人骨髓间质干细胞体外扩增和向内皮细胞定向诱导分化的研究

目的：体外分离、扩增成人骨髓间质干细胞（MSCs）和向内皮细胞（ECs）定向诱导分化，开辟心血管组织工程种子细胞的新来源。 方法： 采用Percoll(1 073 g/L)从正常成人骨髓中分离出MSCs，纯化和扩增后流式细胞仪鉴定其纯度；用血管内皮生长因子(VEGF)诱导MSCs向ECs分化，Ⅷ因子(vWF)免疫组化和透射电镜(TEM)鉴定细胞性质。 结果： 5.0×105个MSCs在体外扩增15代后，获得8.0×1012个MSCs，扩增了约1.6×107倍；MSCs在加入VEGF诱导培养大约14-21 d，80%-90%的诱导细胞对Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应；TEM可观察到胞浆内有Weible-palade小体，证实为ECs。 结论： 成人骨髓MSCs在体外具有定向诱导分化为ECs的潜能，这为心脏组织工程瓣体外构建, 尤其是在小儿先天性心脏病组织工程研究中种子细胞的来源提供了可能性。     

人骨髓间质干细胞体外扩增和向成骨细胞分化的实验研究

骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）是一类存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞，在体外不仅可分化为间质类细胞，而且可以分化为非间质细胞。本研究探讨人骨髓间质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向成骨细胞诱导分化的条件。利用密度为1．073g/ml的Percoll分离骨髓的单个核细胞，以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养与扩增MSCs，细胞纯度可达95％左右。取第二代和第三代的MSCs，以含有不同浓度的抗坏血酸、β－磷酸甘油、地塞米松的诱导培养基向成骨细胞诱导，诱导向的细胞呈现典型的成骨细胞样改变，免疫组化技术显示其I型胶原染色阳性，ALP染色阳性，表明MSCs在体外具有向成骨细胞分化的潜力。     

阿司匹林对早发子痫前期外泌体诱导滋养细胞功能的作用

目的 构建子痫外泌体细胞模型研究阿司匹林改善滋养细胞功能并预防子痫前期（PE）的作用及分子机制。方法 收集早发型PE病例14例和正常孕妇作为对照8例，提取血浆外泌体。体外培养人滋养细胞HTR-8/SVneo，分别加入不同浓度的PE外泌体造模并给予阿司匹林处理；CCK-8法检测滋养细胞增殖情况；细胞划痕和Transwell小室检测滋养细胞迁移、侵袭变化；RT-qPCR和Western blot检测血管内皮生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达水平情况；ELISA法检测孕妇血浆VEGF水平。结果 PE外泌体可以显著抑制滋养细胞活力，且PE孕妇血浆中VEGF浓度低于NC组。体外PE外泌体滋养细胞模型实验证实，与NC组相比，100μg/mL PE外泌体显著抑制滋养细胞增殖、影响滋养细胞迁移、侵袭能力，抑制内皮细胞HUVEC小管形成功能，降低VEGF的表达（P<0.001）；而给予阿司匹林处理后，滋养细胞增殖、迁移、侵袭能力以及内皮细胞小管形成功能均改善。结论 阿司匹林提高滋养细胞增殖、迁移和侵袭能力，改善PE外泌体诱导后滋养细胞功能损伤，提高VEGF水平。这为阿司匹林用于早发型PE的预防...     

切应力诱导间充质干细胞分化成内皮细胞的研究

目的研究绿色荧光蛋白（GFP）小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外分离培养及扩增及其在流体剪切力条件下向内皮细胞（EC）定向分化能力。方法选用GFP小鼠作为研究对象,分离培养骨髓间充质干细胞,并在体外进行细胞的扩增和传代。应用流体剪切力刺激方法对骨髓间充质干细胞进行诱导,并观测其对GFP小鼠骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞的积极作用,对其结果进行免疫荧光检测,计算阳性细胞比例,统计分析。结果GFP小鼠骨髓间充质干细胞每扩增一代,细胞数量增加5-8倍。检测诱导后MSCs,结果显示在诱导3 d时出现vWF表达阳性细胞。结论GFP小鼠MSCs在体外的培养扩增能力强,MSCs在流体剪切应力的作用下可以转化成内皮细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的研究

