戊型肝炎病毒结构区基因ORF2在Pichia pastoris中的分泌表达

戊型肝炎是近年来被发现的一种较为严重的新型肝炎 ,经消化道传播 ,世界各地均有流行 ,戊型肝炎疫苗是预防和控制其流行的有效手段之一 ,而基因工程抗原作为候选疫苗有很好的应用前景。已被证实 ,戊型肝炎病毒 (ＨＥＶ)结构区基因ＯＲＦ2编码蛋白具有较强的免疫学活性。ＨＥＶ基因工程抗原的研制主要集中于ＯＲＦ2上。目前 ,ＯＲＦ2基因已成功在原核细胞、昆虫细胞中得到表达 ,表达产物均有一定免疫原性〔1〕。酵母表达系统以其表达产物类似于天然蛋白、能保持很好的生物学活性、表达条件易于控制、易于工业化生产等优势作为疫苗研制的载体…     

酶母表达的重组HEV ORF2蛋白在戊型肝炎诊断中的初步应用

戊型肝炎是经消化道途径传播的传染病 ,对人民健康影响很大 ,疫苗和诊断抗原的研制和开发是预防和控制其流行和传播的重要手段。戊型肝炎病毒(ＨｅｐａｔｉｔｉｓＥｖｉｒｕｓ ,ＨＥＶ)结构区蛋白ＯＲＦ2存在多个抗原性决定簇并可能具有中和抗体的结合位点 ,因此戊型肝炎病毒基因工程重组蛋白的研制主要集中于ＯＲＦ2。我们应用巴氏毕赤酵母 (ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ)成功表达了戊型肝炎病毒结构区蛋白ＯＲＦ2 ,制备了新型重组ＨＥＶＯＲＦ2 ,将其作为抗原建立酶联免疫吸附试验 (简称Ｐ ＥＬＩＳＡ) ,检测正常人群及戊型肝炎患者血清…     

酵母表达的重组戊型肝炎病毒ORF2蛋白在实验感染恒河猴血清抗体检测中的应用

诊断试剂的研制和开发亦是戊型肝炎研究的重要内容 ,以Ｅ .Ｃｏｌｉ及昆虫细胞表达的重组戊型肝炎病毒 (ＨＥＶ)ＯＲＦ2蛋白作为抗原建立的免疫学检测方法已应用临床戊型肝炎的诊断、实验感染灵长类动物抗戊型肝炎病毒 (ＨＥＶ)抗体的检测以及ＨＥＶ特异性抗原的检测。这些方法包括 :Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ,ＩＦＡ、ＥＬＩＳＡ等。研究证实 ,重组ＨＥＶＯＲＦ2蛋白具有较好的抗原性〔1 3〕。我们应用巴氏毕赤酵母 (Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ)成功表达了戊型肝炎结构区蛋白ＯＲＦ2 ,制备了新型重组ＨＥＶＯＲＦ2 〔4〕,将其作为抗原建…     

戊型肝炎病毒中国株结构区ORF2 cDNA的克隆及表达

将戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）中国株结构区第二开放读码框架（ＯＲＦ２）８３７ｂｐ ｃＤＮＡ片段插入ｐＧＥＸ１λＴ质粒中进行表达。经免疫吸印法证明，该质粒表达的融合蛋白具有识别抗－ＨＥＶ的抗原表位，可用于制备抗－ＨＥＶ检测试剂。     

丙型肝炎病毒及恶性疟原虫复合多表位抗原基因与谷胱甘肽转硫酶基因的融合表达及其在小鼠中免疫应答的研究

目的：探讨复合多表位丙型肝炎病毒（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）及恶性疟原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ,Ｐｆ）双价疫苗的可行性。方法：将人工合成的复合多表位ＨＣＶ基因ＰＣＸ及Ｐｆ抗原基因ＡＢ（ＳＰｆ６６＋ＳＰｆ１０５）克隆到谷胱甘肽转硫酶（ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ,ＧＳＴ）表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ中,并在大肠杆菌中高效表达ＧＳＴＨＣＶＰｆ复合抗原（ＧＳＴＣＡＢ）,分析表达产物的免疫特异性、免疫原性及安全性。结果：ＧＳＴＣＡＢ可被ＨＣＶ患者血清、鼠抗ＧＺＰＣＸ及鼠抗Ｐｆ抗体特异识别,可诱发小鼠产生针对ＧＳＴＣＡＢ、ＧＺＰＣＸ及ＰｆＡｇ的特异性体液免疫应答及针对ＧＳＴＣＡＢ、ＧＺＰＣＸ的迟发性超敏反应,免疫后ＣＤ８＋Ｔ细胞比例略为升高,免疫小鼠未见明显的毒副作用。结论：ＧＳＴＣＡＢ融合蛋白具有良好的ＨＣＶ及Ｐｆ免疫特异性,可诱发理想的体液及细胞免疫应答,可望成为ＨＣＶＰｆ双价疫苗的候选抗原。     

