针对干扰素-γ的新型核酸适配体的筛选及鉴定

 目的: 研发能特异性结合干扰素-γ（IFN-γ）的DNA适配体,为发展IFN-γ的新型检测技术提供基础。方法: 体外合成全长为59个碱基并含有21个随机寡核苷酸的单链DNA文库,以IFN-γ蛋白为靶标,利用指数富集的配体系统进化技术（SELEX）,从单链DNA文库中筛选能够选择性结合IFN-γ蛋白的核酸适配体;流式细胞术检测富集进度、适配体与IFN-γ蛋白结合特性;MFold软件预测二级结构。结果: 经多轮筛选获得了能够识别IFN-γ蛋白的DNA适配体B3-8,其能够选择性地结合IFN-γ蛋白,而与血清白蛋白的结合较弱。经检测其Kd值为185 nmol/L。结论: DNA适配体B3-8能选择性地识别IFN-γ蛋白,在研发针对IFN-γ的新型检测技术方面具有应用潜能。     

针对于白蛋白的新型核酸适配体的筛选与鉴定

目的研发能特异结合白蛋白的DNA核酸适配体,为去除实验样品中的白蛋白提供新型技术手段。方法体外合成全长为59个碱基并含有21个随机寡核苷酸的单链DNA文库,以白蛋白为靶标,利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从单链DNA文库中筛选能特异结合白蛋白的核酸适配体;用流式细胞计量术来检测核酸适配体的富集程度、适配体与白蛋白的结合特性;用MFold软件预测其二级结构。结果经过多轮筛选得到了能特异识别白蛋白的DNA核酸适配体A6,其Kd值为77.4 nmol/L,且基本不结合卵清蛋白、免疫球蛋白Ig G等对照蛋白。结论针对于白蛋白的DNA核酸适配体A6能选择性识别白蛋白,在去除实验样品中的白蛋白方面具有应用潜能。     

新型HER2适配体的筛选及鉴定

目的研发能特异性结合人表皮生长因子受体2(HER2)的DNA适配体,为开发针对HER2的新型肿瘤靶向诊疗技术提供依据。方法体外合成全长86个碱基并含有40个随机寡核苷酸的单链DNA文库,以HER2表位肽为靶标,利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从单链DNA文库中筛选能够选择性结合HER2多肽的核酸适配体;流式细胞术检测富集进度、适配体与HER2蛋白及HER2阳性细胞的结合特性;MFold软件预测二级结构。结果经多轮筛选获得了能够识别HER2多肽的DNA适配体HA5,其能够选择性地结合HER2蛋白及HER2阳性的乳腺癌细胞,而不结合胰蛋白酶和HER2阴性细胞。结论 DNA适配体HA5能选择性地识别HER2阳性的乳腺癌细胞,在研发针对HER2的新型肿瘤靶向诊疗技术方面具有应用潜能。     

基于核酸适配体检测平台的设计模式*

核酸适配体可用作信号识别元件,具有高亲和力、高特异性、高稳定性和易被修饰的特性。核酸适配体的 检测平台包括核酸适配体探针和核酸适配体传感器,可精确、实时地检测生物分子,对临床疾病相关生物标志物 的检测有较大的应用潜力。现将基于核酸适配体检测平台的设计模式作一综述,讨论其研究现状、局限性和未来 发展方向。     

改良SELEX技术筛选福氏志贺菌2a特异性适配体

目的:构建与福氏志贺菌2a高亲和性、特异性结合的DNA寡核苷酸适配体库.方法:体外合成76 nt高通量随机序列的单链DNA寡核苷酸文库(ssDNA),运用全细菌指数富集的配体系统进化技术(whole-bacteria SELEX),福氏志贺菌2a作为靶标与文库ssDNA反应;通过优化PCR反应,将Lambda酶外切及葡...     

