乳鼠心肌细胞可成片生长的分离和培养方法北大核心

背景:传统方法培养的心肌细胞活力、纯度仍不高,细胞多呈簇状生长,细胞与细胞之间的联系较少,细胞多呈单个搏动。目的:改进传统的乳鼠心肌细胞培养方法,获得纯度高、成片生长的心肌细胞。方法:运用0.1%胰蛋白酶4℃过夜消化心肌组织后加入Ⅱ型胶原酶重复消化,二次差速贴壁分离法联合化学抑制剂纯化心肌细胞。倒置相差显微镜下动态观察心肌细胞形态变化,培养48 h后用抗心肌肌钙蛋白T抗体鉴定心肌细胞纯度,连续10 d隔日记录心肌细胞的搏动频率。结果与结论:(1)心肌细胞在24 h内贴壁,72 h后成簇状分布,5-7 d细胞连接成片生长;(2)细胞存活率为96%,免疫荧光鉴定心肌细胞纯度97%以上,连续10 d内心肌细胞搏动频率差异无显著性意义(P>0.05);(3)综上,通过这种改进的培养方式获得成片生长的心肌细胞纯度、活力更高,是一种更为有效的乳鼠心肌细胞培养方法。     

转化生长因子β-1联合内脏内胚层样END-2细胞共培养对小鼠胚胎干细胞体外分化为心肌细胞的实验研究

目的添加转化生长因子_1β(TGF_β1)以及与内脏内胚层样END_2细胞共培养,定向诱导胚胎干细胞(ESCs)分化,探索联合使用化学诱导法与共培养法对ESCs的心肌细胞定向诱导分化作用。方法将ESCs悬浮培养形成2~3 d类胚体(EBs),再向培养液内添加TGF_β1,或(和)将2~3 d EBs与END_2细胞或END_2细胞条件培养液共培养。自然分化为对照组。免疫荧光技术检测心肌细胞特异性肌动蛋白(α_actin)及肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。结果向培养液添加TGF_β1或将2~3 d EBs与END_2细胞或END_2细胞条件培养液共培养,各自有(43±2.08)%(P<0.01),(69±3.61)%(P<0.01),(65±3.06)%(P<0.01)的EBs出现自发节律性收缩,均表达心肌细胞特异性蛋白α_Actin和TnT,观察到心肌样超微结构。自然分化组发生自发节律性收缩的EBs只有(12±1.53)%,尤其是联合使用两种诱导方法,自发性收缩的EBs高达(91±1.52)%(P<0.01),收缩区域较单一诱导组大,且细胞形态较单一。结论联合使用化学诱导和共培养2种诱导法对ESCs的心肌细胞定向分化有协同作用。     

低温致乳鼠心肌细胞损伤中Bim蛋白的作用及PI3K/Akt相关机制

背景：寒冷刺激可引发心血管疾病或导致其加重,研究极端气候条件下心血管疾病的发病规律及其分子生物学机制对制定有效的防范和治疗措施有重要意义。 目的：观察低温对心肌细胞凋亡率、乳酸脱氢酶活性及促凋亡蛋白Bim表达的影响,并从PI3K/Akt信号通路探讨低温影响心肌细胞中Bim表达的可能途径。 方法：将体外培养的心肌细胞在4 ℃冷水浴中处理1 h后,放入37 ℃ CO₂培养箱中继续培养0,4,8,12,16,24 h,Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率,MTS/PMS法检测细胞存活情况,全自动生化分析仪测细胞培养基中乳酸脱氢酶活性。Western blot测定Bim在心肌细胞中的表达情况,并在Bim蛋白开始表达的时间点向培养的心肌细胞中加入PI3K/Akt阻断剂LY29004,观察心肌细胞凋亡率、乳酸脱氢酶活性及Bim、p-PI3K蛋白表达的变化。  结果与结论：冷处理后,心肌细胞凋亡率增加、存活率降低、培养基中乳酸脱氢酶活性增高、Bim表达增加(P < 0.05),均在冷处理后24 h达到极点。加入LY29004后,心肌细胞凋亡率增加更明显,培养基中乳酸脱氢酶活性及Bim表达也有所增加,p-PI3K表达降低(P < 0.05)。说明低温能够通过促进Bim表达诱导心肌细胞凋亡,而PI3K/AKT信号通路可能参与了Bim的诱导表达。     

