磷酸化蛋白质组学方法在信号网络解析中的应用

信号转导是细胞对各种外界刺激的应答反应,蛋白磷酸化或去磷酸化是信号从胞外流向胞内并导致细胞效应过程中的关键机制。磷酸化蛋白质组学(phosphoproteomics)是采用蛋白质组学的分析方法,研究细胞中所有磷酸化蛋白质及其修饰过程,从整体上观察细胞中被修饰的磷酸化蛋白质的状态及其变化,进而分析特定磷酸化修饰对生命过程的调控作用及其分子机制。     

LBP对LPS激活巨噬细胞内p38信号通路的影响 

目的:探讨脂多糖结合蛋白(LBP)对脂多糖(LPS)激活肺泡巨噬细胞内p38信号通路的调节作用。方法:经硫酸铵盐析、Bio-Rex70阳离子交换层析和MonoQ阴离子交换层析, 从大鼠急性期血清中分离纯化LBP。分别用0.01mg/L和1mg/L的LPS刺激肺泡巨噬细胞, 并加入不同浓度LBP(0mg/L、0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L和10mg/L), 观察肺泡巨噬细胞中p38蛋白激酶的磷酸化程度。结果:纯化的大鼠LBP在SDS-PAGE的60kD处呈现单一条带, 并可增强LPS与单核细胞的结合。当LPS浓度为0.01mg/L时, 1mg/L以下的LBP可明显增敏LPS对肺泡巨噬细胞内p38信号通路的激活, 并且这种增敏作用随LBP浓度的增加而增强。但LBP为10mg/L时, LBP对LPS的增敏作用反而有所减弱;当LPS为1mg/L时, LBP对LPS激活肺泡巨噬细胞内p38信号通路无调节作用。结论:LBP对低浓度LPS(0.01mg/L)激活肺泡巨噬细胞内p38信号通路有明显的调节作用;而高浓度LPS(1mg/L)不需LBP的增敏作用, 可能通过LBP非依赖途径直接激活p38信号通路。     

产前应激对抑郁症子代大鼠前额叶皮质蛋白质组学的影响

目的:应用整合组学分析子代大鼠前额叶皮质(PFC)代谢组及磷酸蛋白质组的变化,研究产前应激(PS)导致子代大鼠抑郁样行为的分子机制。方法:SD雌性妊娠大鼠在孕期第14～20 d接受慢性束缚应激。采用糖水偏好实验(SPT)检测出生后30 d(P30)子代大鼠抑郁样行为。分别采用串联质谱标签(TMT)定量蛋白质组学结合磷酸肽富集法和UHPLC-Q-TOFMS非靶向代谢组学对子代大鼠PFC的磷酸化蛋白质组及代谢组进行检测。结果:与对照组相比,抑郁样子代大鼠前额叶皮质有8404个差异修饰肽段和34个差异代谢物的丰度发生显著变化。经KEGG通路注释及富集比较发现,差异修饰肽段和差异代谢物主要参与胰岛素分泌、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖代谢、醛固酮合成与分泌、c GMP-PKG信号途径、甲状腺激素合成等生物过程。结论:PS可能主要通过调节子代大鼠PFC中多种生物过程中的相关蛋白磷酸化及代谢物,从而诱导产生抑郁样行为。     

花生四烯酸与氧化应激的研究进展

花生四烯酸(arachidonic acid, AA)是一种人体内含量最丰富、性质最活跃、分布最广泛的多不饱和必需脂肪酸,具有很强的生物活性,其代谢网络是炎症代谢网络的重要组成部分.AA不仅在炎症中发挥重要作用而且与氧化应激关系密切.对两者相互作用的研究能够更好地阐明疾病发生的机制,对病因探究及疾病治疗具有重要意义.     

清开灵注射液对LPS诱导的兔弥散性血管内凝血的作用

目的: 研究清开灵注射液对脂多糖(LPS)诱导的兔弥散性血管内凝血(DIC)的作用。方法: 采用耳缘静脉持续滴注LPS的方法建立兔弥散性血管内凝血模型,观察各组动物24 h内各时点生存率;采用全自动凝血分析仪检测活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT);凝固法测定纤维蛋白原含量;全自动血细胞分析仪进行血小板计数;全自动血浆分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)以及血尿素氮(BUN);发色底物法测定蛋白C及抗凝血酶Ⅲ的活性;ELISA法检测血浆肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。结果: 兔静脉持续滴注LPS后,APTT和PT显著延长,ALT和BUN显著升高,蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性明显降低,血小板计数显著减少,血浆TNF-α含量显著升高。给予清开灵注射液后,APTT和PT的延长明显缩短,血小板计数、纤维蛋白原含量、蛋白C及抗凝血酶Ⅲ活性均明显恢复;ALT、BUN以及血浆TNF-α含量明显降低。结论: 清开灵注射液对LPS所诱导的兔弥散性血管内凝血有良好的拮抗作用。     