目的：探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）和软骨细胞培养液体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向软骨细胞分化的可能性。方法：采用Percoll分离液分离培养人胚MSCs，体外扩增，用流式细胞仪测定MSCs的CD44、CD71、CD34、CD45表达；在第4代MSCs中加入的条件培养基进行诱导，根据条件培养基的不同分为4组：①IGF-Ⅰ组：培养基中加入100ng／mL IGF-Ⅰ；②软骨细胞培养液组：加入软骨细胞培养液；③联合诱导组：培养液中加入100ng／mL IGF-Ⅰ和软骨细胞培养液；④对照组：培养基中不加入IGF-Ⅰ和软骨细胞培养液。采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组化、细胞内蛋白多糖（PG）含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。结果：体外培养的MSCs呈现成纤维细胞样形态，流式细胞仪检测结果显示，MSCs阳性表达CD44，阴性表达CD34，CD45；IGF-Ⅰ和软骨细胞培养液联合诱导15d后，MSCs开始呈现软骨细胞的形态特点，Ⅱ型胶原免疫组化呈阳性，而未诱导的MSCs组呈阴性；联合诱导组细胞内PG含量为8．92μg／ml，显著高于IGF-Ⅰ组、软骨细胞培养液组和对照组，但低于正常软骨细胞（P〈0．01）。结论：IGF-Ⅰ和软骨细胞培养液能诱导MSCs向软骨细胞分化。     

转录因子Bach1对人微血管内皮细胞的作用研究

 目的:研究转录因子Bach1对人微血管内皮细胞功能的影响。方法: 利用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）细胞转染技术下调内皮细胞Bach1表达;用Matrigel管腔形成实验检测内皮细胞体外血管新生的能力;用Transwell小室法检测细胞迁移;用CCK-8法测定细胞增殖;用实时荧光定量PCR、Western blotting和ELISA法检测细胞中血红素氧合酶1（heme oxygenase 1,HO-1）和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）mRNA 和蛋白的表达情况;用转染报告基因的方法检测VEGF基因的转录活性。结果: 下调内皮细胞Bach1表达明显促进人微血管内皮细胞迁移和管腔形成能力,对内皮细胞增殖能力无明显影响;抑制Bach1表达促进内皮细胞HO-1 mRNA 和蛋白的表达,增加VEGF 转录活性及mRNA和蛋白的表达。结论: 抑制转录因子Bach1表达可增加内皮细胞HO-1和VEGF的表达,促进人微血管内皮细胞迁移和管腔形成,提示Bach1是负性调控血管新生的因子。     

缺氧条件下间充质干细胞以旁分泌方式影响脑微血管内皮细胞的功能

目的：探讨缺氧条件下间充质干细胞（MSCs）以旁分泌方式对脑微血管内皮细胞（BMECs）的增殖、迁移和细胞单层通透性的影响。 方法:分离、培养并鉴定人MSCs和大鼠BMECs，ELISA检测细胞条件培养基中VEGF和MMP-9的含量，跨内皮电阻（TEER）检测反映脑BMECs单层通透性的变化，观察不同条件培养基对缺氧BMECs增殖、迁移和通透性的影响。结果:VEGF和MMP-9在MSCs条件培养基中的含量显著高于BMECs条件培养基，缺氧处理的MSCs条件培养基中VEGF和MMP-9含量比正常MSCs条件培养基显著增高；MSCs条件培养基能明显促进BMECs在缺氧条件下的增殖和迁移，但也使BMECs的TEER显著降低（50.5％±2.6％，P<0.05），这些作用在不同程度上能被VEGF抗体和MMP-9抑制剂所抑制。结论:缺氧条件下MSCs可通过旁分泌方式促进BMECs增殖和迁移，但同时也增加了BMECs单层的通透性。     

