miR-2135对P19细胞增殖及向心肌细胞分化的作用

文章快速阅读：文题释义： P19细胞：是从小鼠畸胎瘤中分离得到的多功能干细胞,目前已被广泛用于心脏发育的分子机制研究中。P19细胞具有自我复制能力和分化潜能,在体外不同培养条件下,它可分化成多种类型的细胞,例如低浓度二甲亚砜可诱导其分化成心肌细胞。 MicroRNA：是内源性的非编码的单链小RNA,它通过与靶基因mRNA 3’UTR区域结合,诱导mRNA的降解或阻止其翻译调控基因的表达。一个miRNA可以调控众多基因的表达,几个miRNA也可以组合来精细调控某个基因的表达。据推测,miRNA调控人类一半以上的基因。miRNA高度保守性与其功能重要性有着密切关系。 摘要 背景：既往研究发现,向心肌分化P19细胞中的miR-2135表达水平显著高于未分化P19细胞,但miR-2135对P19细胞增殖、向心肌细胞分化和心脏发育的影响尚不明确。 目的：探索miR-2135对P19细胞增殖及向心肌细胞分化的影响。 方法：分别以miR-2135沉默及空载质粒转染P19细胞,培养0-4 d,MTT法检测细胞增殖;培养0,24,48 h,流式细胞仪检测细胞周期。诱导两组转染的P19细胞向心肌细胞分化,诱导第0,10天,采用qRT-PCR检测P19细胞中miR-2135的表达;诱导第10天,采用蛋白免疫印迹检测心肌分化相关标志物心肌肌钙蛋白T、心房钠尿肽和心肌转录因子的表达。 结果与结论：①转染结果：转染miR-2135沉默质粒的P19细胞低表达miR-2135;②细胞增殖与周期：miR-2135沉默质粒转染P19细胞的增殖速度快于空载质粒转染P19细胞(P < 0.05),培养24,48 h的S期细胞比例明显高于空载质粒转染P19细胞(P < 0.05);③qRT-PCR检测结果：miR-2135沉默质粒转染P19细胞诱导10 d的miR-2135表达明显高于诱导0 d水平(P < 0.01);④蛋白免疫印迹检测结果：诱导  10 d,miR-2135沉默质粒转染P19细胞心肌肌钙蛋白T、心房钠尿肽和心肌转录因子的表达明显低于空载质粒转染P19细胞;⑤结果表明：miR-2135抑制P19细胞的增殖,可促进其向心肌细胞分化。  中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程 ORCID: 0000-0002-8966-879X(李辉)     

与心脏发育相关的miRNA研究

microRNA(miRNA)是生物体内源长度约为20～23个核苷酸的非编码小RNA,在生物体发育、细胞增殖与分化等过程中扮演了重要角色.心脏是人体的重要器官之一,miRNA与心脏发育密切相关,很多分子生物学研究技术已经应用到对心脏发育的研究中,研究表明一些特异miRNA有可能为心脏疾病的诊断和治疗提供新的靶点和研发新的药物.     

小鼠心脏发育中RNA编辑的动态变化及影响

目的 探讨RNA编辑在小鼠心脏发育过程中的动态变化并对其功能影响进行分析预测.方法 从ArrayExpress数据库获取小鼠心脏发育的转录组数据(E-MTAB-6798),使用SPRINT和ANNOVAR工具识别和注释RNA编辑位点,从编辑酶表达水平、编辑位点数、样本编辑水平和编辑指数方面描述RNA编辑的动态变化,并通过差异编辑及共编辑网络分析探究RNA编辑的功能和意义.结果 在55个样本中共识别出122 554个非冗余的RNA编辑位点,样本的编辑水平和编辑指数在小鼠心脏发育过程中变化明显,且出生两周后样本中的RNA编辑更加特异.心脏发育过程中差异编辑的位点可能通过影响miRNA与mRNA的结合调控着免疫相关基因的表达.与心脏整个发育过程显著相关的共编辑模块显示与趋化因子配体2的产生和编码心脏肌球蛋白α重链亚基的Myh6基因有关.结论 RNA编辑可能影响着小鼠心脏发育过程中的免疫活动,并且影响着Myh6等基因的正确编码.     

