重组趋化因子vMIP-Ⅱ在大肠杆菌中的表达和纯化

目的重组病毒巨噬细胞炎性蛋白-Ⅱ( viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)在大肠杆菌中表达及纯化.方法以pET32a(+)-vMIP-Ⅱ为重组趋化因子vMIP-Ⅱ克隆基因的表达质粒,以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS为表达菌,在IPTG诱导下表达出一个由230个氨基酸残基组成的硫氧还蛋白(thioredoxin)-vMIP -Ⅱ的融合蛋白(26×103).经细菌裂解、金属离子螯合亲和层析、肠激酶消化以游离vMIP-Ⅱ及阳离子交换层析等步骤纯化目的蛋白,以配体结合实验鉴定纯化产物的生物学活性.结果从1 L 发酵菌液中可获得高纯度目的蛋白约4～6 mg.配体结合实验表明,该产物能与CCR5结合[Kd=(10.90±1.07) nmol/L].结论采用本方法可获得高表达、高纯度的具有生物学活性的重组病毒趋化因子vMIP-Ⅱ.     

人ureb1在大肠杆菌中高效表达及其抗体的制备

目的：构建人的ureb1(hureb1）原核高效表达重组质粒,以此表达的外源蛋白为抗原制备抗urb1的抗体。方法：用XhoI/NotI从pGU-2质粒酶切得到hureb1的ORF与pGEX-4T-2的XhoI/NotI大片段连接,构建表达GST-hureb1融合蛋白的重组载体。转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,以粗制的GST-hureb1融合蛋白免疫大白兔和小鼠,制备抗hureb1的多克隆抗体和单克隆抗体,采用WesternBlot进行特异性鉴定。结果：构建了高效表达GST-hureb1融合蛋白的原核表达载体。融合蛋白的表达量占菌体蛋白质总量的33.45%。以大肠杆菌表达的GST-hureb1融合蛋白免疫动物制备了高滴度、高特异性的抗hureb1的抗体。结论：利用重组GST-hueb1融合蛋白免疫动物可获得高滴度的抗hureb1抗体。重组GST-hureb1融合蛋白和抗hureb1的抗体可用于hureb1的生物学功能研究。     

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-RUNX3为模板,通过Kpn1和Xho1酶切位点将RUNX3定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RUNX3,并转化E.coliDH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coliBL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,鉴定。结果双酶切获得1300bp片段,证明RUNX3片段被成功导入pGEX-4T-2,并在测序后与GenBank进行同源性比对,比对进一步证实原核表达质粒pGEX-4T-2-RUNX3构建成功,并用IPTG诱导,SDS-PAGE方法证实了GST/RUNX3融合蛋白在大肠杆菌中的表达。结论成功构建了RUNX3原核表达载体,并证实了融合蛋白在大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化RUNX3蛋白和研究RUNX3的生物学功能奠定了基础。     

汉滩病毒M、S基因部分片段在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌中融合表达含主要抗原位点的汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与NP片段。方法将汉滩病毒76118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5′端约0.7kb的片段连接,克隆入pGEX4T2,构建嵌合基因原核表达载体pGEX4T2G1S0.7,并在大肠杆菌XL1Blue中,诱导GSTG1S0.7融合蛋白的表达。表达产物用ELISA和Westernblot进行鉴定。结果成功地构建了嵌合原核表达载体pGEX4T2G1S0.7。经IPTG诱导后,ELISA活性测定结果表明,该融合蛋白可与抗汉滩病毒NP及糖蛋白的mAb特异性结合。Westernblot结果显示,诱导出相对分子质量Mr大于1×105的G1S0.7与GST的融合蛋白。结论获得具有特异性结合活性的融合蛋白GSTG1S0.7,为汉滩病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

Galectin-3在雌性小鼠生殖系统中的表达及脂多糖的影响

目的：研究galectin-3在雌性小鼠生殖系统的表达情况,利用小鼠生殖道感染模型研究galectin-3在女性生殖道感染过程中的可能作用。 方法: 采用RT-PCR的方法初步鉴定小鼠生殖系统各组织中的galectin-3 mRNA的表达水平,通过阴道黏膜注射LPS不完全弗氏佐剂乳液建立小鼠的生殖道感染模型,免疫组化对galectin-3蛋白在雌性小鼠生殖系统的表达进行定位分析。结果: 在正常小鼠的子宫、阴道、输卵管及卵巢中都能够检测到galectin-3 mRNA的表达。Galectin-3蛋白主要表达在生殖道黏膜的上皮细胞表面和子宫腺。经LPS刺激后,galectin-3蛋白在阴道、子宫颈及子宫体的表达水平提高(P＜0.05),尤其是刺激后24 h子宫颈中galectin-3的表达量增加最多(P＜0.01)。结论：LPS刺激能增加小鼠生殖道中galectin-3的表达,galectin-3在生殖道抗感染中可能发挥重要的作用。     