抑制mTOR信号通路对幼鼠肺损伤时p-AKT1分子的影响及意义

目的:探讨抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路在高体积分数氧(高氧)致SD幼鼠肺损伤时对磷酸化AKT1(p-AKT1)分子的影响和意义。方法:72只SD幼鼠(3周龄)随机分为空气+生理盐水组、高氧+生理盐水组、高氧+OSI-027组及高氧+雷帕霉素组(n=18),分别构建动物模型。高氧选择90%氧气持续干预,生理盐水、OSI-027和雷帕霉素干预分别在观察期第1、3、6、8、10和13天时经腹腔注射给药。在造模第3、7和14天时取各组幼鼠进行体重测量、肺湿干重比(wet/drg weight ratio,W/D)计算、肺组织病理学检查、肺泡间隔宽度测定和肺损伤评分,肺组织免疫组化和Western blot检测磷酸化S6K1(p-S6K1)和p-AKT1的分布与水平。结果:与空气组比较,高氧组幼鼠体重明显下降(P0.05),肺损伤急性期肺W/D增高(P0.05),肺泡间隔宽度及肺损伤评分明显增加(P0.05),肺组织p-S6K1阳性细胞增多(P0.05),肺组织p-AKT1阳性细胞减少(P0.05),p-S6K1蛋白显著升高(P0.01),p-AKT1蛋白明显减低(P0.01);与高氧组比较,高氧+OSI-027组的肺组织损伤减轻,肺组织p-S6K1阳性细胞减少(P0.05),p-AKT1阳性细胞增多(P0.05),p-S6K1蛋白水平显著降低(P0.05),p-AKT1蛋白水平增加(P0.05);高氧+雷帕霉素组的肺损伤进一步加重(P0.05),p-S6K1阳性细胞减少(P0.05),p-AKT1阳性细胞增加(P0.05),p-S6K1蛋白水平显著降低(P0.05),p-AKT1蛋白水平显著增加(P0.05)。与高氧+雷帕霉素组比较,高氧+OSI-027组的肺组织损伤减轻(P0.05),肺组织p-AKT1阳性细胞减少(P0.05),p-AKT1蛋白水平降低(P0.05)。结论:p-AKT1参与了高氧肺损伤的发生发展,其调控机制可能与抑制mTOR信号通路的活化有关。高氧肺损伤时,p-AKT1蛋白水平下降,mTOR抑制剂能增加p-AKT1蛋白水平,但只有mTORC1/2双重抑制剂OSI-027能减轻高氧所致SD幼鼠的肺损伤及纤维化。     

血栓通注射液对LPS诱导的兔弥散性血管内凝血的拮抗作用

 目的：研究血栓通注射液对脂多糖（LPS）诱导的兔弥散性血管内凝血（DIC）的影响。方法：对兔耳缘静脉持续滴注LPS以建立兔DIC模型,记录各组动物在24 h后的生存率;全自动血浆分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)和血尿素氮(BUN);用全自动凝血分析仪检测活化部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）;用凝固法测定纤维蛋白原含量;全自动血细胞分析仪进行血小板计数;发色底物法测定蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性;ELISA法检测血浆中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。结果：持续从兔耳缘静脉滴注LPS后,DIC模型组动物大量死亡,ALT和BUN显著升高,APTT和PT显著延长,蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性明显降低,血小板计数明显减少,血浆中TNF-α的含量显著升高。注射血栓通注射液后,动物的死亡率明显下降,ALT和BUN明显下降,APTT和PT明显缩短,血小板计数明显上升,纤维蛋白原含量显著提高,蛋白C和抗凝血酶Ⅲ活性明显提升;血浆TNF-α的含量明显降低。结论：血栓通注射液对LPS所诱导的兔DIC有良好的拮抗作用。     