丙型肝炎病毒核心蛋白寡核苷酸适配子的筛选与鉴定

目的：筛选、鉴定抗HCV核心蛋白（C蛋白）的寡核苷酸适配子（aptamers）。方法：利用systematic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX)技术，以HCV C蛋白为靶分子，从体外合成的81bp随机单链DNA文库中筛选与HCV C蛋白特异结合的寡核苷酸适配子，并进行了解离常数（Kd）测定和适配子序列测定。再分别利用Clustal W软件包和DNA Folding Sever分析适配子的一级结构和二级结构。结果：经过9轮循环筛选，随机ssDNA库与HCV C蛋白的结合率从0.5%上升到32.5%。所有的一级结构没有共同的同源序列，但可分5个家族，每个家族具有共同的保守序列。二级结构分析表明，适配子形成的茎环、凸环结构可能是与HCV C蛋白结合的结构基础。其中寡核苷酸适配子C4与HCV C蛋白特异结合的亲和力最高，Kd值为68nmol/L。结论：利用随机寡核苷酸文库成功获得抗HCV C蛋白的寡核苷酸适配子。     

SELEX技术的原理和核酸适配体在医学上的应用进展

SELEX是一种制备能与靶分子高特异性高亲和力结合的寡核苷酸的技术,所制备的寡核苷酸分子被称为适配体(aptamer)。适配体可以是单链或双链DNA或RNA,是从非常大的随机的DNA或RNA寡核苷酸库中,经过多个循环的筛选和富集而获得的;它们的特点是能形成一定的立体结构,通过空间构象的密切适应而与靶分子高特异性、高亲和力地结合。适配体可用于医学和生命科学等领域的研究和疾病的诊断与治疗;适配体最大的优点是没有免疫原性,故在临床治疗时能重复使用;目前已有几种适配体进入了临床应用或临床试验。     

SELEX:一种体外筛选核酸适配子的新技术

SEL EX技术是一项新的体外筛选技术 ,它是用体外合成的、其库容为 1 0 1 5左右的随机寡核苷酸库与靶物质结合 ,通过数轮的筛选与扩增 ,筛选到靶物质的目的 DNA或 RNA片段 ,对疾病的诊断与治疗方面起着重要的作用 ,为核酸的结构和功能的研究 ,提供了一个有效的方法     

核酸适配体在肿瘤学中的应用研究进展

核酸适配体是一类通过指数级富集的配体进化技术(SELEX)获得的能以较高的亲和力与各类生物靶标特异性相结合的单链DNA或RNA。利用细胞-SELEX(Cell-SELEX)技术筛选出来的核酸适配体越来越多的作为靶向分子应用在肿瘤细胞检测、靶向药物载体和siRNA的研究中。体内外研究证明,核酸适配体作为靶向分子能用于肿瘤细胞的体外检测和肿瘤组织的体内成像,并能显著提高药物或siRNA对肿瘤细胞的杀伤作用。     

核酸适配体修饰的铁纳米粒对EGFR阳性肿瘤细胞的靶向热疗效应

目的构建一种核酸适配体修饰的铁纳米粒子(Apt-NP),并研究其对表皮生长因子受体(EGFR)阳性的人胶质瘤细胞的靶向热疗效应。方法用流式细胞术检测核酸适配体的特异性,用生物素与链霉素的结合反应的原理构建Apt-NP,用DNA探针杂交检测核酸适配体是否结合在纳米粒子表面,用动态光散射粒径仪观察Apt-NP的尺寸分布,普鲁士蓝染色检测Apt-NP的靶向结合能力,通过检测磁场条件下细胞释放的LDH来评估Apt-NP的靶向热疗效应。结果 Apt-NP的平均直径为574 nm,较强结合EGFR阳性U251肿瘤细胞。此外,在磁场条件下,Apt-NP可以显著提升对EGFR阳性U251肿瘤细胞的热疗杀伤效应(P0.05)。结论 Apt-NP可以显著提升针对EGFR阳性U251肿瘤细胞的热疗杀伤作用,在肿瘤靶向热疗方面具有潜在的应用价值。     