长链非编码RNA PVT1调控miR-551通过Wnt信号通路对卵巢癌迁移和侵袭的影响

目的:探讨长链非编码RNA PVT1在卵巢癌组织中的表达情况及其在卵巢癌细胞迁移和侵袭过程中的作用及机制。方法:q PCR检测卵巢癌和正常卵巢组织及不同卵巢癌细胞中PVT1的表达情况;Transwell侵袭实验和细胞划痕实验分别检测沉默PVT1后卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的变化;双萤光素酶报告基因检测PVT1与微小RNA(miR)-551的相互作用;Transwell侵袭实验和细胞划痕实验分别检测沉默PVT1后miR-551-inhibitor对卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的影响;Western blot法检测沉默PVT1后Wnt信号通路相关蛋白的表达情况。裸鼠皮下成瘤实验检测沉默PVT1对卵巢癌成瘤重量及体积的影响。结果:与正常卵巢组织相比,卵巢瘤组织中PVT1表达明显增高(P0.05);卵巢癌细胞株ES-2中PVT1表达水平最高(P0.05);沉默PVT1可以抑制卵巢癌细胞侵袭和迁移能力;PVT1能与miR-551的位点特异性结合;沉默PVT1后,miR-551-inhibitor可以促进卵巢癌细胞侵袭和迁移能力;沉默PVT1后Wnt信号通路蛋白的表达相应下调;与阴性对照组相比,PVT1-siRNA组荷瘤小鼠肿瘤体积和重量都明显减小(P0.05)。结论:PVT1在卵巢癌发生发展过程中起重要作用,它可以靶向调节miR-551,通过Wnt信号通路调控卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力。     

微小RNAs与心脏发育及疾病

微小RNAs（microRNAs）是一类内源性17~25个核苷酸大小的非编码RNA分子,能调节转录后靶基因的表达,在机体的生长发育、神经分化、细胞增殖、代谢和凋亡等过程中发挥重要作用。研究表明：microRNAs参与了心脏发育,多种miRNAs (miRNA-1, 133, 206 等)基因的表达变化影响心脏的正常发育。microRNAs的水平变化与心律失常、心肌梗死、心肌重构和心力衰竭等心脏疾病的形成亦密切相关。     

苯丙氨酸及其代谢物影响P19细胞神经分化的形态学研究

本研究通过免疫组化及活细胞计数法研究了苯丙氨酸及其代谢物对 P19细胞神经分化的影响。结果显示 :在 P19细胞神经分化诱导期加入苯丙氨酸及其代谢物可降低 P19神经元存活率 ,导致 P19神经元肿胀、崩解 ,神经突起纤细且分支少 ,神经纤维丝蛋白的染色性降低 ,同时发现 P19神经元中多极神经元 /单双极神经元的比例下降。本研究表明 ,苯丙氨酸及其代谢物可影响 P19细胞的神经诱导和分化 ,提示母源性苯丙酮尿症中枢神经系统异常可能与其在脑发育早期神经诱导及分化过程中受到苯丙氨酸及其代谢物影响有关     

基因沉默技术在斑马鱼研究中的应用

模式生物斑马鱼主要应用于探索遗传学、发育生物学和分子生物学等研究领域的分子机制,常用的研究策略是DNA诱变和基于RNA的基因沉默.但化学诱变技术和传统反义核酸技术存在缺陷,目前在应用中已受到很大限制.反义morpholino技术具有稳定、方便的特点,广泛应用于斑马鱼基因功能的研究.新兴的锌指核酶基因敲除技术不依赖于胚胎干细胞使其前景更为广阔.     

sox19b在斑马鱼胚胎眼睛发育中的作用

目的 通过抑制sox19b基因的表达,探讨sox19b基因在斑马鱼胚胎眼睛发育和形成中的作用。方法 通过显微注射sox19b 吗啉寡聚核苷酸（MO）抑制sox19b 基因的表达,观察胚胎发育过程中表型的变化;采用石蜡包埋组织切片及HE染色、RT-PCR和整封原位杂交等方法探讨敲除sox19b 后对斑马鱼胚胎眼睛发育的调控机制。 结果 敲除sox19b 基因后,斑马鱼胚胎眼睛发育受到影响,表现为眼睛变小或缺失,视网膜及晶状体结构发育异常(n =57/93);眼睛发育过程中重要调控基因 rx3、pax2a及 vsx2 等表达明显降低,进而影响眼睛的发育和形成。 结论 sox19b 基因作为转录调控因子,可以通过调节眼区转录因子的表达进而影响斑马鱼胚胎早期眼睛的发育和形成。     

siRNA活性与mRNA二级结构关系的研究

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引起的基因沉默现象,它通过降解具有同源序列的mRNA起作用,特殊设计的siRNA能使靶基因发生特异性沉默,确定基因功能或沉默致病基因从而治疗疾病。在RNAi技术的应用中,通常采用的是19bp长度,正、反义链3′端各有2个不配对核苷酸的双链RNA(siRNA)。而合成siRNA模板的选择,即靶mRNA作用位点的选择对RNAi的作用效果的影响相当大,原因之一是因单链的mRNA存在二级结构。本研究试图从具体的实验结果出发,研究靶mRNA二级结构对siRNA活性的影响。     

miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及机制

BACKGROUND: Previous studies have found that the expression level of miR-25 in differentiated P19 cells is significantly lower than that in undifferentiated P19 cells. However, the effect of miR-25 on cardiomyogenesis and the relevant mechanism remain unclear. OBJECTIVE: To explore the effect and mechanism of miR-25 on the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. METHODS: P19 cells were cultured and differentiated into cardiomyocytes in vitro. The expression of miR-25 in differentiated and undifferentiated P19 cells was detected by real-time PCR. miR-25-overexpressing P19 cells were constructed by lipofection transfection, and were used to investigate the effect of miR-25 on the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. MicroRNA target analysis tools were used to explore potential targets of miR-25, and dual luciferase reporter assay was used to identify whether the 3’UTR of Pax3 mRNA was a binding target of miR-25. In addition, we transfected P19 cells with Pax3 shRNAs to silence the expression of Pax3, and investigated the effect of Pax3 on the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. RESULTS AND CONCLUSION: Expression level of miR-25 in differentiated P19 cells was obviously down-regulated compared with that in undifferentiated P19 cells. miR-25 overexpression promoted the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. By target prediction analysis, we confirmed that Pax3 was a potential target gene of miR-25. Luciferase assay further confirmed that miR-25 targeted Pax3 directly. Moreover, knockdown of Pax3 promoted the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. Taken together, miR-25 promotes the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes by targeting Pax3. These findings offer new clues and theoretical basis for cardiomyogenesis and prevention and cure of congenital heart disease.       

Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is essential for development of zebrafish, Danio rerio

Macrophage migration inhibitory factor (MIF) was discovered as the first cytokine that inhibited the random migration of macrophages. Recently, MIF has been reported to be involved in embryonic development in higher vertebrates. In fish, however, nothing is known about the function of MIF at early life stages, although immunological functions of MIF have been reported in adult fish. To elucidate the function of MIF during embryonic development in fish, we examined expression patterns and function of the zebrafish MIF gene using antisense morpholino-mediated knockdown (morpholino oligonucleotide-MO). In whole-mount in situ hybridization analysis, zebrafish MIF mRNA was detected in developing eyes, tectum, branchial arches, pectoral fin buds, liver and gut. The onset of MIF mRNA expression coincided with the beginning of tissue differentiation during embryogenesis. MIF-MO-injected embryos (morphants) displayed malformed eyes, abnormal swelling in the tectum and fourth ventricle region, and undeveloped jaw cartilage and pectoral fins. An increased number of apoptotic cells in the eye and neural tissues were observed in MIF morphants by histological analysis and acridine orange staining. Moreover, proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-positive cells were reduced in morphant eyes. These results suggest that MIF is essential for normal embryonic development even at the level of teleosts and that it functions as a growth factor for the proliferation and differentiation of embryonic tissues.     

Zebra Fish: An Uncharted Behavior Genetic Model

The zebra fish has been a preferred subject of genetic analysis. It produces a large number of offspring that can be kept in small aquaria, it can be easily mutagenized using chemical mutagens (e.g., ethyl nitrosourea [ENU]), and high-resolution genetic maps exist that aid identification of novel genes. Libraries containing large numbers of mutant fish have been generated, and the genetic mechanisms of the development of zebra fish, whose embryo is transparent, have been extensively studied. Given the extensive homology of its genome with that of other vertebrate species including our own and given the available genetic tools, zebra fish has become a popular model organism. Despite this popularity, however, surprisingly little is known about its behavior. It is argued that behavioral analysis is a powerful tool with which the function of the brain may be studied, and the zebra fish will represent an excellent subject of such analysis. The present paper is a proof of concept study that uses pharmacological manipulation (exposure to alcohol) to show that the zebra fish is amenable to the behavioral genetic analysis of aggression and thus may allow us to reveal molecular mechanisms of this behavioral phenomenon relevant to vertebrates.     

干细胞调控因子神经系统多梳蛋白1的全基因组范围结合靶点分析

背景：在胚胎发育早期神经系统高表达的多梳蛋白家族成员神经系统多梳蛋白1具有明确转录抑制作用。最近研究表明,神经系统多梳蛋白1可能是一个有别于同源基因Bmi1的新的神经干细胞调控因子。 目的：检测体外神经细胞分化模型小鼠畸胎瘤P19细胞中神经发育相关表观遗传调控因子神经系统多梳蛋白1在基因组上的结合靶点。 方法：扩增未分化状态的小鼠畸胎瘤P19细胞系(内源性高表达神经系统多梳蛋白1基因),使用兔源抗神经系统多梳蛋白1多克隆抗体进行P19细胞的染色质免疫沉淀实验,并结合采用高通量芯片检测技术(ChIP-on-chip)检测捕获靶基因序列,最后利用生物信息学在线软件分析神经系统多梳蛋白1结合靶点临近基因功能的分类特点。 结果与结论：筛选出约1 280个神经系统多梳蛋白1结合靶点,靶点临近或所在基因的功能主要与分化、发育、转录及其调节、神经发生等密切相关。提示全基因组结合靶点分析可有效揭示神经系统多梳蛋白1基因在体外神经干细胞分化模型P19细胞中结合并可能参与调控的靶基因谱的分布特点,有利于下一步深入开展干细胞调控相关因子神经系统多梳蛋白1的下游信号通路研究。