玻璃化冷冻技术在卵母细胞冻存上的应用

玻璃化冷冻保存技术由于具有操作简便、冻融损伤小并且不需要仪器精密控温的特点，已经成为最具应用前景的冷冻保存技术。玻璃化冷冻受到冷冻保护剂成分、浓度、作用时间、作用温度以及降温速率的影响。卵母细胞由于其特殊的细胞学特性，冷冻保存相对困难。玻璃化冻存技术应用于卵母细胞的冷冻保存能获得较好的存活率、受精率以及卵裂率。但是，经过玻璃化冻融的卵母细胞受精后囊胚形成率还不理想，高浓度的冷冻保护剂是否具有细胞毒性，是否会影响胚胎发育等问题尚待解答。因此，还需要更深入的研究来改善卵母细胞的玻璃化冷冻保存技术。     

卵巢组织玻璃化冷冻保存和移植的研究进展

背景：卵巢组织玻璃化冷冻技术作为一种快速、简便、经济的冷冻方式被逐渐应用于卵巢组织的保存。 目的：综述国内外关于卵巢组织玻璃化冷冻保存及移植的研究进展。 方法：由第一作者检索1995/2011 PubMed数据库及清华同方数据库有关卵巢组织玻璃化冷冻保存以及卵巢组织移植技术等方面的文献。 结果与结论：玻璃化冷冻是一个超高速的冷冻过程,形成高黏度的“玻璃样凝固状态”,可以避免由于冰晶形成所造成的细胞损伤。但至今玻璃化冷冻仍缺乏统一的标准化程序。影响卵巢组织玻璃化冷冻保存效果的主要因素有卵巢组织块的大小、冷冻保护剂的种类、渗透平衡的时间和温度、冷冻载体等。随着低温生物学的发展和卵巢组织冷冻保存效果的提高,卵巢组织的移植已经具备了一定的临床应用可行性。到目前为止,全世界已有一系列关于冻存卵巢组织移植后成功妊娠及分娩的报道,移植成功的关键在于减少缺血再灌注损伤和促进新生血管的形成。关键词：卵巢组织;玻璃化冷冻;移植;保存;综述 缩略语注释：SSV：solid-surface vitrification,固体表面;NIV：needle immersed vitrification,针浸润玻璃化冷冻法;DCV：direct cover vitrification,直接覆盖玻璃化方法 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.18.039     

玻璃化冷冻保存细胞、组织研究进展

对具有生物活性的细胞和组织进行玻璃化冷冻保存,可以避免冷冻保存过程中细胞内外冰晶的形成,减轻冷冻保存对细胞和组织造成的损伤,达到较好的储存效果。本文综述了玻璃化冷冻保存细胞、组织的关键因素及目前的研究进展。     

玻璃化冷冻保存细胞、组织研究进展

对具有生物活性的细胞和组织进行玻璃化冷冻保存，可以避免冷冻保存过程中细胞内外冰晶的形成，减轻冷冻保存对细胞和组织造成的损伤，达到较好的储存效果。本综述了玻璃化冷冻保存细胞、组织的关键因素及目前的研究进展。     

不同冻存方法对羊膜超微结构和上皮细胞活性的影响

背景：羊膜冻存方法众多,对羊膜超微结构和生物活性的影响不一,目前尚无有效的冻存方法。 目的：比较不同冻存方法对羊膜超微结构和活性影响的研究,探寻更为理想的冻存方法。 方法：将新鲜羊膜采用深低温和玻璃化冻存法保存,分别于冻存后3,6个月复苏羊膜,以新鲜羊膜组织为对照组,比较羊膜的超微结构差异、羊膜上皮细胞离体氧分压和乳酸脱氢酶活性。 结果与结论：不同冻存方法保存的羊膜超微结构有明显改变,但玻璃化冻存对其超微结构的影响相对较小;与新鲜羊膜相比较,深低温冻存组3,6个月羊膜的乳酸脱氢酶灰度值和氧分压明显降低(P < 0.05);玻璃化冻存组6个月后的羊膜乳酸脱氢酶灰度值和氧分压明显降低(P < 0.05),而玻璃化冻存组3个月后的上述检测结果与新鲜羊膜相比差异无显著性意义(P > 0.05)。结果证实,羊膜的玻璃化冻存技术优于深低温冻存技术,不仅维持了羊膜的超微结构,而且保持了羊膜上皮细胞的功能和活性。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

生物活性产品玻璃化冷冻保存研究进展

综述了有关动物细胞、胚胎、组织、器官和工程化组织的玻璃化冷冻保存问题。对玻璃化冻存技术基本原理及其在生物产品保存中的冷冻、复温方法,玻璃化液的组成、作用及其对保存产品的影响等进行了阐述。指出玻璃化冷冻保存可能是长时间保存有活性的生物产品简单、适用、有效的方法。同时指出玻璃化冷冻保存方法面临的问题及发展的方向。     