SELEX与适配体在蛋白质研究中的应用

指数富集的配基系统进化(SELEX)是一种从大容量寡核苷酸文库中经反复分离扩增步骤得到针对靶分子的高亲和力高特异性核酸配基—适配体的体外筛选技术。SELEX技术自1990年发展至今,已涌现出多种筛选模式和分离方法。筛选特异结合蛋白质的SELEX技术发展直接影响和指导了适配体在蛋白质功能调控方面的应用。文章综述了多种SELEX技术在筛选蛋白质方面的发展近况,适配体在蛋白质功能研究中的应用,筛选过程中关键性因素的确定及适配体的前后期修饰。     

核酸适配子及其治疗应用

核酸适配子(aptamer)是从大容量的组合化学库中筛选出的短的寡核苷酸。与抗体类似,它与靶分子结合具有高特异性和高亲和力。大多数核酸适配子与靶分子结合后对靶分子有抑制作用。适配子可广泛用于抗凝血、抗病毒、抗增殖、抗炎等方面。特异针对人VEGF165的核酸适配子已在美国被批准上市。     

人慢性粒细胞白血病融合蛋白BCR-ABL适配子筛选及结构分析

目的:筛选、鉴定人慢性粒细胞白血病融合蛋白BCR-ABL适配子。方法:利用SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential)技术,以高纯度融合蛋白BCR-ABL为靶分子,从体外化学合成的长度为90 bp的随机单链DNA文库中来筛选与融合蛋白BCR-ABL特异性结合的寡核苷酸适配子,并进行解离常数(Kd)值测定和适配子序列测定,再分别用Clustal W软件包和DNA Folding Sever分析适配子一级结构及二级结构,以酶联仪测定OD450值,根据OD值高低判定适配子亲和力大小。结果:经过13轮筛选,随机ss DNA文库与融合蛋白的亲和率从0.3%上升到47.1%,所有的一级结构没有共同的同源序列,二级结构分析结果显示,茎和环等二级结构可能是适配子和融合蛋白BCR-ABL结合的基础,其中,寡核苷酸适配子A2与BCR-ABL亲和力最高,kd值达72 nmol/L。结论:利用随机寡核苷酸文库筛选技术成功获得抗融合蛋白适配子,为临床上治疗和预防慢性粒细胞白血病提供一定的参考。     

SELEX技术及其在医学中的应用

指数富集配基的系统进化(SELEX)技术是一类新的组合化学技术,应用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过筛选、分离、富集获得能与各种配体特异结合的寡核苷酸适配子(Aptamer),且具有高亲和力。目前涉及多种疾病治疗的适配子,包括感染性疾病,肿瘤,心血管疾病,免疫系统疾病等已被筛选出来,并且疗效已经通过体外实验或动物模型得到证实。两个适配子已进入药物III期临床实验阶段,还有很多适配子正处于预临床实验阶段,其中部分将很快进入临床实验。本文综述了SELEX技术及寡核苷酸适配子在治疗领域的最新进展,并且对其前景进行了分析和预测。     

筛选HIV-1 P24蛋白适配子的一种简便的SELEX方法

目的 快速筛选HIV-1 P24抗原适配子,并验证其特异性与亲和力.方法 利用聚碳酯材料PCR板包被P24抗原,在PCR板中运用SELEX技术进行适配子筛选.对多条适配子序列进行了一级结构及二级结构软件分析.酶联免疫法(ELISA)对筛选到的适配子进行亲和力及特异性验证.结果 确定用聚碳酯材料可以包被P24抗原,ELISA法检测抗原包被浓度与吸光度(A值)正相关;电泳显示适配子得到富集筛选;测序后软件分析表明多条适配子有共有序列,空间结构多样;用ELISA法,结合辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(SA)与生物素标记的适配子,对适配子与P24的亲和力进行验证,表明筛选到的适配子与P24抗原有特异性的高亲和力结合.结论 建立了一种简便的筛选HIV-1 P24抗原适配子的方法,筛选到特异性的高亲和力P24适配子.