人体铜伴侣蛋白Atox1在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术扩增出人体转铜伴侣蛋白Atox1和cDNA片段,直接克隆到PCRⅡ载体上,经DNA序列测定后,再插入到谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体PGEX－6p-2上,构成重组表达质粒PGEA,将此质粒导入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得PGEA融合蛋白的表达。表达的融合蛋白经亲和层析、位点特异性蛋白酶切得到纯化的Atox1蛋白。     

人源细胞色素C在大肠杆菌中的重组表达和分离纯化

细胞色素C在电子传递、缺氧应激和细胞凋亡的过程中起重要作用。通过人源细胞色素C和酵母细胞色素C亚铁血红素裂解酶共表达,从大肠杆菌中获得了可溶性的重组人源细胞色素C蛋白。细菌经过超声破碎后,获得的上清经350g/L硫酸铵沉淀去除杂蛋白,再经过两次SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析,获得了纯度大约为80%的人源细胞色素C。每升菌可产出10mg以上重组细胞色素C。人源细胞色素C的重组表达和纯化有助于细胞色素C功能的深入研究和应用。     

颗粒溶素重组表达载体的构建和原核表达

目的：构建人颗粒溶素（Granulysin,GNLY）基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：抽提体外培养的单个核细胞总RNA,通过RT-PCR的方法获得含有222bp的颗粒溶素cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a（＋）中,构建重组表达质粒pET28a（＋）-GNLY,在大肠杆菌中诱导表达并经Ni亲和层析纯化。用SDS-PAGE和Westernblot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GNLY融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实,成功地构建了GN-LY原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量（Mr）同预期值相一致。结论：成功构建了重组表达质粒pET28a（＋）-GNLY,并在大肠杆菌BL21（DE3）plysS中表达,获得了具有良好的抗原性和特异性的GNLY融合蛋白,为下一步研究人GNLY的功能奠定了基础。     

人LIGHT胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人LIGHT胞外段基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:从人外周血单核细胞来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR得到LIGHT胞外段基因,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果:RT-PCR扩增出了大小为543 bp 的LIGHT胞外段基因,经测序证明序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的蛋白.结论:成功地克隆了人LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

HMGN2的重组表达质粒的构建及其抗菌功能研究

目的：构建HMGN2重组表达栽体,探讨HMGN2分子抗菌作用。方法：用基因克隆的方法构建pET-32a-c（＋）-HMGN2重组表达质粒,经IPTG诱导表达后,用亲和层析的方法纯化His-HMGN2融合蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定其分子量,行琼脂糖弥散法检测其抗菌功能。结果：成功构建了pET-32a-c（＋）-HMG17重组表达质粒,其表达的融合蛋白对致病性大肠杆菌54080,54299以及金黄色葡萄球茼ATCC25923均有抗菌活性。结论：HMGN2是一种抗菌分子,可能参与了体内的天然免疫防御作用。     

小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化

背景：次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC/CCL21)是近年来发现的,具有免疫调节作用及抗肿瘤活性。 目的：构建小鼠次级淋巴组织趋化因子原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达重组蛋白。 方法：取C57BL/6小鼠淋巴结细胞,体外用Poly(I:C)刺激后提取RNA并反转录,以此cDNA为模板,通过PCR技术扩增出CCL21成熟蛋白编码序列。克隆入原核表达载体pBEn-SBP-SET1a,构建融合表达载体pBEn-CCL21。将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后TRICINE-SDS-PAGE电泳分析和鉴定重组蛋白的表达。CCL21融合蛋白经链霉亲和柱层析纯化。 结果与结论：实验成功构建了CCL21基因的原核表达载体pBEn-CCL21,并获得相应的融合蛋白。结果显示CCL21可在大肠杆菌中高效表达,经链霉亲和柱层析纯化即可获得CCL21重组目的蛋白。     

人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）胶原样区（CLR）蛋白。方法：应用PCR技术,从含中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段,将其克隆至pET32a原核表达载体后,转化E.coliBL21（DE3）感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni^2＋-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA法进行鉴定。结果：从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段,测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带。Western blot分析表明,3条蛋白带均可与抗His抗体起反应,3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实,纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论：获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白,为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件。     

hBDNF基因原核表达重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

我们按照hBDNF基因全长编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出760bp的片段,反向插入到pGEM-3Zf( )载体上,获得pGEMBF18克隆,限制性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因全长编码序列。从pGEMBF18克隆中获取hBDNF全长编码片段,与原核表达载体pGEX-5T连接,构建了p5TBF34原核表达重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE特异区带分子量为43kDa,此重组蛋白占菌体可溶性蛋白总量的7.53%,Western杂交证实该特异区带具hBDNF抗原活性。     