体外不同诱导条件对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

目的 研究不同方法诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为心肌细胞（CM）的能力及表达心肌细胞特异性标记物的差别。方法 分离培养MSCs及CM,第三代MSCs经DAPI标记后分别进行5－aza诱导,与CM共培养和单独培养。1、2、3和4周观察细胞形态变化及免疫细胞化学鉴定cTnT和Cx43。结果 单独培养未见有细胞收缩,cTnT和Cx43表达阴性;诱导组和共培养组,培养至4周时细胞排列方向一致,成肌性排列,诱导1周时cTnT和Cx43表达阴性,而共培养组第5天cTnT和Cx43即开始表达,随着时间延长,两组cTnT和Cx43表达逐渐增加;相同周数内,共培养组的表达阳性率均高于诱导组（P＜0.01)。结论 MSCs经5－aza诱导和与CM共培养,可转化为心肌样细胞并表达cTnT和Cx43,且共培养MSCs分化为心肌细胞的能力比5－aza诱导强。     

与心肌细胞共培养的小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞分化

目的 探讨心肌细胞促进胚胎干细胞（ESCs）分化为心肌样细胞的诱导作用。方法 收集小鼠3.5d胚龄的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,4～5d后取内细胞团接种在饲养层上分离培养出ESCs。取3～5代ESCs,先将ESCs悬浮培养形成2～3d的拟胚体(EBs),再与新生大鼠心肌细胞共培养诱导向心肌细胞分化,相差显微镜下观察分化细胞的形态学变化,免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)、α－肌动蛋白（α-Actin）的表达。结果 诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的拟胚体出现,12d时第2组约有93%的拟胚体出现节律性收缩,显著高于其他各组,均表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、а-actin,心肌细胞直接接触诱导组其分化比率达56.5%,高于其他各组,并且分化的细胞形态较单一。结论 心肌细胞和心肌细胞裂解液均可诱导ESCs向心肌细胞定向分化,且心肌细胞的诱导作用强于心肌细胞裂解液。     

胞外基质蛋白与血小板生长因子对气道平滑肌细胞的影响

目的研究层黏蛋白(laminin,LN)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、I型胶原(collagen I,Col I)3种不同细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)蛋白对血小板生长因子(platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)诱导的气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)形态及收缩变化的影响。方法将ASMCs分别附着在LN、ColI、FN表衬的细胞培养皿中,并分成2组,分别在有或无PDGF-BB(10 mg/L)的无血清培养基中培养0～5 d。然后采用显微图像方法观测细胞形态和宽长比,光学磁微粒扭转细胞测量方法测量细胞受KCl或组胺(histamine)刺激时的收缩反应。结果在有PDGF-BB的培养条件下,ASMCs形态总体上变细变长,即细胞宽长比减小,但附着在LN上的ASMCs比附着在Col I或FN上的细胞宽长比相对要大。在无PDGF-BB的培养条件下,ASMCs对KCl刺激的收缩响应随培养时间增加而增加,但不受ECM蛋白成分的影响。而在有PDGF-BB的培养条件下,ASMCs对KCl或Histamine刺激的收缩响应总体上随培养时间呈下降趋势,但附着在LN上的ASMCs收缩响应下降程度相对较小。结论 ASMCs受PDGF-BB作用时,其形态和收缩性的变化与不同ECM蛋白成分有关,相对于Col I和FN,附着在LN的细胞形态和收缩性的变化较小。ECM蛋白成分对PDGF-BB诱导的ASMCs形态和收缩性变化的差异性影响,对于深入认识基质蛋白、炎症因子与气道平滑肌细胞的相互作用及其与哮喘病理生理机制的关系具有重要意义。     