胰岛素对严重烧伤早期大鼠心肌氧化应激的影响

 目的：探讨胰岛素对严重烧伤早期大鼠心肌氧化应激的影响。方法：24只SPF级SD大鼠,随机分为3组,分别是对照组(假烫伤组)、烫伤组和烫伤+胰岛素组。后2组大鼠背部造成30%烧伤总面积(TBSA)的Ⅲ度烫伤,伤后立即腹腔注射生理盐水(40 mL/kg)。烫伤+胰岛素组大鼠复苏补液后皮下注射胰岛素(1 U/kg),烫伤组同法注射等量生理盐水。于伤后24 h采集腹主动脉血和心脏组织标本。采用分光光度法测定血糖(BG)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性及心脏组织中氧化、抗氧化指标,包括丙二醛(MDA)含量、黄嘌呤氧化酶(XO)、髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性。结果：(1) 烫伤组BG含量与对照组比较显著升高(P＜0.05),烫伤+胰岛素组BG水平较烫伤组显著降低(P＜0.05),与对照组比较显著升高(P＜0.05)。(2) 烫伤组LDH和CK活性与对照组比较显著升高(P＜0.05),烫伤+胰岛素组LDH和CK活性与烫伤组比较显著降低(P＜0.05)。(3) 烫伤组心肌MDA含量、XO与MPO活性与对照组比较显著升高(P＜0.05),SOD、CAT和GPx活性与对照组比较显著降低(P＜0.05);烫伤+胰岛素组心肌MDA含量、XO与MPO活性较烫伤组显著降低(P＜0.05),SOD、CAT和GPx活性较烫伤组显著升高(P＜0.05)。结论：胰岛素干预减轻烧伤后早期大鼠心肌的氧化应激,使升高的心肌酶活性下降,呈现心肌保护效应。     

硫化氢供体对阿霉素心肌病大鼠氧化应激作用的影响

目的： 探讨外源性给予硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)对阿霉素(adriamycin, ADR)心肌病大鼠氧化应激作用的影响。方法：雄性Wistar大鼠54只，随机分为5组：(1) ADR组(n=12)：腹腔注射ADR，每次2.5 mg/kg，每周1次，共用药10周；(2)ADR+小剂量NaHS组（n=12）：ADR用药方法同ADR组，同时经腹腔注射NaHS，2.8 μmol·kg-1·d-1，连续用药10周；(3)ADR+大剂量NaHS组（n=12）：ADR用药方法同ADR组，同时经腹腔注射NaHS，14 μmol·kg-1·d-1，连续用药10周；(4)对照组（n=9）：用相同容量的生理盐水代替ADR，给药方法同ADR组；(5)NaHS组（n=9）：经腹腔注射NaHS，14 μmol·kg-1·d-1，连续用药10周。于第10周检测大鼠心功能和血流动力学指标,并测定其血清及心肌组织中H2S、脂质过氧化物丙二醛(MDA) 的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性，比较其中的差异。结果：ADR组大鼠心功能较对照组明显降低(均P<0.01)，且血清及心肌组织H2S含量均明显低于对照组(P<0.01），MDA含量明显较对照组升高(均P<0.01)，SOD的活性明显降低(均P<0.01)，GSH-Px的活性亦明显降低(血清及心肌组织：P<0.05，P<0.01)；经外源性补充H2S供体NaHS后，大鼠心功能较前明显改善，ADR+大剂量NaHS组心肌组织中过氧化产物MDA含量明显降低(均P<0.01)，而血清MDA含量无明显差异(P>0.05)；ADR+大剂量NaHS组血清SOD活性明显升高(P<0.01)，而心肌组织SOD活性无明显差异(P>0.05)；ADR+大剂量NaHS组心肌组织GSH-Px活性明显增高(均P<0.05)，而血清GSH-Px活性无明显差异(P>0.05)。结论：硫化氢参与了大鼠阿霉素心肌病的发病过程,外源性补充硫化氢供体NaHS可以改善阿霉素心肌病大鼠心功能，降低心肌组织中脂质过氧化物的含量，显著提高抗氧化酶体系的活性，减轻氧化应激损伤，从而参与对大鼠心肌的保护机制。     

环孢素对癫痫大鼠海马氧化应激及线粒体能量代谢的影响

 目的：探讨环孢素对癫痫大鼠海马氧化应激、线粒体膜通透性及能量代谢的影响及机制。方法：应用匹鲁卡品建立癫痫持续状态模型,检测癫痫大鼠海马在环孢素干预前后丙二醛和超氧化物歧化酶的变化;检测癫痫大鼠海马在环孢素干预前后线粒体膜通透性转换、线粒体呼吸链复合物I和III活性及ATP含量的变化。结果：环孢素抑制癫痫大鼠海马组织线粒体膜通透性转换;明显降低癫痫大鼠海马组织丙二醛的含量,提高超氧化物歧化酶的活性（P<0.05）;明显增加癫痫大鼠海马组织线粒体呼吸链复合物I活性（P<0.05）,而对粒体呼吸链复合物III活性无显著影响;明显增加癫痫大鼠海马组织ATP的含量（P<0.05）。结论：环孢素能抑制癫痫大鼠海马氧化应激反应,减轻癫痫大鼠线粒体能量代谢损伤。     