庚型肝炎病毒(HGV)E2区cDNA的克隆与表达

目的　克隆ＨＧＶ Ｅ２ 基因并在原核细胞系统中表达ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白。方法　从ＨＧＶＲＮＡ 阳性血浆中抽提病毒ＲＮＡ,利用半巢式ＲＴＰＣＲ 法扩增ＨＧＶ Ｅ２ 基因片段并进行序列分析。然后将该片段克隆到ｐＧＥＸ５ｘ１ 表达载体上,进行诱导表达。表达产物用抗ＨＧＶ 阳性血浆作Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 活性鉴定。结果　获得ＨＧＶ Ｅ２ Ｎ 端长度为７７９ 个核苷酸的基因片段。该片段与美国株ＨＧＶ（Ｕ４４４０２） 、西非株ＧＢＶＣ（ Ｕ３６３８０） 、中国株ＨＧＶ（ Ｕ７５３５６） 的核苷酸序列同源性分别为８４ ％ 、８５ ％ 、９１ ％ ,推测的氨基酸序列同源性分别为８８ ％ 、９３ ％ 、９４ ％ 。表达产物为相对分子质量约５０ ×１０３的ＧＳＴＥ２ 融合蛋白,在细胞内形成包涵体。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 反应中在约５０ ×１０３ 处有显色条带。结论本研究成功地在原核细胞系统中表达了具有抗原性的ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白,为进一步研究ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白及Ｅ２ 抗体的生物学功能打下了基础。     

输血后肝炎患者、血透患者及非甲～戊型肝炎患者中庚型肝炎病毒感染的研究

我们用逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）方法,对输血后肝炎患者（已排除甲～戊型肝炎病毒感染）１２４作者单位：５１０２６０广州医学院第二附属医院传染病科例,血液透析患者（含ＨＢＶ和ＨＣＶ标志物阳性者）８１例,急性非甲～戊型肝炎患者（无...     

日本脑炎病毒和乙型肝炎病毒抗原真核表达载体的体外共表达

作者构建了日本脑炎病毒（Ｊａｐａｎｅｓｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＪＥＶ）前膜蛋白囊膜蛋白（ｐｒＭＥ）和乙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ，ＨＢＶ）前Ｓ蛋白（ｐｒｅＳ）的真核表达载体，分别命名为ｐｃＤＮＡ３Ｅ和ｐＳＧ５ｐｒｅＳ。等量混合这两种质粒，转染ＣＯＳ７细胞进行瞬间表达，应用单克隆抗本ＥＬＩＳＡ法检测特异性抗原。结果表明，单独及混合转染的细胞培养上清中均有特异性抗原表达。本项研究为进一步发展新型日本脑炎病毒和乙型肝炎病毒核酸疫苗打下了基础，也初步显示了核酸疫苗技术在联合疫苗研制中的应用前景     

戊型肝炎患者外周血T细胞亚群的改变及意义

戊型肝炎患者外周血Ｔ细胞亚群的改变及意义黄书明（江苏省南通市传染病院南通２２６００６）１９８９年Ｒｅｙｅｓ等［１］获得戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）的基因克隆并建立了检测抗ＨＥＶ血清学方法，但对戊型肝炎肝细胞损伤的机制仍不十分清楚。本文通过对３１例戊型肝炎患...     

血清学标志阴性的非甲～戊型肝炎的病原学研究

目的对血清学标志阴性的非甲～戊型肝炎进行病原学研究。方法用ＨＢＶＰＣＲ、ＨＣＶＲＴ－ＰＣＲ和ＨＥＶＲＴ－ＰＣＲ分别检测血清学标志阴性的非甲～戊型肝炎患者血清，并对其部分阳性产物进行克隆测序。结果８７例非甲～戊型肝炎血清ＨＢＶＤＮＡ均为阴性，９例（１０．３％）为ＨＣＶＲＮＡ阳性，部分经测序证实为ＨＣＶ１ｂ亚型；余７８例为ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ均阴性。该７８例中，１４例因无血清未作ＨＥＶＲＮＡ检测，余６４例中４９例（７６．６％）为ＨＥＶＲＮＡ阴性，１５例（２３．４％）为ＨＥＶＲＮＡ阳性。经序列分析显示，其中９例为典型的中国ＨＥＶ株基因序列，６例变异较大，与典型的中国株基因序列的同源性仅为８０％左右。４９例ＨＢＶＤＮＡ、ＨＣＶＲＮＡ和ＨＥＶＲＮＡ均阴性的血清中１６例（３２．６％）ＨＧＶＲＮＡ阳性。由此可见，该８７例中至少有９例为ＨＣＶ感染，１５例为ＨＥＶ感染，１６例为ＨＧＶ感染。结论对血清学标志阴性的非甲～戊型肝炎的病人应该用ＰＣＲ法进行病原学分型，以明确其诊断     

