抑制ECV304细胞内EOLA1基因表达后效应观察

目的观察抑制人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内内皮高表达脂多糖相关因子1（endothe-lial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1）基因表达后细胞生长的变化。方法构建EGFP-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2/EOLA1,转染ECV304细胞,G418压力筛选获得稳定表达株;设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上。转染重组质粒到稳定表达EGFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,检测靶基因的抑制情况,观察EOLA1表达被抑制后细胞生长的改变。结果抑制EOLA1表达后ECV304细胞生长明显减慢。结论EOLA1基因在细胞内参与了细胞生长的调控。     

血管内皮细胞(ECV304)表达的HLA-G1对NK细胞杀伤活性的抑制作用

目的:证实HLA-G1分子能够抑制NK细胞对同种血管内皮细胞系的杀伤作用。方法:采用脂质体介导的DNA转染技术,以构建的真核表达质粒pcDNA3-HLA-G1转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,再用免疫荧光法检测表达的HLA-G1分子。并用MTT比色法检测HLA-G1对NK细胞杀伤活性的影响。结果:ECV304细胞上可稳定表达HLA-G1。NK细胞对空质粒pcDNA3转染的ECV304细胞的杀伤率为(50.6±18.1)%;而对pcDNA3-HLA-G1转染的ECV304细胞的杀伤率为(29.7±11.4)%,两者差异具有显著意义(P<0.01)。结论:HLA-G1分子可明显抑制NK细胞对同种血管内皮细胞的杀伤效应。     

含人过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因高效真核表达载体的构建及其意义

目的 构建高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体δ(hPPARδ)的真核表达载体,为hPPARδ受体功能和基于hPPARδ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台.方法 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),从HepG2细胞总RNA克隆hPPARδ全长基因,与经BamHI、SalI相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建重组质粒phPPARδ-IRES2-EGFP,经酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARδ基因的完整性和忠实性;荧光显微镜观察重组质粒转染的293细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞hPPARδ的表达进行荧光定量PCR和免疫细胞化学检测.结果 经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPAR6的高效表达.结论 成功构建phPPARδ-IRES2-EGFP重组质粒.     

稳定表达人热休克蛋白22内皮细胞株的构建和鉴定

背景：热休克蛋白22的应激表达可能对缺氧复氧内皮具有一定的保护作用。 目的：建立稳定表达人热休克蛋白22基因的内皮细胞株。 方法：EcoRⅠ/kpnⅠ双酶切鉴定真核表达重组质粒pEGFP-N1-HSP22。脂质体法以重组质粒pEGFP-N1-HSP22转染人脐静脉内皮细胞,G418筛选,获得G418抗性单克隆细胞。用荧光显微镜、RT-PCR及Western-blot检测热休克蛋白22在人脐静脉内皮细胞中的表达。 结果与结论：经双酶切电泳检测重组质粒pEGFP-N1-HSP22符合预期大小片段。稳定转染的单克隆人脐静脉内皮细胞中,荧光显微镜观察到每个细胞均有绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western-blot检测到热休克蛋白22mRNA和蛋白表达。说明成功获得稳定表达人热休克蛋白22基因的内皮细胞株。     

CD59真核表达载体的构建及其对Jurkat细胞增殖的影响

目的构建pIRES-CD59融合基因真核表达载体,探讨重组CD59在Jurkat细胞增殖中的作用。方法 RT-PCR法选择性扩增编码CD59的基因片段,克隆入pIRES真核表达质粒。脂质体法将重组载体转染Jurkat细胞,通过G418筛选获得稳定表达CD59的细胞克隆,利用RT-PCR和Western blot检测细胞中CD59的表达,通过MTT法检测Jurkat细胞的增殖。结果经酶切和测序鉴定表明携带CD59基因的重组质粒构建成功,RT-PCR和Western blot结果显示转染Jurkat细胞的CD59基因高表达,MTT实验显示转染CD59重组质粒的Jurkat细胞增殖速度明显快于对照组(P<0.05)。结论 pIRES-CD59真核表达载体在转染细胞Jurkat中可高表达CD59分子,并可影响Jurkat细胞的增殖,为研究CD59的生物学作用奠定了基础。     