氧化应激激活JNK-MAPK参与波动性高血糖诱导的大鼠肝细胞损伤

目的:探讨波动性高血糖引起糖尿病大鼠肝细胞凋亡的机制。方法:SD大鼠随机均分为4组:正常对照组、稳定高血糖组、波动高血糖组和胰岛素组。采用链脲佐菌素65 mg/kg腹腔注射诱发糖尿病,波动高血糖组每天定时腹腔注射速效胰岛素,并错时给予葡萄糖,造成1 d中血糖浓度大幅度波动,12周内波动高血糖组每天血糖波动模式相似,且Hb A1c与稳定高血糖组无显著差异。12周后取血和肝脏组织,采用比色法检测超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量,RT-PCR和Western blot检测JNK、p-JNK、Bax和Bcl-2的含量。结果:与正常对照组比较,稳定高血糖组、胰岛素组和波动高血糖组的食物量、饮水量和尿量增加,肝功能异常;MDA含量增多,SOD和GSH-Px活性降低,NO含量减少(P0.05);JNK mRNA、p-JNK蛋白及Bax蛋白水平上调(P0.05),Bcl-2表达减少(P0.01);且波动高血糖组的以上变化均较稳定高血糖和胰岛素组更加明显(P0.05)。结论:波动性高血糖较稳定性高血糖更促进糖尿病肝细胞的凋亡,其机制与JNK-MAPK信号转导通路激活有关。     

肌肽对糖尿病肾病大鼠氧化应激及NF-κB信号通路的影响

目的　探讨肌肽对糖尿病肾病（DN）大鼠肾组织的保护作用及其对氧化应激、NF-κB信号通路的影响。 方法　60只SPF级8周龄雄性SD大鼠，随机选取12只为对照组，其余予以高糖高脂饮食+链脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病模型。注射链脲佐菌素3 d后，将符合糖尿病标准大鼠随机分为模型组、肌肽（100、300、900 mg/kg）组。肌肽各组分别灌胃100、300、900 mg/kg肌肽，每日1次。8周后，检测空腹血糖（FBG）、血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、24 h尿微量白蛋白（mAlb）。PAS染色法观察大鼠肾形态学变化；试剂盒检测肾组织的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量；免疫组织化学及Western blot检测肾组织P-NF-κB P65蛋白的表达。 结果　 DN大鼠建模成功。与模型组相比，肌肽组肾组织病理损伤明显减轻。肌肽各组大鼠mAlb、FBG、BUN水平下降，呈量-效依赖性关系（P<0.05），而SOD、GSH、GSH-Px的含量逐级升高，同时MDA和P-NF-κB P65含量减少。 结论　肌肽对DN模型大鼠肾组织具有保护作用，其机制可能与抑制氧化应激和NF-κB信号通路异常激活有关。     

利拉鲁肽通过p38 MAPK通路改善高同型半胱氨酸血症诱导的大鼠海马氧化应激及炎症损伤

目的:探讨胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物利拉鲁肽(Lir)对高同型半胱氨酸血症(Hhcy)大鼠海马损伤的保护作用及其机制。方法:40只SD大鼠随机分为对照(Ctrl)组、模型(Hhcy)组、Lir低剂量(12.5μg·kg~(-1)·h~(-1))组、Lir中剂量(25.0μg·kg~(-1)·h~(-1))组和Lir高剂量(37.5μg·kg~(-1)·h~(-1))组,采用Western blot法检测大鼠海马组织内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中p38、JNK和ERK1/2的蛋白表达及活性依赖的磷酸化水平,同时采用Western blot和免疫组织化学法检测内质网应激标志蛋白免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)和C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达水平;采用酶标法检测超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量;酶联免疫吸附法检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。结果:Hhcy可明显上调p-p38、BIP和CHOP的蛋白表达量,降低SOD和GSH的活性,升高MDA含量及IL-1β、IL-6和TNF-α水平;腹腔注射Lir可浓度依赖性地改善Hhcy引起的上述内质网应激和炎症反应,并伴有p38 MAPK通路的抑制。结论:Lir可改善Hhcy诱导的大鼠海马组织氧化应激和炎症损伤,其机制可能与抑制p38 MAPK信号通路的过度激活有关。     