Notch信号分子在ICA诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的作用

目的观察Notch信号通路在淫羊藿苷(ICA)诱导胚胎干细胞(ESC)向心肌细胞分化过程中的作用。方法实验分为自然分化组、ICA诱导分化组及ICA+MW167(Notch信号抑制剂)组。相差显微镜下观察各组自发性节律收缩细胞出现情况的差别,免疫荧光染色观察各组细胞心肌特异性蛋白ANP的表达,RT-PCR检测各组细胞ANP mRNA的表达。结果 ICA+MW167组自发性节律收缩细胞数明显多于自然分化组与ICA诱导分化组,ICA+MW167组心肌细胞特异性蛋白ANPmRNA和蛋白的表达水平随培养时间延长逐渐增加,明显高于自然分化组与ICA诱导分化组。结论 Notch信号通路参与了ICA诱导ESC分化为心肌细胞的过程,抑制该信号通路可以明显提高心肌细胞特异性ANP基因及蛋白的表达,上调分化的心肌细胞比率。     

肝细胞生长因子和类胰岛素样生长因子对心肌干细胞的诱导作用

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)和类胰岛素样生长因子(IGF1)在外能否诱导心肌干细胞(CSCs)发生增殖并向心肌细胞定向分化。方法组织贴块法分离培养心肌干细胞,免疫荧光技术鉴定c-kit和CD34表达,流式细胞仪分选纯化c-kit+细胞,CFDA SE荧光探针示踪培养检测细胞增殖特征。实验分为单纯心肌干细胞组和与心肌共培养组,分别用HGF和IGF1干预,倒置显微镜观察细胞不同时期数量与形态的变化,活细胞工作站观察CFDA SE示踪剂荧光强弱,采集图像,进行统计学分析。免疫荧光技术检测Nkx2.5、心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达。结果单纯心肌干细胞组,生长因子刺激后心肌干细胞数量与形态均无明显变化。与心肌共培养组,细胞均发生增殖与形态变化,Nkx2.5、cTnT阳性表达,有个别心肌干细胞分化为自发搏动的心肌细胞。结论心肌干细胞与心肌细胞共培养条件下,HGF和IGF1能够促进心肌干细胞增殖,联合作用能够诱导心肌干细胞向心肌细胞分化。     

大鼠松果体分泌物释放到蛛网膜下隙脑脊液途径的电镜研究

为探讨松果体分泌物在细胞外转运到蛛网膜下隙脑脊液途径的结构基础,本研究运用透射电镜技术对成年大鼠松果体浅部进行了观察。结果显示:(1)大鼠松果体毛细血管为有孔型(孔径50nm),借基膜与宽阔的血管周隙分隔;(2)松果体细胞借基膜与结缔组织间隙分隔,松果体细胞之间形成与松果体囊结缔组织间隙及血管周隙相通的细胞间小管;(3)松果体囊表面为扁平上皮,上皮下为疏松结缔组织间隙,其内可见松果体细胞的胞体和突起。囊上皮细胞间存在瓣膜样连接(叶瓣间宽处可达1μm)和囊上皮孔(2.5μm)。以上结果提示,松果体细胞表面可分为结缔组织间隙面、连接面和细胞间小管面三个功能面,松果体分泌物可能通过血管周隙-细胞间小管-松果体囊结缔组织间隙-囊上皮瓣膜样连接或囊上皮孔,释放入蛛网膜下隙脑脊液中转运。     

微环境对体外间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用

目的研究心肌组织中何种细胞对骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞定向分化起决定性作用。方法分离培养骨髓MSCs、心肌细胞(CM)和内皮细胞(EC)。MSCs经BrdU标记后与CM、EC分别共培养和单独培养,通过形态学、免疫细胞化学和双重免疫细胞化学鉴定。结果分离培养的MSCs、CM和EC纯度高于95%。标记MSCs与CM共培养后,细胞具有心肌细胞样形态。4周时,有44%的细胞BrdU与肌动蛋白(sarcomeric actin)或连接蛋白-43(connexin-43)双重免疫细胞化学染色阳性。与EC共培养以及单独培养时,MSCs形态变化不明显,无双染阳性细胞出现。结论CM对骨髓MSCs向心肌样细胞的定向分化具有重要作用。     

The universal muscular chain reaction,muscle spasm,Torsions, ruptures and extravasations. Chameleons of pathology and some manifestations of simple muscular disorders

Most bodily functions require the coordinated actions of complementary and supplementary paired muscle groups. Where this essential muscular cooperation is lacking, hollow organs may burst and others become literally screwed up, giving rise to many similar spastic diseases such as Torticollis, Twisted ovarian cyst, Torsion of the Testis, Volvulus of the intestines, Varicose Veins, Megacolon, Aortamegaly, Scoliosis, Erb's Palsy, Peyronie's Disease, Main-en-Griffe, Undescended Foot (Pes Cavus), Talipes, Strabismus. Spasm is “panenepidemic” and unclassified examples of Torsion Dystonia and Dyskinesia really are as common as debt and taxes.     