下调Cbp分子促进GPI锚固蛋白CD59参与T细胞活化

目的采用RNA干扰技术构建针对Cbp基因的pSUPER-siCbp重组载体,以建立其高效转染表达体系。方法设计针对Cbp基因的寡核苷酸序列,克隆至线性化的pSUPER载体中并进行鉴定。采用电转染方法转染Jurkat细胞,荧光显微镜观察GFP基因表达,并行RT-PCR和Western blot检测转染细胞中Cbp的表达。利用噻唑蓝(MTT)比色法检测转染重组载体前后各组Jurkat细胞的增殖效应;应用ELISA检测细胞上清中白介素2(IL-2)的变化水平,比较各组差异。结果经过限制性内切酶双酶切分析、DNA PCR和DNA测序鉴定,证实重组质粒pSUPER-siCbp的序列正确。转染重组质粒的Jurkat细胞,可表达绿色荧光蛋白,转染J2-pSUPER-siCbp重组质粒的Jurkat细胞中Cbp基因表达量明显低于其他各组;其细胞增殖能力,IL-2分泌高于其他各组。结论成功构建了靶向人Cbp基因的pSUPER-siCbp载体,转染Jurkat细胞中Cbp表达降低,为以后的CD59与Cbp在T细胞信号转导通路中相互作用研究奠定了基础。     

过氧化体增殖物激活型受体对血管内皮细胞PAI-1转录的调节

目的:探讨血管内皮细胞中过氧化体增殖物激活型受体(PPARs)的表达及其对纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)转录的调节作用。方法:培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)并提取总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增PPARα、δ和γ;以PAI-1启动子控制表达氯霉素转移乙酰酶(CAT)报告基因的重组质粒PAI-pCAT转染人血管内皮细胞株ECV304、并同时分别共转染250、500、1000ng的PPARα或PPARγ表达载体,酶联免疫吸附方法(ELISA)测定CAT表达量-启动子片段转录活性。结果:HUVECs中可检测到PPARα、δ和γ的mRNA水平表达,并且表达量PPARγ明显小于PPARα(P＜0.01)和PPARδ(P＜0.01);增加PPARα表达可剂量依赖地提高ECV304细胞PAI-1转录,而增加PPARγ表达对ECV304细胞PAI-1的转录无影响。结论:血管内皮细胞存在3种PPARs的表达,其中PPARα涉及对PAI-1基因转录的诱导调节。     

表达人IL-17F重组腺病毒载体的构建及其表达产物的功能研究

目的构建表达人白细胞介素IL-17F （hIL-17F）的重组腺病毒载体（Ad-hIL-17F），为进行hIL-17F基因表达抑制血管形成和抑瘤效应的研究奠定基础。方法以pUCm-T/hIL-17F重组质粒为模板PCR扩增hIL-17F，酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack-CMV转移质粒上，PmeⅠ线性化重组质粒pAdTrack-CMV-hIL-17F，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌，经同源重组，获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pTrack-CMV-hIL-17F经PacⅠ线性化后转染QBI-293A细胞，收获Ad-hIL-17F，用RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定人IL-17F基因表达。 MTT法检测hIL-17F基因表达对ECV304细胞的生长抑制作用， ELISA法检测人血管内皮生长因子（ VEGF）和血管生成素（ Ang-1）基因在293A细胞、ECV304细胞中的表达水平；实时定量RT-PCR检测Ad-hIL-17F对293A细胞中人VEGF转录的影响。结果测序显示hIL-17F序列正确，RT-PCR和间接免疫荧光法检测到了IL-17 F基因的表达。 Ad-hIL-17 F能显著抑制ECV304细胞的生长，抑制人VEGF和Ang-1基因在293 A细胞、ECV304细胞中的表达。结论成功构建和获得了hIL-17F的重组腺病毒载体（Ad-hIL-17F）， Ad-hIL-17 F可通过下调VEGF和Ang-1的分泌而抑制血管形成。     