结核分枝杆菌Ag85B/GST融合蛋白表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

目的 构建结核分枝杆菌Ag85B／GSF融合蛋白表达质粒，并在大肠杆菌(E．coli)中诱导表达。方法 以质粒pUC18／Ag85B为模板，用PCR法扩增结核杆菌Ag85B基因，扩增的Ag85B上游含有EcoR Ⅰ酶切位点，下游含有SalⅠ酶切位点；将Ag85B基因定向插入质粒pGEX-4T-1中，构建原核表达质粒pGEX-Ag85B并转化E．coli B121，筛选阳性重组子，限制性内切酶切鉴定和DNA序列测定，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDS-PAGE和Westem blot鉴定结果。结果 成功构建原核表达质粒pGEX-Ag85B并表达出Mr约56000大小的Ag85B／GSY融合蛋白，表达量占总菌体的30％。结论 为进一步进行纯化Ag85B蛋白和研究其在膀胱肿瘤治疗中的作用奠定了基础。     

人PD-L2基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人PD-L2基因并构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法 以RT-PCR方法从活化的人外周血单个核细胞总RNA中克隆PD-L2基因的cDNA，构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定。结果 克隆到PD-L2基因cDNA编码区全长序列，经DNA测序证明其与已报道的序列一致。进而构建了PD-L2胞外区的原核表达载体，并在大肠杆菌表达，免疫印迹分析表明在IPTG诱导后表达PD-L2胞外区蛋白，相对分子质量Mr为22000，与理论值大小相符。结论 成功克隆PD-L2基因，其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究PD-L2功能提供了条件。     

家兔MT-Ⅰ基因克隆及其在大肠杆菌中的表达与分离

采用RT-PCR方法扩增镉诱导后的家兔肝脏金属硫蛋白-Ⅰ(Metallothionein-Ⅰ,MT-Ⅰ)基因的cDNA全长,克隆入原核融合表达载体pQE40,转化大肠杆菌M15.菌落印迹法检测阳性菌株;Western blotting 分析重组融合蛋白的表达方式;经SDS-PAGE电泳后,ImageMaster VDS software 分析融合蛋白诱导表达条件;并采用Ni-NTA agarose纯化融合蛋白.结果发现,重组融合蛋白在原核细胞中表达存在可溶和不可溶(包涵体)两种形式,表达量随IPTG诱导时间延长而增加,9 h达高峰(占菌体不溶性蛋白总量的57.4%),经Ni-NTA亲合层析纯化得到重组融合蛋白,为进一步分离目的蛋白单体并研制和开发这一产品提供了可靠依据.     

超抗原SED在大肠杆菌中的表达

目的 构建稳定的SED原核表达系统。方法 采用PCR技术扩增葡萄球菌D型肠毒素（SED）超抗原的成熟蛋白编码区DNA序列，构建SED DNA与6个组氨酸基因融合的表达载体pTrcHis-SED，转入E.coli DH5α，IPTG诱导后，用SDS－PAGE和免疫印迹检测融合蛋白的表达情况。目的蛋白用Ni-NTA金属亲和层析法进行纯化，SDS－PAGE和毛细管电泳检测蛋白纯度。结果 成功构建了原核表达载体pTrcHis-SED。分子量约为28000u的6His-SED融合蛋白可在E.coli DH5α中稳定表达。Ni-NTA金属亲和层析后得到纯度较高（＞95％）的SED融合蛋白，且具有免疫学活性。结论 本研究为SED免疫识别研究奠定了实验基础。     

小鼠白细胞介素5融合蛋白在大肠杆菌的表达

将质粒ｐＢＶ－ｍＩＬ－５的小鼠白细胞介素５（ｍＩＬ－５）的ｃＤＮＡ插入表达载体ｐＥＸ３１ｂ，转化大肠杆菌ＲＲＩ，经热诱导获得高效表达，表达的重组蛋白占菌体总蛋白的４０％。该融合蛋白由大肠杆菌ＭＳ２聚合酶的９９个氨基酸和ｍＩＬ－５的１１３个氨基酸组成，在菌体中以包涵体的形式存在，用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、尿素洗涤包涵体，初步纯化的重组蛋白纯度达９０％，已用于制备抗ｍＩＬ－５的单克隆抗体。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ证实ｍＩＬ－５重组蛋白能与抗ｍＩＬ－５多克隆ＩｇＧ特异结合。     

rhIL-15表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 获得rhIL-15基因工程菌，方法 从肺癌细胞株A549中提取细胞总RNA，用RT-PCR法扩增编码人IL-15成熟区基因的片段，经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，插入融合表达质粒pGEX-4T-2的相应酶切位点，构建重组融合蛋白表达质粒，并转化感受态大肠杆菌BL2l而得到工程菌。结果 重组质粒插入片段核酸序列测定的结果，与文献报道的IL-15蛋白成熟区的核酸序列相一致，该工程菌所表达的融合蛋白多数以包涵体的形式存在，占菌体蛋白总量的39%。复性后，纯化的rhIL-15蛋白经MTT比色法初步测定，具有促进CTLL-2细胞增殖的能力，结论 获得了具有生物学活性的rhIL-15高效表达菌株。