Hypo- und Hypermagnesämie aus kardiologischer Sicht

Zusammenfassung Eine Reihe pathologischer Zustände bedingen Magnesiummangel. Zustände mit Hypermagnesämie sind ebenfalls bekannt, doch wesentlich seltener. Für den Kardiologen beachtenswert ist, daß unter Therapie mit bestimmten Diuretica bei Herzinsuffizienz, bei Herzinfarkt, Kardiomyopathie, Digitalisintoxikation und bestimmten Herzrhythmusstörungen Hypomagnesämie beobachtet wurde. Leider kann in der klinischen Routine nur ein extracelluläres Magnesiumdefizit durch Serumbestimmungen gemessen werden; über Magnesiummangel einzelner Organe kann nichts ausgesagt werden. Hinweise für Magnesiummangel geben aber neben der Messung des Serumspiegels Anamnese, klinischer Befund, bestimmte EKG-Veränderungen wie auch evtl. Hypokalämie, ein Zustand, bei dem sich oft — besonders bei Aldosteronismus — parallele Veränderungen zeigten.Tierexperimente deuten darauf hin, daß infarktähnliche Läsionen unter Magnesiummangel entstehen, doch ob Herzinfarkt beim Menschen durch Magnesiummangel ausgelöst werden kann, ist noch ungeklärt. In Leichenherzen zeigte sich im Infarktgebiet neben Calciumakkumulation signifikanter Magnesiumverlust, wobei unklar blieb, ob sich Ursache oder Folge des Infarktes widerspiegelten. Falls ein ursächlicher Zusammenhang besteht, ist er im Myokardstoffwechsel selbst zu suchen, wie bei der Alkoholkardiomyopathie, wo myokardialer Magnesiummangel zumindest als pathogenetischer Teilfaktor anerkannt wird. Andererseits versucht man aber auch Beziehungen zwischen Atherosklerose, Blutgerinnung und Hypomagnesämie herzustellen, in der Meinung, daß Magnesiummangel auch über den coronaren Pathomechanismus des Herzinfarktes wirken könnte. Sicher scheint, daß gewisse EKG-Veränderungen und Herzrhythmusstörungen durch einen irritierten Magnesiumhaushalt bedingt sein können, da sie bei Gabe bzw. Entzug von Magnesium verschwinden. Daß Magnesiummangel die Glykosidtoleranz verringert, wird tierexperimentell bestätigt. Unter Hypomagnesämie bewirkt Acetylstrophanthidin eher und länger Rhythmusstörungen als ohne, außerdem lassen diese sich durch Magnesiumgaben eliminieren. Da in gewissen Fällen spontane und digitalisinduzierte Herzrythmusstörungen durch Magnesiuminjektionen beseitigt wurden, scheint Magnesium als Therapeuticum angebracht. Einsatz verschiedener Magnesiumsalze bei Angina pectoris, degenerativen Herzerkrankungen und Herzinsuffizienz ohne geprüften und offensichtlich gestörten Magnesiumhaushalt ist fragwürdig, weil keine eindeutigen klinischen Erfolgsbeweise vorliegen. Immerhin mag es aber larvierte, durch Serumbestimmungen nicht erfaßbare Mangelzustände geben. Allgemein erscheint es aus kardiologischer Sicht ratsam, den Magnesiumhaushalt zu überwachen und in entsprechenden Fällen auszugleichen, um möglichen Myokardläsionen oder fatalen Herzrhythmusstörungen entgegenzuwirken.     

Environmental risk factors and their role in the management of atopic dermatitis

Introduction: The etiology of atopic dermatitis (AD) is multifactorial with interaction between genetics, immune and environmental factors.