囊胚玻璃化冻存前激光打孔对冻融后移植效果的影响

背景：一系列研究均表明人工皱缩囊胚腔能明显提高囊胚的玻璃化冻融效果,但在皱缩过程中采用的物理方法和使用材料的不同可能会造成囊胚细胞的机械性损伤。 目的：探讨囊胚玻璃化冻存前激光打孔对冻融后移植效果的影响。 方法：3例不孕患者,平均年龄30岁,于囊胚玻璃化冻存前行激光打孔使囊胚皱缩,平均冻存时间为1年,确定移植前给予解冻。 结果与结论：3例患者中有2例取得了满意的妊娠结局,1例未妊娠。说明采用激光辅助打孔的方法使囊胚皱缩,结合玻璃化冻融后行囊胚移植安全有效。     

促卵泡刺激素干预改善绵羊卵巢组织玻璃化冻存后异种移植的效果研究

背景:卵巢皮质片移植是无血管吻合移植,因此,提高卵巢组织对冻存-解冻和移植后缺血的耐受力是提高冻存后移植物卵泡存活和延长功能寿命的关键环节。目的:观察促卵泡刺激素在玻璃化冻存过程中对绵羊卵巢组织形态和功能的保存效果,为成人卵巢组织的冻存提供技术方法。方法:BALB/c品系雌性裸鼠随机分为3组。均行羊卵巢皮质片裸鼠异位移植:①新鲜移植对照组,取材后即移植。②玻璃化冻存移植组,采用玻璃化冻存解冻后移植,所用液体均未添加促卵泡刺激素。③添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组,采用冷冻液、解冻液和培养液均添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存后移植。移植后检测受体鼠动情周期恢复率、恢复时间、卵泡数和发育状况,于移植后4周取移植卵巢进行组织学观察、并行血清雌二醇水平分析。结果与结论:含促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组与新鲜移植组相比动情周期恢复率、每高倍视野卵泡计数差异均无显著性意义(P0.05),卵泡计数高于未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组(P0.05);动情周期恢复需要的天数接近于新鲜移植组,明显短于未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组(P0.05)。移植后4周,含促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组组织学观察见卵泡发育,未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组仅偶见原始卵泡。含促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组与新鲜移植组相比血清雌二醇水平差异无显著性意义(P0.05),显著高于未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组(P0.05)。结果提示,在玻璃化液中加入促卵泡刺激素可提高冻存绵羊卵巢组织移植后卵泡存活率。     

组织工程研究与开发中的冻存技术

综述了有关组织工程种子细胞、支架材料和工程化组织的冷冻保存问题。对冻存技术在组织工程研究和开发中的重要作用进行了阐述。指出低温保存可能是长时间保存有活性的组织工程产品的有效方法之一。组织工程种子细胞采用低温冷冻保存 ;组织工程支架材料用冷冻干燥保存 ;工程化组织的保存采用玻璃化冷冻保存方法。     

不同冻存方法对羊膜超微结构和上皮细胞活性的影响（英文）

背景:羊膜冻存方法众多,对羊膜超微结构和生物活性的影响不一,目前尚无有效的冻存方法。目的:比较不同冻存方法对羊膜超微结构和活性影响的研究,探寻更为理想的冻存方法。方法:将新鲜羊膜采用深低温和玻璃化冻存法保存,分别于冻存后3,6个月复苏羊膜,以新鲜羊膜组织为对照组,比较羊膜的超微结构差异、羊膜上皮细胞离体氧分压和乳酸脱氢酶活性。结果与结论:不同冻存方法保存的羊膜超微结构有明显改变,但玻璃化冻存对其超微结构的影响相对较小;与新鲜羊膜相比较,深低温冻存组3,6个月羊膜的乳酸脱氢酶灰度值和氧分压明显降低(P0.05);玻璃化冻存组6个月后的羊膜乳酸脱氢酶灰度值和氧分压明显降低(P0.05),而玻璃化冻存组3个月后的上述检测结果与新鲜羊膜相比差异无显著性意义(P0.05)。结果证实,羊膜的玻璃化冻存技术优于深低温冻存技术,不仅维持了羊膜的超微结构,而且保持了羊膜上皮细胞的功能和活性。     

