Elafin基因重组气道上皮调节脂多糖诱导的人气道黏液高分泌

目的 探讨天然内生多肽Elafin对脂多糖诱导的气道黏液高分泌的调节机制.方法 构建人Elafin重组质粒pEGFP-N1-Elafin,转染正常人支气管上皮细胞HBE16,给予脂多糖(LPS)刺激,激光共聚焦扫描显微镜检测Elafin蛋白含量,Western blot法检测IKBa蛋白含量;荧光素酶报告基因检测系统测定核转录因子-κB(NF-κB)活性;RT-PCR检测Elafin和黏蛋白(MUC)SAC mRNA表达水平;ELISA法分析MUCSAC蛋白相对含量.结果 成功构建内生多肽Elafin真核表达载体pEGFP-N1-Elafin并转染HBEi6细胞.转染重组Elafin后Elafin蛋白含量及mRNA水平明显增加.与对照组相比,LPS刺激组IκBα蛋白含量降低,NF-κB相对活性明显增强,MUC5AC蛋白含量及mRNA水平也显著增加.转染重组Elafin后再予以LPS刺激,与单纯LPS刺激组相比,IκBα蛋白含量明显增加,NF-κB相对活性显著降低,MUCSAC蛋白含量及mRNA水平也明显降低.结论 天然内生多肽Elafin重组气道上皮可下调NF-κB的活性,降低脂多糖诱导的气道黏液高分泌.     

BRAP对LPS诱导的人气道上皮细胞系黏液高分泌的影响

目的探讨蛙皮素受体激活蛋白(BRAP)对脂多糖(LPS)诱导的气道黏液高分泌的影响及相关作用机制。方法体外培养人气道上皮HBE16细胞,转染已构建好的p EGFP-N1-BRAP,以空质粒载体作为对照,给予LPS刺激,同时分别以ERK抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125、P38抑制剂SB203580干预。观察细胞内活性氧(ROS)含量、黏蛋白(MUC)5AC表达和核因子-κB(NF-κB)活性以及细胞活力的变化。结果转染p EGFP-N1-BRAP后ROS明显减少(P0.01);同单纯LPS刺激相比,MUC5AC蛋白含量和mRNA水平在转染p EGFP-N1-BRAP后明显降低(P0.01),NF-κB活性亦呈相同趋势(P0.05);在U0126组,MUC5AC的表达较转染重组质粒组显著降低(P0.01),NF-κB活性也显著下调(P0.05)。结论 BRAP可以通过ROS/ERK/MAPK信号通路阻止胞质内NF-κB的活化,从而下调MUC5AC的生成。     

Elafin在人支气管上皮细胞系16HBE胞质内对黏蛋白5AC生成的影响

目的 探讨Elafin在胞质内对表皮生长因子(EGF)诱导的黏蛋白(MUC)5AC生成的影响及其作用机制.方法 体外培养人支气管上皮细胞系16HBE,将已构建好的pEGFP-N1-Elafin载体通过LipofectamineTM2000转染到16HBE细胞中,以转染空质粒载体的16HBE细胞作为对照,均给予外源性EG...     

Ezrin介导中性粒细胞弹性蛋白酶诱导的人气道上皮细胞株分泌黏蛋白增加

目的探讨膜连接蛋白Ezrin在中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)诱导气道黏液高分泌的作用及相关调节机制。方法以中性粒细胞弹性蛋白酶刺激培养的人气道上皮HBE16细胞,ELISA法、real-time PCR法测定黏蛋白(MUC)5AC的蛋白及mRNA水平。免疫荧光法检测Ezrin蛋白含量。结果 NE刺激30 min后MUC5AC mRNA表达增强,细胞中及培养上清中黏蛋白MUC5AC的含量均显著高于对照组(P0.01);转染Ezrin永久磷酸化载体pEGFPN1-Ezrin-T567D的细胞经NE刺激后,胞质内磷酸化Ezrin表达明显增强,且胞膜分布增多。同时,细胞培养上清液中的MUC5AC蛋白含量亦显著高于单纯NE组(P0.01)。遏制Ezrin磷酸化pEGFP-N1-Ezrin-T567A载体转染组在NE刺激后,Ezrin蛋白与pEGFP-N1-Ezrin-T567D组相比有明显减少,且未出现向胞膜聚集的趋势,同时分泌至培养上清的MUC5AC蛋白也有明显减少(P0.01),同时伴随胞质内MUC5AC蛋白有所增加(P0.05)。结论 Ezrin蛋白参与了NE诱导的MUC5AC蛋白分泌,是气道上皮细胞MUC5AC分泌的重要调控分子。     