Areas covered: We review the role of prenatal exposures, irritants and pruritogens, pathogens, climate factors, including temperature, humidity, ultraviolet radiation, outdoor and indoor air pollutants, tobacco smoke exposure, water hardness, urban vs. rural living, diet, breastfeeding, probiotics and prebiotics on AD.

Expert commentary: The increased global prevalence of AD cannot be attributed to genetics alone, suggesting that evolving environmental exposures may trigger and/or flare disease in predisposed individuals. There is a complex interplay between different environmental factors, including individual use of personal care products and exposure to climate, pollution, food and other exogenous factors. Understanding these complex risk factors is crucial to developing targeted interventions to prevent the disease in millions. Moreover, patients require counseling on optimal regimens for minimization of exposure to irritants and pruritogens and other harmful exposures.     

HLA genes in Amerindians from Mexico San Vicente Tancuayalab Teenek/Huastecos

Huastecos or Teenek Amerindians are presently living at North East Mexico (San Luis Potosi State). They have probably one of the most ancient culture of Mexico and Central America together with Mayas and Olmec groups with which also show close relationships. Proximity to Atlantic Ocean/Mexican Gulf originated that Spaniards had very early contact with them at about 1519 CE or before. In the present paper we have aimed to study HLA gene profile which may be useful for HLA and disease epidemiology and transplant programs in Teeneks. HLA-DRB1*04:07, -DRB1*14:06 and -DRB1*04:11 have been found in high frequency like in other Amerindian groups. High frequency typical Amerindians HLA extended haplotypes have been found, such as A*02-B*35-DRB1*04:07-DQB1*03:02; A*68-B*39-DRB1*04:07-DQB1*03:02 and A*02-B*39-DRB1*04:07-DQB1*03:02; also new haplotypes have been described, like A*02-B*52-DRB1*04:11-DQB1*03:02, A*68-B*35-DRB1*14:02-DQB1*03:01 and A*68-B*40-DRB1*16:02-DQB1*03:01. Genetic proximity is observed not only to linguistically close Mayans, but also to Mazatecans, Mixtecans and Zapotecans, who speak an altogether different languages; it shows once more that genes and languages do not correlate. This population was greatly diminished after European contact between 1500 and 1600 years CE; in fact, North and South America First Inhabitants population was brought from 80 down to 8 million people because of diseases (i.e.: measles, smallpox or influenza), slavery and war.     

État de l’art : nouveaux anticoagulants et transfusion

Direct oral anticoagulants (DOAC) are indicated for stroke prevention in atrial fibrillation and for the prevention and treatment of venous thromboembolism. As any anticoagulant, they are associated with a bleeding risk. Management of DOAC-induced bleeding is challenging. Idarucizumab, antidote for dabigatran, is currently available and is part of the therapeutic strategy, whereas antidotes for anti-Xa agents are under development. Activated or non-activated prothrombin concentrates are proposed, although their efficacy to reverse DOAC is uncertain. We propose an update on DOAC-associated bleeding management, integrating the availability of idarucizumab and the critical place of DOAC concentration measurements.     

Die Bindungsfähigkeit des Serum-Albumins für Bromsulphthalein bei Patienten mit chronischer Urämie während Hämodialyse-Behandlung

Zusammenfassung Im Verlauf der Hämodialysc chronisch Nierenkranker verhält sich die mit der Acrylamidgel Elektrophorese nachweisbare Bindung von Bromsulphthalein und Albumin etwa umgekehrt proportional zur Konzentration unveresterter Fettsäuren. Diese Fettsäuren verdrängen den Farbstoff aus seiner Albuminbindung. Der Effekt ist in vivo durch die vorübergehende Zunahme von Fettsäuren infolge der Postheparin-Lipolyse anläßlich der Heparinisierung bei der Hämodialyse auslösbar und auch nach Zugabe von Ölsäure zu einer reinen Albumin-Bromsulphthalein-Lösung in vitro nachweisbar. Bereits bei physiologischen Hyperlipacidämien wird dieser Verdrängungsmechanismus wirksam. Er kann möglicherweise — dem Bromsulphthalein vergleichbar — Medikamente aus ihrer Albuminbindung verdrängen, wodurch deren Wirkung auf die Gewebe und/oder die Ausscheidung durch die Nieren beeinflußt wird.