冬凌草甲素介导Notch信号通路对IgA肾病大鼠肾组织损伤及炎症因子、氧化应激的影响

目的观察冬凌草甲素对IgA肾病(IgAN)大鼠肾组织损伤及炎症因子、氧化应激的影响。方法将60只SD大鼠随机分为对照组、模型组(IgAN)、低、中、高剂量冬凌草甲素组(5、10、20 mg/kg)及阳性对照组(10 mg/kg贝那普利),采用BCA法检测24 h尿蛋白含量,肌酐酶法检测血清肌酐(Scr)含量,脲酶连续监测法检测尿素氮(BUN)含量,HE染色观察肾组织病理损伤,生化试剂盒检测肾组织炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α及氧化应激指标[超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)],蛋白印迹检测Notch1信号通路蛋白表达。另取40只大鼠随机分为假手术组、IgAN组、Notch1激活剂Jagged1组及Jagged1+冬凌草甲素组(20 mg/kg),观察各组大鼠上述指标的变化。结果与IgAN组比较,中、高剂量冬凌草甲素组和贝那普利组24 h尿蛋白、血清Scr、BUN、TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、Notch1及Hes1表达降低,SOD、GSH-Px水平升高(P<0.05),且高剂量冬凌草甲素组与贝那普利组上述指标比较,...     

脂多糖持续刺激巨噬细胞的免疫学机制初探

目的:探讨巨噬细胞在脂多糖(LPS)的持续刺激下产生免疫抑制后的表型变化及对T细胞影响的分子机制。方法:蔗糖密度梯度离心法从全血中分离人外周血单个核细胞,结合磁珠细胞分选技术分选出单核细胞,体外诱导单核细胞分化为巨噬细胞,以未处理和IFN-γ处理为对照,对LPS处理48 h的巨噬细胞进行形态学观察、细胞表面分子(HLA-DR、CD14、CCR7、HLA-ABC及CD40)表达的检测和细胞因子(IL-10、IL-12、IL-6及TNF-α)分泌水平的检测。同时将LPS诱导的巨噬细胞与CD3+T细胞进行异体共培养,进一步观察巨噬细胞对T细胞增殖能力的影响。用实时荧光定量PCR验证Toll样受体4(TLR4)信号通路中的非My D88依赖型途径相关分子的表达水平。结果:LPS处理48 h的巨噬细胞,抗原递呈能力(HLA-DR)下降,免疫抑制细胞因子IL-10升高,把LPS诱导的巨噬细胞与异体T细胞共培养6 d,其促进CD8+T细胞增殖的能力较弱。实时荧光定量PCR结果显示LPS持续刺激下巨噬细胞的TRIF、IRF3和CIITA均呈下调状态。结论:持续LPS处理巨噬细胞48 h后,巨噬细胞呈现一种免疫抑制的状态,且其刺激CD8+T细胞增殖的能力减弱,这种状态与非My D88依赖型TLR4信号通路受损有关。     

钙网蛋白参与缺氧预处理对氧化应激损伤大鼠成心肌H9c2细胞的保护作用

目的： 观察缺氧预处理(HPC)对氧化应激诱导大鼠成心肌H9c2细胞损伤的保护作用，探讨钙网蛋白(CRT)是否参与其保护效应及p38 MAPK是否参与其信号转导过程。方法: H9c2细胞随机分为8组：氧化应激(H₂O₂)组、短暂缺氧(HPC)组、HPC+H₂O₂组、SB203580+HPC + H₂O₂组、反义干扰(AS)组、AS+H₂O₂组、AS+HPC+H₂O₂组和对照组。以细胞存活率、乳酸脱氢酶 (LDH)活性及流式细胞术检测细胞损伤情况；采用RT-PCR和Western blotting分别检测CRT表达和p38 MAPK磷酸化水平。结果: (1)HPC可减轻氧化应激损伤，与H₂O₂组比较，HPC+ H₂O₂组细胞凋亡率和LDH漏出分别降低13.4%和44.0%，存活率增高12.7%(均P<0.05)；HPC前以特异性p38 MAPK抑制剂 SB203580预孵育消除HPC的保护作用，与HPC+H₂O₂组相比，细胞凋亡率和LDH漏出分别增高5.4%和45.0%，存活率降低5.0%(均P<0.05)；(2)氧化应激明显上调CRT表达(较对照组高3.6倍)(P<0.05)；单纯短暂缺氧可诱导CRT表达(较对照组高1.4倍,P<0.05)，但上调程度较H₂O₂组低48%(P<0.05)；HPC可降低CRT过表达程度(降低26%) (P<0.05)；(3)反义寡核苷酸干扰CRT表达后HPC对氧化应激的保护作用降低，相关分析显示HPC诱导的CRT适度表达与细胞存活率正相关(r=0.8573,P<0.05)；(4) HPC前应用p38 MAPK抑制剂，抑制CRT表达上调(分别较HPC+H₂O₂组和HPC组低38%和23%) (均P<0.05)。结论: HPC可通过p38 MAPK信号途径诱导CRT表达上调，减轻大鼠成心肌H9c2细胞氧化应激损伤。     