一种新型戊型肝炎病毒样颗粒的表达、纯化及其免疫原性

目的以非包涵体形式表达含戊型肝炎病毒(HEV)中和抗原表位的新型HEV重组蛋白,并对其进行鉴定和分析。方法将HEV开放阅读框架2(ORF2)编码452~617位氨基酸的基因片段连接到载体pET28a( ),转化大肠杆菌,获取表达克隆。以Ni-NTA层析柱纯化表达的蛋白,并用SDS-PAGE、Westernblot和直接电镜负染等方法分析鉴定,最后免疫小鼠检测特异性抗体的产生水平。结果表达的重组蛋白天然可溶,相对分子质量(Mr)约为22000,并可形成直径为20nm左右的病毒样颗粒,能与戊型肝炎患者血清发生Westernblot阳性反应,免疫小鼠后可诱导产生高滴度的特异性抗体。体外中和试验显示产生的抗体具有中和HEV的活性。结论原核表达的、含HEV中和抗原表位的、长度仅166个氨基酸的HEVORF2近3′端编码蛋白能够形成病毒样颗粒,而且该新型病毒样颗粒具有良好的抗原性和免疫原性。     

人乳头瘤病毒16型 E5基因克隆、原核表达及产物鉴定

目的 克隆HPVl6 E5基因,构建原核重组工程菌并诱导表达,对表达产物HPVl6E5蛋白进行鉴定.方法 提取宫颈癌组织DNA作为模板,用PCR方法扩增HPVl6 E5基因,经BamH I和HindⅢ双酶切后,插入相同酶切的pET21b载体质粒,转化DH5α,筛选阳性克隆.经酶切和测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),建屯重组工程菌株pET21b-HPVl6E5/BL21(DE3).经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物.结果 HPVl6 E5基因扩增片段0.27kb.测定序列与HPVl6原型株E5基因比较,出现4处核苷酸变异,分别为3979、4042、4077和4089位,引起144L和165V氨基酸改变.重组质粒经酶切和序列测定证实构建正确.SDS-PAGE分析重组菌在16 kDa处出现蛋白条带.该蛋白条带可被组氨酸标签单克隆抗体特异性识别.结论 成功克隆HPVl6E5基因,并构建原核表达质粒,E5 蛋白在BL21(DE3)中表达.本实验为进一步研究E5生物学活性、转化活性和肿瘤杀伤免疫作用奠定了实验基础.     

HIV-1 Tat基因的融合构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的：在E．coli BL21(DE3)中高效表达Tat蛋白。方法：用PCR方法构建HIV-1 Tat基因全序列，同时将Tat基因进行定点突变(AAG28替换为CAG，AAG50替换为CAG)，以消除天然．Tat蛋白的转录活性。将突变的Tat基因与伴侣10(chap10)基因连接后，共同亚克隆人表达载体pET28a中，并在Ecoli中表达，表达产物用Western blot进行鉴定。结果：分别通过3轮PCR，成功地构建了Tat基因全序列。构建的重组质粒pET28a-chap10-Tat在Ecoli BL21(DE3)中得到高效表达。Western blot分析表明，在相对分子质量(Mr)为24000处有1条特异性的带。结论：chap10基因与HIV-1 Tat全基因的融合构建，使Tat蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，为其在爱滋病发病中作用研究奠定了基础。     

弓形虫ROP2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :构建弓形虫棒状体蛋白 (ROP2 )基因重组质粒并在大肠杆菌中表达 ,用于筛选弓形虫新的诊断抗原和疫苗分子。方法 :根据ROP2基因已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段 ,再克隆到pGEX 4T 1质粒 ,重组质粒经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序 ;重组质粒在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中进行ITPG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE及WesternBlot分析。结果 :ROP2基因PCR产物大小与预期相符 ,约 1 0 4 3bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合 ;SDS PAGE及免疫印迹显示ROP2融合蛋白表观分子量约为 5 5kDa ,表达产物约占菌体总蛋白1 7% ,具有一定的免疫反应性。结论 :克隆并表达了弓形虫ROP2基因 ,为下一步弓形虫诊断及疫苗研究奠定了基础     