微囊化细胞的低温保存

背景：微胶囊是一种有效的免疫隔离工具,低温冷冻方便了微囊的保存与运输,有利于微囊化技术在临床的推广应用。 目的：综述微囊低温保存技术中微囊低温保存特点、不同保存方法优缺点、研究方法及微囊低温保存实验现状。 方法：检索1980/2010 PubMed数据库,1991/2010万方数据库、维普数据库有关微囊低温保存研究,低温保存工艺理论及专用仪器,微囊低温保存技术医学应用的文献。 结果与结论：微囊化细胞在低温保存过程中的损伤特点与细胞、组织有很大不同。微囊相对较大的尺寸与复杂的囊壁半透膜结构,使得微囊结构与囊内细胞更容易受到溶质损伤与冰晶损伤,因此不能简单套用单细胞悬液的低温保存方案。慢速冷却法与玻璃化法是两种常见的微囊化细胞低温保存方法,各有利弊。微囊化细胞低温保存技术尚未成熟,在开发新型微囊低温保存设备,优化设计微囊低温保存方案的同时,需进一步加强对微囊冻存机制更深层次的探索。     

成骨细胞培养及冻存复苏后生物学特性比较

目的 :了解冻存复苏过程对保持成骨细胞生物学特性的影响。方法 :通过细胞组化、免疫组化以及图像分析等方法对冻存和非冻存 (新鲜制备 )的细胞在其形态及功能方面进行了比较。结果 :两组ALP染色、茜素红S法、V G法、免疫组化法的结果均差异无显著性 (P >0 0 5 )。但细胞存活率与冻存时间密切相关 ;随冻存时间延长 ,其存活率下降。结论 :两组细胞保持了某些相似的生物学行为 ,如细胞形态、生长过程、基质分泌等。冻存时间对保存的成骨细胞存活率有影响。     

Magnetic cryopreservation for dental pulp stem cells

Magnetic cryopreservation has been successfully used for tooth banking with satisfactory implantation outcomes, suggesting that the method preserves human periodontal ligament cells and dental pulp stem cells (DPSCs). Therefore, magnetic cryopreservation may be applied for the preservation of DPSCs; however, this method has not been evaluated yet. A reliable cryopreservation method for live-cell preservation is important for the clinical applications of regenerative medicine. The conventional slow-freezing procedure with 10% dimethylsulfoxide (DMSO) may not be appropriate for stem cell-based therapies because DMSO is cytotoxic. The objective of this study was to investigate whether magnetic cryopreservation can be applied for DPSC cryopreservation. Cells isolated from human dental pulp were subjected to magnetic cryopreservation. Postthawing cell viability, adhesion, proliferation, expression of markers for mesenchymal stem cells (MSCs), differentiation ability of magnetically cryopreserved DPSCs and DNA stability were compared to those of cells subjected to the conventional slow-freezing method. The results indicated that a serum-free cryopreservation medium (SFM) containing 3% DMSO is optimal for magnetic cryopreservation. Post-thaw magnetically cryopreserved DPSCs express MSC markers, and perform osteogenesis and adipogenesis after induction similarly to fresh MSCs. No significant DNA damage was found in magnetically cryopreserved DPSCs. Magnetic cryopreservation is thus a reliable and effective method for storage of DPSCs. The smaller amount of DMSO required in SFM for cryopreservation is beneficial for the clinical applications of post-thaw cells in regenerative medicine.     

改善卵母细胞冷冻损伤的研究进展

卵母细胞的冷冻保存是女性生育力保存最具前景的技术。但由于卵母细胞特殊的生理结构,极易在冷冻过程中受到损伤。因此改进冷冻方法,添加冷冻保护剂(包括细胞骨架稳定剂和抗氧化剂)可以改善冷冻损伤,增加发育潜能,同时对于冷冻技术的运用有着重要意义。     

卵子冷冻技术在IVF-ET中的应用

介绍作为辅助生殖技术一项新技术，卵子冷冻技术，方法 包括卵子冷冻的选取。卵子的预处理，卵子的冷冻，复苏，复温，复苏后的培养与受精，以及影响卵子冻存率和受精率的因素。文中还介绍了该技术的临床应用和发展前景。     

人多能干细胞的冷冻与保存

背景：人多能干细胞的出现与发展是近年来生物医学研究领域的重大突破。但其在基础/临床研究中的广泛应用还有诸多限制,建立安全有效标准化的冷冻保存方案是人多能干细胞广泛应用面临的重大挑战。 目的：回顾人多能干细胞冷冻领域的研究进展,探索造成冷冻损伤的原因和机制及改进方式,致力于促进新的更有效的冷冻方案形成。 方法：以“人多能干细胞、人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞、玻璃化、程序化冷冻、慢冻法、冷冻保存”为中文检索词,以“human pluripotent stem cells,human embryonic stem cell,human introduced pluripotent stem cell,vitrification,programmed cryopreservation,slow-freezing,cryopreservation”为英文检索词,应用计算机检索中国知网全文数据库、万方全文数据库、维普(VIP)期刊全文数据库、PubMed数据库有关人多能干细胞冷冻保存技术的文献,排除与研究目的无关及重复文献,保留58篇文献进一步总结分析。 结果与结论：了解人多能干细胞冷冻过程中造成冷冻损伤的原因和机制,是寻找高效的冻存方案的关键。需要更清晰的了解冷冻过程中损伤的原理,改进和创新低温生物技术来避免各种冷冻损伤的发生并致力于探讨可重复的,高效的,符合GMP要求的,能大规模冻人多能干细胞的方案。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