COX-2抑制剂通过非COX依赖性途径对抗心肌氧化损伤

目的： 研究环加氧酶2（COX-2）抑制剂尼美舒利和COX-1抑制剂比罗昔康在对抗心肌氧化应激损伤中的作用及其机制。方法: 离体大鼠心脏行Langendorff灌流，分别给予H₂O₂、pyrogallol（可产生超氧阴离子）或Vit C+Fe2+（可产生羟自由基），观察心脏收缩功能、心肌LDH和MDA含量。心肌COX的活性用PGI₂的稳定产物6-Keto-PGF_1α的含量表示。结果: 尼美舒利（3 mg/kg）可明显减轻H₂O₂引起的收缩功能下降（10 min 应激时LVDP为72%±10% vs 61%±11%，P<0.05），减少LDH释放［（5.5±2.5）U/L vs （8.0±2.1）U/L，P<0.05）］。而比罗昔康（3 mg/kg）虽然能抑制H2O2应激时LVDP的下降（73%±10% vs 61%±11%，P<0.05），却加重LVEDP的上抬［（29.00±5.61）mmHg vs（23.16±3.57） mmHg，P<0.01］。尼美舒利亦能减轻超氧阴离子和羟自由基引起的心肌损伤作用。尼美舒利和比罗昔康预处理对H₂O₂应激心肌6-Keto-PGF_1α含量无明显影响。线粒体ATP敏感性钾通道（mitochondrial ATP sensitive potassium channel，mitoK_ATP）的阻断剂5-HD可取消尼美舒利减轻H₂O₂引起的LVDP和±dp/dt_max降低作用（分别为53%±12% vs 69%±3%、58%±11% vs 72%±7%和37%±8% vs 51%±4%，P<0.01）。结论: COX-2抑制剂尼美舒利可以对抗心肌氧化损伤，其机制通过非COX依赖性途径发挥作用，而mitoK_ATP可能参与尼美舒利的保护作用。     

Activation of ATM signaling pathway is involved in oxidative stress-induced expression of mito-inhibitory p21WAF1/Cip1 in chronic non-suppurative destructive cholangitis in primary biliary cirrhosis: an immunohistochemical study

Biliary epithelial cells (BECs) of chronic non-suppurative destructive cholangitis (CNSDC) in primary biliary cirrhosis (PBC) reportedly express p21(WAF1/Cip1) and p16(INK4a), which may induce cell cycle arrest and are related to progressive loss of BECs of PBC. Given that the ATM pathway plays a role in the induction of p21(WAF1/Cip1), we examined its possible involvement in bile duct damage of PBC. The expression of phosphorylated-ATM (p-ATM) reflecting the activation of ATM, p21(WAF1/Cip1) and 8-hydroxy-deoxyguanosine (8-OHdG), an oxidative stress marker, was examined immunohistochemically in the liver tissues of 20 cases of stage 1/2 PBC, 9 extrahepatic biliary obstruction (EBO), 35 chronic viral hepatitis (CVH), 17 nonalcoholic steatohepatitis (NASH), and 18 histologically normal liver. p21(WAF1/Cip1), p-ATM and 8-OHdG were frequently and extensively co-expressed in the nuclei of CNSDC in PBC, and their expressions were correlated. In contrast, the expression of these three molecules was absent or faint in small bile ducts in normal livers, CVH, and EBO, and these molecules were clearly expressed in the nuclei of hepatocytes of NASH, in which oxidative stress is involved in hepatocellular damage. In conclusion, oxidative stress-induced p21(WAF1/Cip1) expression in BECs in PBC is closely associated with activation of the ATM pathway and the resultant reduced regeneration or cell cycle arrest of BECs may be related to the progressive loss of small bile ducts of PBC.