点突变SEA(D227A)的基因构建、原核表达与鉴定

目的：进行点突变的SEA(D227A)基因原核表达载体的构建，并进行表达、分离纯化与鉴定。方法：采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因，通过下游引物上的点突变，使得到的SEA基因752位碱基突变由A突变为c，致使SEA成熟蛋白的第227位氨基酸残基由D(DAT)突变为A(GCF)，构建pRSET：SEA(D227A)重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行原核表达，再通过Western blot进行鉴定。结果：构建的SEA(D227A)基因经测序证实与设计的序列一致。成功地构建pRSET-SEA(D227A)重组表达质粒，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过IPTG诱导得到分子量约为32kD的蛋白，Western blot显示其能够与抗SEA的单克隆抗体特异性结合，最后采用Ni^2 -NTA柱进行分离纯化。结论：成功地构建SEA(D227A)基因原核表达载体，并在大肠杆菌中得到高效表达，为寻找有效低毒副作用的超抗原提供了线索。     

幽门螺杆菌全长hpaA基因克隆和在大肠杆菌中高效表达

为了构建幽门螺杆菌（H.pylori)全长hpaA基因表达质粒,在大肠杆菌中表达重组HpaA(reHpaA)蛋白,我们用PCR扩增全长hpaA基因,经适当的酶切－连接反应将其连入原核表达质粒pTrc99A,反应产物转化大肠杆菌JM105,用Amp( )培养基筛选,提取重组菌质粒,PCR和酶切鉴定,筛选阳性克隆,并用重组菌质粒进行hpaA基因测序。阳性克隆经IPTG诱导培养,用SDS－PAGE电泳和Western blot进行reHpaA表达分析和鉴定,用薄层扫描分析reHpaA含量。结果显示,重组质粒pTrc99A-hpaA经PCR和酶切后均产生783bp hpaA基因。重组菌能表达约30kD reHpaA蛋白,含量占全菌体蛋白量的51．99％,Western blot证实其有免疫反应性。重组H.pylori HpaA表达质粒的成功构建及在大肠杆菌中高效表达的实现,为探索制备H.pylori疫苗奠定了一定基础。     

SARS病毒S1蛋白的克隆、表达及其重组蛋白免疫学特性的鉴定

目的：研究SARS病毒感染后机体产生保护性免疫应答的规律和可能机制。方法：通过生物信息学分析，在原核表达系统中表达了SARS病毒S1蛋白。利用SARS流行前正常人血清和6份SARS患者恢复期的血清，对纯化的重组S1蛋白进行血清学分析。结果：研究中克隆表达的重组蛋白序列与公布的SARS病毒S1蛋白的序列相同。6份SARS患者恢复期的血清均能识别重组S1蛋白，而6份SABS流行前的正常人血清则不能与重组蛋白反应。结论：获得的重组S1蛋白具有与天然SARS病毒s1蛋白相同的序列，并具有与之相似的血清学反应性，为研究SARS病毒感染免疫应答的过程及其机制和制备SARS病毒的重组疫苗提供了良好的物质基础。     

丙型肝炎病毒非结构区NS3基因在大肠埃希菌中的可诱导性表达

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）NS3基因的原核细胞表达载体。实现在大肠埃希菌中的可诱导性表达。方法 应用聚合酶链反应（PCR）技术，以美国HCV-H株全长cDNA质粒为模板，扩增获得NS3基因片段，克隆到原核表达载体pET-30C( )中，构建原核表达载体pET-NS3，转化BL21（DE3）宿主菌，以IPTG诱导，获得NS3蛋白的可诱导性表达，以HCVNS3的单链可变区抗体（ScFv)证实表达的NS3蛋白的特异性，结果 以HCVNS3基因序列特异性引物，PCR扩增获得1893bp的NS3DNA征段，插入pET-30C( )表达载体，转化BL21（DE3）受体菌，经培养，IPTG诱导，获得了重组HCVNS3蛋白的表达，以HCVNS3的ScFv证实了表达的重组蛋白HCVNS3的特异性。结论 以大肠埃希菌表达了HCVNS3的重组蛋白质。     

人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）胶原样区（CLR）蛋白。方法：应用PCR技术,从含中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段,将其克隆至pET32a原核表达载体后,转化E.coliBL21（DE3）感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni^2＋-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA法进行鉴定。结果：从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段,测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带。Western blot分析表明,3条蛋白带均可与抗His抗体起反应,3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实,纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论：获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白,为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件。