MMP-13基因真核表达载体的构建及其功能研究

目的为了研究MMP-13蛋白在瘢痕形成的作用,我们构建MMP-13基因真核重组表达质粒,检测并鉴定了MMP-13基因在转染了重组质粒的皮肤角质形成细胞HaCat中的表达。方法通过RT-PCR方法将MMP-13基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建其真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)/MMP-13,基因测序鉴定。重组质粒以阳离子脂质体2000介导转染HaCat细胞,RT-PCR检测外源基因的表达,间接免疫荧光和Western blot检测外源蛋白的表达。以明胶酶谱法和MTT法分别检测MMP-13的活性以及其对HaCat细胞增殖的影响。结果通过RT-PCR检测到MMP-13基因在重组质粒转染后的HaCat细胞中大量表达,以间接免疫荧光反应和Western blot可检测到MMP-13蛋白在在重组质粒转染后的HaCat细胞中呈阳性,明胶酶谱法和MTT法检测显示真核表达质粒pcDNA3.1(+)/MMP-13表达的MMP-13蛋白具有活性,并且可以抑制HaCat细胞的增殖。结论构建的重组质粒pcDNA3.1(+)/MMP-13能在Hacat细胞中表达活性蛋白MMP-13,并可以抑制HaCat细胞的增殖,这为研究MMP-13在瘢痕形成中的作用奠定了基础,从而为瘢痕治疗提供有效靶标。     

GFP／HBVX融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

顺式调控元件NF-κB在尼古丁诱导ICAM-1表达中的作用

目的: 研究5' 上游序列在尼古丁诱导细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因转录调控中的作用。 方法: 首先采用分子克隆技术构建实验所需的DNA片段,然后采用真核细胞转染技术将重组DNA片段与内参照质粒一起转染体外培养的内皮细胞并检测尼古丁刺激的转染细胞荧光素酶的相对活性。 结果: 成功构建了6种含有不同长度ICAM-1基因启动子序列以及启动子中NF-κB 和 Sp-1 位点突变序列的荧光素酶报告基因质粒。与对照组相比尼古丁可促进含有启动子序列-579 bp(pGL3E-579/+36)(P＜0.05), -230 bp (pGL3E-230/+36) (P＜0.05) 以及启动子 Sp-1 位点突变体(pGL3E-Sp-1-MU) (P＜0.05)的荧光素酶基因表达,而下游NF-κB位点的删切重组体(pGL3E-134/+36)和含有NF-κB位点突变体(pGL3E- NF-κB -MU)的重组荧光素酶报告基因质粒在尼古丁诱导下与对照组相比荧光素酶表达量无明显差异。结论: ICAM-1基因启动子顺式作用元件下游NF-κB位点在尼古丁诱导ICAM-1基因表达机制中可能起重要作用。     

抗纤维化细胞因子对TGF-β1基因启动转录活性的影响

转化生长因子β1(transforming growth factor-β1)是一类现已明确的致纤维化细胞因子,具有广泛的生物学效应,对细胞外基质(ECM)基因表达、降解、细胞增殖分化、凋亡及免疫功能都具有重要调节作用。前期我们研究发现,TGF-β1启动调控序列中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点-509C>T与肝纤维化进展及血浆中TGF-β1浓度有明显的相关性。本研究旨在探讨抗纤维化细胞因子(IL-10、HGF、IFN-γ)对含TGF-β1基因-509C>T启动调控序列活性的影响。我们以特定-509C>T基因型患者DNA为模板,用PCR方法扩增得到一对长度为2.14kb(-1328~+812)含有-509C>T变异的TGF-β1上游基因片段,并将其与不含启动子的pCAT3-enhancer报告基因载体重组,构建重组体phT-GF2.14C和phTGF2.14T。用脂质体转染法将两种重组体分别转染至正常人肝脏细胞中,分别用IL-10(4ng/ml)、HGF(10ng/ml)、IFN-γ(20ng/ml)干预转染后细胞。ELISA法测定转染细胞的报告基因CAT活性。结果表明:肝细胞转染重组体phTGF2.14C细胞的CAT活性明显高于转染重组体phTGF2.14T(t=12.5882,P=0.0002)。IFN-γ对TGF-β1基因启动子phTGF2.14C、phTGF2.14T均具有显著抑制作用。细胞因子IL-10和HGF对其调控作用不显著。TGF-β1基因-509C>T中C等位基因可明显增强TGF-β1基因上游启动调控序列的转录活性,IFN-γ作为一种抗纤维化细胞因子在基因转录水平对含有两种等位基因-509C>T的TGF-β1基因上游启动调控序列均具有抑制作用。而作为抗纤维化细胞因子的IL-10与HGF在2.14Kb(-1328~+812)区域内对TGF-β1基因上游启动调控序列的作用不显著。     

