,多价双特异性抗体的效果明显优于双特异性抗体.结论 同时识别人γ-精浆蛋白和CD3分子的双特异性单链抗体可有效地介导T细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用,并且双特异性单链抗体四聚体的形成可明显改善抗体介导杀伤作用的效率.     

Generation and characterization of a novel tetravalent bispecific antibody that binds to hepatitis B virus surface antigens

Hepatitis B virus (HBV) infection is a worldwide public health problem affecting about 350 million people. HBV envelope contains three surface antigens, called pre-S1, pre-S2 and S. For the prophylaxis of HBV infection, only an anti-S monoclonal antibody was tested for the protective efficacy against HBV infection, but it was shown to be incomplete. In addition, some immune escape mutants carrying mutations on the S antigen were reported. Therefore, a multivalent bispecific antibody rather than a single monoclonal antibody would be more beneficial for the prophylaxis of HBV infection. We have generated a novel tetravalent bispecific antibody with two binding sites for each of the S and pre-S2 antigens. Each of the antigen-binding sites was composed of a single-chain Fv (ScFv). The tetravalent antibody was generated by constructing a single gene encoding a single-chain protein. This protein consisted of an anti-S ScFv whose carboxyl end was tethered, through a 45 amino acid linker, to the amino terminus of anti-preS2 ScFv that in turn was joined to the hinge region of human γ1 constant region. The single-chain protein was expressed in Chinese hamster ovary cells and secreted in culture supernatant as a homodimeric molecule. The tetravalent bispecific antibody showed both anti-S and anti-pre-S2 binding activities. In addition, the binding affinity of the bispecific antiboy for HBV particles was greater than that of either parental antibody. The tetravalent bispecific antibody is a potentially useful reagent for the prevention and treatment of HBV infection.     

抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体导入治疗荷瘤鼠膀胱癌的研究

目的：探讨抗人膀胱癌，抗VEGF双功能基因抗体对膀胱癌生长的抑制作用。方法：应用双功能抗体作用荷瘤鼠模型，观察抑瘤作用；应用免疫组化技术检测体内生长肿瘤中微血管密度。结果：双功能抗体对体内生长的肿瘤有明显的抑制作用，经双功能抗体治疗的瘤体中微血管密度明显低于对照组。结论：双功能抗体可以抑制肿瘤血管生成，有望为膀胱癌的治疗提供新的方法。