趋化因子-8对高糖环境下脂肪间充质干细胞迁移能力的影响

目的 探讨高糖环境下,趋化因子-8（CXCL-8）对人脂肪间充质干细胞（hADMSCs）迁移能力的影响和机制。方法 建立高糖环境模型;在高糖条件下,建立CXCL-8实验组、Akt抑制剂组和高糖对照组,在正常条件培养的hADMSCs为正常对照组;分别用细胞划痕实验、Transwell细胞小室实验检测CXCL-8对hADMSCs的迁移能力影响,并用Western blotting、ELISA实验检测Akt、信号转导和转录激活因子（STAT3）和血管内皮生长因子（VEGF）等蛋白表达。 结果 相对高糖对照组,CXCL-8实验组hADMSCs细胞划痕面积闭合率和Transwell细胞小室迁移率均增高（P＜0.01）;而Akt抑制剂组hADMSCs细胞划痕面积闭合率或Transwell细胞小室迁移率比CXCL-8实验组皆降低（P＜0.01）;CXCL-8实验组磷酸化Akt、mTOP、STAT3蛋白表达增高,CXCL-8实验组上清液的VEGF、表皮细胞生长因子 (EGF)含量明显增高（P＜0.01）;而Akt抑制剂组hADMSCs分泌能力下降（P＜0.01）。 结论 高糖环境下,CXCL-8通过Akt-STAT3通路促进间充质干细胞（MSCs)旁分泌VEGF等因子,促进MSCs迁移,对招募宿主细胞归巢,促进组织损伤修复具有重要意义。     

胰岛素对人肝癌HepG2细胞体外诱导人脐静脉内皮细胞血管形成能力的影响

目的:探讨胰岛素对人肝癌细胞系HepG2体外诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管形成能力的影响及其可能机制。方法:用含不同浓度胰岛素的完全培养基预培养肝癌细胞系HepG2制备条件培养基;应用预铺Matrigel基质胶的Transwell小室检测不同组条件培养基对HUVECs迁移能力的影响;运用CCK-8方法及EdU细胞增殖实验检测不同组条件培养基对HUVECs增殖能力的影响;运用内皮细胞成管实验检测不同组条件培养基对HUVECs成血管能力的影响;同时应用RT-PCR检测不同胰岛素浓度培养的HepG2细胞中血管内皮生长因子(VEGF)121、VEGF165、环氧化酶2(COX-2)的转录水平。结果:在一定浓度范围内,HepG2细胞对HUVECs的侵袭迁移能力、增殖能力的影响,对HUVECs的成血管能力的影响,对HepG2细胞VEGF121、VEGF165、COX-2转录水平的影响,均分别与胰岛素浓度呈正相关。结论:在一定浓度范围内,胰岛素可能通过上调HepG2细胞中VEGF121、VEGF165、COX-2的表达水平促进HepG2细胞诱导HUVECs血管形成能力。     

GM-CSF对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响及VEGF的作用

目的： 研究炎性因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响及血管内皮生长因子（VEGF）的作用，为探讨GM-CSF和VEGF与动脉粥样硬化斑块内血管新生及斑块稳定性之间的关系提供实验基础。方法： 在 Matrigel上诱导人脐带静脉内皮细胞（HUVECs）形成管腔结构，从而建立稳定的血管形成的体外培养体系，然后施加实验因素。分别检测rhGM-CSF的浓度效应和时间效应，及加入VEGF165的作用。然后各实验组用CD34免疫细胞化学染色，光学显微镜下计数各组管腔数。最后用统计学方法进行分析。结果： 应用Matrigel可在体外诱导培养的HUVECs形成管腔结构。rhGM-CSF作用后，培养体系的管腔数逐渐增多，呈剂量及时间依赖效应；加入VEGF165后，管腔数显著增多。结论： 应用Matrigel可在体外诱导培养的HUVECs形成管腔结构。GM-CSF可以促进体外诱导人血管内皮细胞血管形成，并在一定范围内呈剂量及时间依赖效应。VEGF可以促进体外诱导人血管内皮细胞血管形成。     

小檗碱抑制高转移性人巨细胞肺癌PG细胞侵袭和迁移的研究

目的：研究小檗碱对高转移性人巨细胞肺癌PG细胞侵袭和迁移的作用并探讨其作用机制。方法：采用琼脂糖滴法观察PG细胞的运动能力，用下室加FN的Transwell小室法观察PG细胞的趋化运动能力，用铺Martrigel的Transwell小室观察PG细胞的侵袭能力。通过SABC免疫细胞化学法及图像分析软件，半定量PG细胞MMP2、TIMP2的表达；RT－PCR法检测PG细胞MMP2 mRNA和TIMP2 mRNA的表达。结果：小檗碱（10 mg/L）处理PG细胞 24 h 后：（1）PG细胞的迁移距离明显比对照PG短（P<0.01），趋向FN迁移的穿膜细胞数明显少于对照组（P<0.01）；（2）PG细胞与FN、Martrigel的黏附减少，与对照组比有显著差异（P<0.01）；（3）穿过铺Martrigel的Transwell小室微孔滤膜的PG细胞数明显减少，即可抑制PG细胞的侵袭能力(P<0.05)； （4）MMP2表达明显减少(P<0.05)，而TIMP－2的表达有升高趋势，与对照比无显著差异，但MMP2/TIMP2比值降低；（5） 小檗碱使PG细胞TIMP2 mRNA表达明显增加(P<0.05)，而对MMP2 mRNA表达无影响，MMP2 mRNA/TIMP2 mRNA比值降低。结论：抑制肿瘤细胞的运动能力、与细胞外基质的黏附、对细胞外基质侵袭，调节MMP2/TIMP2表达的平衡，从而维持细胞外基质的完整性，可能是小檗碱抗侵袭和转移作用的机制之一。     