小窝蛋白1 对气道上皮细胞黏液高分泌的影响

目的:探讨小窝蛋白1(Cav-1)对脂多糖(LPS)诱导的气道黏液高分泌的影响。方法:体外培养人气道上皮细胞(16HBE),用LPS刺激细胞构建黏液高分泌模型,以Toll样受体4(TLR4)抑制剂E5564、核转录因子-κB(NF-κB)抑制剂PDTC、转染Cav-1质粒和siRNA为干预因素,将细胞随机分为对照组、LPS刺激组、LPS+Cav-1质粒组、LPS+Cav-1 siRNA组、LPS+阴性siRNA组、LPS+空质粒组、LPS+E5564组及LPS+PDTC组。四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测各组细胞的活力;RT-PCR检测黏蛋白(MUC)5AC的转录水平;Western blot检测Cav-1、TLR4、磷酸化IκBα(p-IκBα)蛋白的相对含量;ELISA检测MUC5AC的分泌水平;激光共聚焦技术检测细胞内MUC5AC蛋白的分布和含量。结果:LPS刺激组细胞内TLR4、p-IκBα、NF-κB、MUC5AC转录及蛋白水平显著高于对照组(P值均0.05),过表达Cav-1可进一步增加上述指标的表达量,而下调Cav-1及给予E5564、PDTC可以抑制LPS引起的上述效应(P0.05)。结论:Cav-1可通过上调TLR4/NF-κB信号通路而加重LPS诱导的MUC5AC的表达量。     

人Gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建人Gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-Gax质粒中扩增出人Gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定后通过梭华-Sofast转染试剂介导重组质粒转染至兔血管平滑肌细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达和RT-PCR扩增转染细胞的cDNA来鉴定Gax在兔血管平滑肌细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物人Gax基因片段约915bp,与预期分子量相符;酶切分析和测序鉴定证明人Gax真核表达载体pEGFP-N1-Gax连接正确;荧光显微镜观察到重组质粒转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,及RT-PCR证明转染细胞有人GaxmRNA表达。结论:成功构建人Gax基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-Gax,并证实在兔血管平滑肌细胞中表达,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒的构建及体外表达

目的 构建PGC-1α真核表达载体pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒,鉴定及体外表达.方法 通过RT-PCR方法从组织中克隆PGC-1α基因片段,酶切后将其定向插入真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒.结果 双酶切法、测序法鉴定表明目的基因正确插入质粒.结论 成功构建了pEGFP-N1-PGC-1α真核表达载体,转染huh-7细胞后,可瞬时、有效表达,为进一步研究PGC-1α调节HBV、HPV生物合成奠定了基础.     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...     

Expression of rat brain-derived neurotrophic factor in COS-7 cells following its eukaryotic expression vector construction

目的:构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因真核表达载体,检测其转染COS-7细胞后的表达.方法:从大鼠海马组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,克隆至pGEM-T载体中.经测序确证后将BDNFcDNA片段与pEGFP-N1载体定向连接.将鉴定正确的重组体pEGFP-N1-BDNF以脂质体法转染至COS-7细胞中,用RT-PCR鉴定BDNF mRNA的表达,免疫印迹法检测BDNF蛋白质表达水平.结果:克隆了BDNF的cDNA,并构建了其真核表达载体pEGFP-N1-BDNF,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;免疫印迹法分析显示,转染48 h时,COS-7细胞以分泌proBDNF-GFP融合蛋白为主,在96 h以分泌成熟BDNF-GFP融合蛋白为主.结论:成功构建pEGFP-N1-BDNF真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达,BDNF前体及成熟体同时分泌到胞外,在不同时间点分泌组合不同.     

TNF-α与香烟烟雾在诱导气道上皮细胞株黏蛋白表达的相互作用

目的 探讨肿瘤坏死因子TNF-α与香烟提取物共同诱导气道黏液高分泌的相互关系及作用特点。方法 培养的人气道上皮细胞BEAS-2B,转染核转录因子（NF）-κB"decoy"寡核苷酸（ODNs）,并以乱序NF-κB ODNs为对照转染组,各组均分别予以TNF-α、10%香烟提取物（CSE）单独刺激及共同刺激,以Western blot、ELISA及RT-PCR法检测各组刺激前后磷酸化表皮生长因子受体（p-EGFR）、黏蛋白（MUC5AC）蛋白及mRNA水平。结果 转染乱序NF-κB ODNs的细胞予以TNF-α、10% CSE刺激后,各组细胞中p-EGFR蛋白水平较对照组升高,伴随MUC5AC蛋白含量及基因转录水平的提高(P<0.05);共孵育组中较单独刺激组升高更为显著（P<0.05）。转染NF-κB"decoy"ODNs组再予以TNF-α刺激,细胞中MUC5AC蛋白含量及mRNA水平与未转染组相比升高不明显,而单用CSE刺激组中的MUC5AC、p-EGFR水平仍有明显升高（P<0.05）;共孵育组显示出与CSE单独刺激组相似的结果。结论 TNF-α、CSE能协同促进气道上皮细胞中黏蛋白合成,转录因子NF-κB主要参与TNF-α所致的MUC5AC表达,而在CSE诱导的效应过程中作用不明显。