非病毒载体介导Mn-SOD基因在小鼠肝脏的高表达

目的:研究非病毒载体介导Mn-SOD基因在小鼠肝脏的转染效率。方法:构建Mn-SOD真核表达质粒gWiz/Mn-SOD,通过肠系膜上静脉分支注射阳离子脂质体/质粒混合物,采用RT-PCR、Westernblot、SOD活力测定以及免疫组织化学染色等方法,观察小鼠肝脏Mn-SOD基因表达情况。结果:经肠系膜上静脉分支注射质粒/脂质体混合物几乎不对肝脏造成损伤,注射后8h即可检测到小鼠肝脏有明显的外源性Mn-SODmRNA和蛋白表达;转染前及转染后72h肝细胞线粒体SOD活性分别是(29±17)U/g和(272±56)U/g(P<0.01);免疫组化显示小鼠肝细胞转染率达70%。结论:阳离子脂质体可介导非病毒载体gWiz/Mn-SOD在小鼠肝脏高效安全表达。     

Nonviral HVJ (hemagglutinating virus of Japan) liposome-mediated retrograde gene transfer of human hepatocyte growth factor into rat nervous system promotes functional and histological recovery of the crushed nerve

Hepatocyte growth factor (HGF) is well known to be involved in many biological functions, such as organ regeneration and angiogenesis, and to exert neurotrophic effects on motor, sensory, and parasympathetic neurons. In this study, we gave repeated intramuscular injections of the human HGF gene, using nonviral HVJ (hemagglutinating virus of Japan) liposome method, to examine whether transfection of the rat nervous system with this gene is able to exert neurotrophic effects facilitating recovery of a crushed nerve. The expression of HGF protein and HGF mRNA indicated that gene transfer into the nervous system did occur via retrograde axonal transport. At 4 weeks after crush, electrophysiological examination of the crushed nerve showed a significantly shorter mean latency and a significantly greater mean maximum M-wave amplitude with repeated injections of HGF gene. Furthermore, histological findings showed that the mean diameter of the axons, the axon number and the axon population were significantly larger in the group with repeated injections of HGF gene. The above results show that repeated human HGF gene transfer into the rat nervous system is able to promote crushed-nerve recovery, both electrophysiologically and histologically, and suggest that HGF gene transfer has potential for the treatment of crushed nerve.     

HGF基因转染对裸鼠人淋巴瘤移植瘤的促进作用

 目的：探讨肝细胞生长因子（HGF）基因转染对裸鼠人淋巴瘤移植瘤的促进作用及其机制。方法：采用HGF基因重组质粒pVITRO2-HGF转染的Raji细胞建立裸鼠皮下人淋巴瘤移植瘤模型,动态监测裸鼠体重和肿瘤大小;8周后获取瘤组织,分别采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(TUNEL) 和免疫组化检测移植瘤组织的细胞凋亡和微血管密度（MVD）,并进行相关分析。结果：造模成功率为96.7%。HGF转染组的瘤体积明显大于HGF转染+VP-16组(P<0.01)、未转染组与空载体组(P<0.01),HGF转染+VP-16组也大于对照组(P<0.01),未转染组与空载体组间无显著差异(P>0.05)。pVITRO2-HGF转染组凋亡指数显著低于对照组(P<0.01),经VP-16诱导后凋亡增加(P<0.01),但仍低于对照组(P<0.01)。pVITRO2-HGF转染组的MVD显著高于对照组(P<0.01),但经VP-16诱导后血管增生降低（P<0.01）,但仍高于对照组 (P<0.05),对照组间无显著差异(P>0.05) 。结论：HGF基因转染可显著促进裸鼠人淋巴瘤移植瘤的生长,明显抑制凋亡的发生,这一效应可能与其促进肿瘤血管新生和抑制肿瘤细胞凋亡有关。     