心肌条件培养液与5-氮胞苷诱导骨髓基质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：骨髓基质干细胞可以明显改善心肌缺血时的心脏功能,但其直接分化为心肌细胞并参与心功能恢复的机制尚不明确。 目的：探讨心肌条件培养液与5-氮胞苷诱导骨髓基质干细胞分化为心肌样细胞的作用。 方法：全骨髓贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,将第6代骨髓基质干细胞随机分为4组：5-氮胞苷+心肌条件培养液联合诱导组;5-氮胞苷组;心肌条件培养液组;基础培养基组(空白组)。用心肌条件培养液和5-氮胞苷诱导3周后用免疫组化法测定各组心肌肌钙蛋白表达,并采用单因素方差分析检验进行统计学分析。 结果与结论：在体外心肌条件培养液可以诱导骨髓基质干细胞向心肌细胞分化,提示其中细胞因子可能起关键作用,但心肌条件培养液的这种作用要弱于化学诱导剂5-氮胞苷的诱导作用,且联合诱导作用更强。     

E1A激活基因阻遏子促进人血管内皮细胞VEGF分泌和单层通透性增加

目的: 探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)诱导的人血管内皮细胞(ECs)单层通透性改变中的作用及机制。方法: 用CREG过表达及CREG表达下调的ECs为模型,Transwell chamber弥散模型观察ECs单层通透性的改变; 荧光倒置显微镜观察细胞骨架肌动蛋白F-actin及黏附连接蛋白VE-cadherin在ECs中的分布和形态学改变;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测ECs血管内皮生长因子(VEGF)分泌。结果: CREG过表达的ECs (EO组) 较EN组单层通透性明显增高 (P<0.05);CREG表达下调的ECs(ES组)较EN组单层通透性有所下降(P<0.05)。与EN组相比较,EO组细胞中F-actin排列紊乱,形成大量应力纤维; ES组F-actin则主要呈细丝状分布于细胞周边,中央分布较少。同时,EO组VE-cadherin在细胞周边的正常拉链状结构减少或缺失,细胞间隙增宽;而ES组VE-cadherin在细胞周边呈正常拉链状分布,细胞之间连接紧密。ELISA检测显示EO组细胞上清中VEGF分泌较EN组明显增加(P<0.05);ES组VEGF分泌较EN组减少(P<0.05)。应用VEGF中和抗体阻断后,CREG过表达引起的EO通透性增加的现象明显受到抑制。结论: CREG过表达可能通过VEGF介导的信号途径引起F-actin重构及VE-cadherin减少,使血管内皮细胞单层通透性增加。     

Podoplanin increases migration and angiogenesis in malignant glioma

Expression of podoplanin in glial brain tumors is grade dependent. While serving as a marker for tumor progression and modulating invasion in various neoplasms, little is known about podoplanin function in gliomas. Therefore we stably transfected two human glioma cell lines (U373MG and U87MG) with expression plasmids encoding podoplanin. The efficacy of transfection was confirmed by FACS analysis, PCR and immunocytochemistry. Cells were then sorted for highly podoplanin expressing cells (U373P^high/U87P^high). Transfection did not influence the production of pro-angiogenic factors including VEGF, VEGF-C and D. Also, expression of VEGF receptors (VEGFR) remained unchanged except for U87P^high, where a VEGFR3 expression was induced. U373P^high showed significantly reduced proliferation as compared to mock transfected group. By contrast, podoplanin significantly increased migration and invasion into collagen matrix. Furthermore, conditioned media from P^high glioma cells strongly induced tube formation on matrigel. In conclusion, podoplanin increased migration of tumor cells and enhanced tube formation activity in endothelial cells independent from VEGF. Thus, podoplanin expression may be an important step in tumor progression.     

Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro

We investigated effects of the paracrine factors secreted by human mesenchymal stem cells (hMSCs) on endothelial cell migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival in vitro. Human mesenchymal stem cells were cultured as a monolayer or as three-dimensional aggregates in hanging drops (hMSC spheroids). We performed analysis of paracrine factors in medium conditioned by a monolayer of hMSCs and hMSC spheroids. Concentrations of vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor, angiogenin, procathepsin B, interleukin (IL)-11, and bone morphogenic protein 2 were increased 5-20 times in medium conditioned by hMSC spheroids, whereas concentrations of IL-6, IL-8, and monocyte hemoattractant protein-1 were not increased. Concentrations of VEGF and angiogenin in medium conditioned by hMSC spheroids showed a weak dependence on the presence of serum, which allows serum-free conditioned medium with elevated concentrations of angiogenic cytokines to be obtained. Medium conditioned by hMSC spheroids was more effective in stimulation of umbilical vein endothelial cell proliferation, migration, and basement membrane invasion than medium conditioned by a monolayer of hMSCs. This medium also promotes endothelial cell survival in vitro. We suggest that culturing of hMSCs as three-dimensional cellular aggregates provides a method to concentrate proangiogenic factors secreted by hMSCs and allows for reduction of serum concentration in conditioned medium. Our data support the hypothesis that hMSCs serve as trophic mediators for endothelial cells. Disclosure of potential conflicts of interest is found at the end of this article.     

基因沉默PRDX1 表达对人结直肠癌SW480 细胞侵袭迁移的影响

目的:探讨RNA 干扰过氧化还原酶1(Peroxiredoxin 1,PRDX1)表达对人结直肠癌SW480 细胞侵袭转移能力的影响。方法:筛选RNA 干扰PRDX1 的慢病毒质粒,与阴性对照慢病毒质粒分组转染结直肠癌SW480 细胞,转染后的SW480 细胞可分为PRDX1 基因沉默组(si-PRDX1)和阴性对照组(Vector)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)分别检测两组细胞中PRDX1 mRNA 和蛋白表达;采用Transwell 侵袭和迁移实验检测基因沉默PRDX1 表达对结直肠癌细胞侵袭及迁移能力的影响;通过Western blot 检测两组细胞中基质金属蛋白酶(MMP)家族部分蛋白表达水平。结果:基因沉默PRDX1 表达可有效抑制结直肠癌SW480 细胞中PRDX1 mRNA 和蛋白水平的表达,与阴性对照组相比(Vector),差异均具有统计学意义(P<0.01),说明基因沉默PRDX1 的SW480 细胞系构建成功;Transwell 侵袭和迁移实验显示si-PRDX1组细胞的侵袭及迁移能力较对照组均明显降低(P<0.01);Western blot 结果显示,与Vector 组相比,si-PRDX1 组细胞中组织基质金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的表达明显增加,而MMP-2 及MMP-9 的表达显著下降,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:基因沉默人结直肠癌SW480 细胞的PRDX1 表达可有效抑制细胞的侵袭、迁移及转移能力,其机制可能会通过调控TIMP-2、MMP-2 及MMP-9 的表达介导。     

Mesenchymal stem cells up-regulate the invasive potential of prostate cancer cells via the eotaxin-3/CCR3 axis

This study aimed to clarify the role of mesenchymal stem cells (MSCs) as a component of the cancer microenvironment. We investigated the homing-related chemokine expression levels of MSCs treated with a prostate cancer cell line (PC-3) -conditioned medium. Among several homing chemokines, an antibody array revealed that expression of eotaxin-3 (but not eotxin-1 and -2) was highly enhanced in MSCs treated with PC-3-conditioned medium. A gene expression array showed significantly increased expression of CCR3, a receptor of eotaxin-3, in PC-3. In a matrigel invasion assay, interferon-gamma, a specific inhibitor of eotaxin-related homing, significantly reduced the transmigration of PC-3 cells, under co-cultured condition with MSCs, in a dose-dependent manner (P?<?0.05). Consistent with these results, anti-CCR3 antibody successfully reduced PC-3 migration under the co-cultured condition. These findings suggest that MSCs to modulation of the invasive potential of prostate cancer cells via the eotaxin-3/CCR3 axis.