Ovarian tissue viability following whole ovine ovary cryopreservation: assessing the effects of sphingosine-1-phosphate inclusion

BACKGROUND: Cryopreservation is hypothesized to result in apoptosis, contributing to stromal damage and follicle loss in ovarian tissue. This study investigated tissue viability following whole ovine ovary cryopreservation and examined the effects of the anti-apoptotic agent sphingosine-1-phosphate (S-1-P) on ovarian cryopreservation efficiency. METHODS: Whole ovine ovaries were cryoperfused and subjected to slow-freeze, rapid-thaw cryopreservation before a range of functional viability tests were performed. The effects of 20 micromol(-1) S-1-P, in the cryopreservation media, were then assessed against a control cryopreservation media and non-frozen tissue. RESULTS: Granulosa cell viability (assessed by trypan blue) was not significantly affected, however, Ki67 expression, indicative of cellular proliferation, was reduced following cryopreservation (P< 0.05). Following S-1-P supplementation, granulosa cell viability was not affected by either cryopreservation or S-1-P inclusion. Bromodeoxyuridine uptake, demonstrating DNA synthesis, was seen in both cryopreserved and fresh cortical tissue and the viability stain, 5(6)carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, showed many viable small follicles. Cryopreservation increased arterial endothelial disruption (P< 0.01), but not internal elastic lamina rupture or venous damage. However, S-1-P supplementation did not improve ovarian or vascular tissue survival. CONCLUSIONS: These results are encouraging for whole ovary cryopreservation, demonstrating maintained cell viability, however, they do not support S-1-P inclusion at this concentration to improve tissue viability following cryopreservation.     

Cryopreservation of suckling pig hepatocytes.

To determine the best and simplest method for cryopreservation of pig hepatocytes, we compared immediate cryopreservation with cryopreservation after short-term culture. Suckling pig hepatocytes were isolated by a modified 2-step in situ collagenase perfusion method, suspended in serum-free medium, and preserved for 10 da by two cryopreservation methods. Serial measurements were made of cell viability, LDH release, synthesis of protein, urea and glucose, glucose-6-phosphatase (G-6-Pase) activity, and diazepam transformation after thawing. These measurements were performed on both groups of cultured hepatocytes, and on freshly isolated hepatocytes, which served as a control. High viability (>95%)of thawed hepatocytes was obtained and maintained in both cryopreservation groups. There were no significant differences in cell viability, protein synthesis, glucose synthesis, G-6-Pase activity, or diazepam transformation between the two cryopreservation groups. In the immediate cryopreservation group, urea synthesis was less than in the group with cryopreservation after short-term culture. Protein synthesis, glucose synthesis, and diazepam transformation were lower in both cryopreserved groups than in the controls. The results showed that a protocol of immediate cryopreservation of hepatocytes in RPMI-1640 medium containing 10% DMSO, hormones, growth factors, and 10% newborn bovine serum, together with rate-controlled freezing and rapid thawing, provides indices of cell viability and function during subsequent serum-free culture that are comparable to hepatocytes cryopreserved after short-term culture, except for lower urea production. This simple procedure can be used in studies of bioartificial liver and hepatocyte transplantation.     

组织工程化肌腱种子细胞深低温保存的实验研究

对肌腱种子细胞进行深低温保存，研究保存过程中多个环节的影响因索对细胞存活率的影响及深低温保存对种子细胞生物学特性、胶原分泌功能的影响。实验结果表明二甲基亚砜是肌腱种子细胞深低温保存中比较好的抗冻保护剂；冻存后使用与培养时不同的营养血清处理对细胞有损害，可降低细胞存活率；在冷冻保存过程中，细胞存活率与细胞浓度有一定关系，浓度太低可能降低细胞存活率；细胞在冷冻保存时，降温速度对细胞存活率有影响，慢速的分步降温组细胞存活率明显高于直接人液氮的快速降温组；采用10％二甲基亚砜加15%小牛血清加75% DMEM配方保存肌腱种子细胞，对其分泌胶原功能无明显影响，对其生长曲线、细胞周期及染色体众数无明显改变，适于肌腱种子细胞的保存。