小凹蛋白-1在脐静脉内皮细胞CaR介导NO生成中的作用和机制

目的: 探讨小凹蛋白-1(Cav-1)在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)钙敏感受体(CaR)介导NO生成中的作用和机制。方法: 利用转染技术将构建的 Cav-1 干扰质粒(Cav-1 shRNA)转染入HUVECs,随机分为:(1) 对照组;(2)CaR激动剂 (精胺)组;(3) 精胺+Ca²⁺组;(4) CaR负性变构调节剂(Calhex231)+精胺组;(5) Calhex231+精胺+Ca²⁺组;(6) 非律平(filipin)+精胺组;(7) filipin+精胺+ Ca²⁺组;(8)空质粒 (vehicle)+精胺+Ca²⁺组;(9) Cav-1 shRNA+精胺组;(10) Cav-1 shRNA+精胺+Ca²⁺组。Western blotting检测Cav-1 shRNA转染后HUVECs中CaR和Cav-1蛋白表达,通过NO荧光探针DAF-FM DA负载HUVECs检测细胞内NO的生成;并在提供充足底物的条件下检测细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性。结果: Cav-1 干扰后,Cav-1蛋白表达降低,同时 CaR的膜蛋白表达降低(P<0.05),CaR的浆蛋白表达无变化(P>0.05)。无论细胞外为零钙液或含钙液时,精胺(2 mmol/L)刺激CaR时均引起eNOS活性和NO含量增加(P<0.05),其中细胞外液为含钙液时,eNOS活性和NO含量增加较细胞外为零钙液时更明显(P<0.05),Calhex231 (1 μmol/L)可阻断(细胞外为零钙液)或降低(细胞外液为含钙液) 精胺介导的上述作用 (均P<0.05);此作用亦可被filipin (1.5 mg/L)或 Cav-1 基因沉默减弱(细胞外液为含钙液) (均P<0.05)。结论: HUVECs中Cav-1对CaR介导的NO生成有促进作用,其机制可能与Cav-1影响CaR膜定位及对激动剂反应性有关。     

Hepatocyte growth factor enhances vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis in vitro and in vivo

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is an important mediator of angiogenesis in both physiological and pathological processes. Hepatocyte growth factor (HGF) is a mesenchyme-derived mitogen that also stimulates cell migration, and branching and/or tubular morphogenesis of epithelial and endothelial cells. In the present study, we tested the hypothesis that simultaneous administration of HGF and VEGF would synergistically promote new blood vessel formation. HGF acted in concert with VEGF to promote human endothelial cell survival and tubulogenesis in 3-D type I collagen gels, a response that did not occur with either growth factor alone. The synergistic effects of VEGF and HGF on endothelial survival correlated with greatly augmented mRNA levels for the anti-apoptotic genes Bcl-2 and A1. Co-culture experiments with human neonatal dermal fibroblasts and human umbilical vein endothelial cells demonstrated that neonatal dermal fibroblasts, in combination with VEGF, stimulated human umbilical vein endothelial cells tubulogenesis through the paracrine secretion of HGF. Finally, in vivo experiments demonstrated that the combination of HGF and VEGF increased neovascularization in the rat corneal assay greater than either growth factor alone. We suggest that combination therapy using HGF and VEGF co-administration may provide a more effective strategy to achieve therapeutic angiogenesis.