低强度高频率振动对成骨细胞生物学特性的影响

目的　研究低强度高频率振动（low-magnitude high-frequency vibration, LMHFV）对成骨细胞生物学特性的影响。 方法　建立LMHFV加载MC3T3-E1细胞模型,观察不同频率LMHFV对MC3T3-E1细胞OPG/RANKL浓度比的影响,获得OPG/RANKL浓度比最高的频率（F）为后续研究频率;以0 Hz为对照,观察LMHFV对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶 (ALP)、骨钙素(OCN) mRNA和蛋白活性,及钙化结节形成的影响;LMHFV加载形成的条件培养液（CMF）孵育RAW264.7细胞,观察CMF对破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、多核破骨细胞形成、TRAP mRNA及蛋白活性的影响;观察LMHFV对MC3T3-E1细胞环氧化酶2(COX-2)蛋白水平的表达及COX-2抑制剂NS-398对LMHFV影响MC3T3-E1细胞分化的作用。 结果　30 Hz LMHFV获得OPG/RANKL浓度比最高,促进ALP、OCN mRNA及蛋白活性增加,增加钙化结节形成。30 Hz LMHFV形成的CM抑制RAW264.7细胞向多核破骨细胞分化,抑制TRAP mRNA及活性;LMHFV可诱导COX-2蛋白水平增加,NS-398能抑制LMHFV促进成骨细胞分化。 结论　30 Hz的LMHFV对MC3T3-E1细胞OPG/RANKL浓度比及成骨分化具有积极的影响,通过调控成骨细胞OPG/RANKL浓度比间接抑制骨吸收,COX-2通路参与了LMHFV对成骨细胞生物学特性的调节作用。     

盐酸小檗碱通过PI3K/Akt信号通路促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的分化

目的:研究盐酸小檗碱对小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1分化与矿化的调控作用及其机制。方法:MC3T3-E1细胞给予不同浓度(0、1、5、10和20 mg/L)的盐酸小檗碱刺激3 d,CCK-8法检测细胞活性。不同浓度的盐酸小檗碱分别干预3 d和7 d,检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性。进一步将实验随机分为4组:对照组、盐酸小檗碱组、盐酸小檗碱+LY249002(PI3K/Akt通路抑制剂)组及LY249002组。干预2 d后,采用real-time PCR检测成骨细胞分化相关因子ALP、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)及Runt相关转录因子2(Runx2)的mRNA表达情况,采用Western blot检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt的表达水平。将MC3TC-E1细胞用矿化培养基诱导21 d,茜素红染色检测其矿化情况。结果:与对照组相比,不同浓度的盐酸小檗碱对细胞活性的影响没有明显差异;不同浓度的盐酸小檗碱处理MC3T3-E1细胞后ALP活性有不同程度升高。Real-time PCR结果表明,盐酸小檗碱(5 mg/L)促进ALP、OCN、OPN及Runx2的mRNA表达(P 0. 01),而LY294002能抑制这些分化相关因子的表达。Western blot检测结果表明,盐酸小檗碱(5 mg/L)促进p-Akt蛋白的表达(P 0. 01),其作用被LY249002抑制。茜素红染色发现盐酸小檗碱组矿化明显,但LY294002能抑制盐酸小檗碱的促进作用。结论:盐酸小檗碱可以促进小鼠前成骨细胞的分化与矿化,其机制可能与其激活PI3K/Akt信号通路有关。     

葛根素干预小鼠成骨细胞分化相关特征性蛋白mRNA的表达CSCD

背景:研究证实葛根素对小鼠卵巢以及与睾丸切除所致骨质疏松具有很好的防治作用,但关于葛根素对成骨细胞分化的影响却少有报道。目的:观察葛根素对成骨细胞碱性磷酸酶mRNA、骨涎蛋白mRNA、骨桥蛋白mRNA以及骨钙素mRNA表达的影响情况。方法:体外培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞,随机分为3组。空白对照组仅更换培养基;葛根素组更换为含有葛根素1×10-6 mol/L培养基;雌二醇组更换为含有雌二醇1×10-7 mol/L培养基。RT-PCR法测定MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶、骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨钙素mRNA的表达结果与结论:葛根素和雌二醇能够延长碱性磷酸酶表达时间,在第12天达到高峰;葛根素和雌二醇在第10天和第12天能够增加骨涎蛋白mRNA的表达。葛根素和雌二醇在第5天和第12天能够减少骨桥蛋白的表达;葛根素和雌二醇在第10天和第12天能够增强骨钙素表达。结果表明葛根素能够通过影响成骨细胞分化相关特征性蛋白mRNA表达,促进成骨细胞的分化,可能是葛根素抗骨质疏松的重要的细胞分子机制之一。     

乌司他丁对骨水泥颗粒诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞凋亡的干预作用

背景:前期研究发现,乌司他丁对RANKL诱导RAW264.7细胞活化为成熟破骨细胞具有一定的抑制作用,并可降低基质金属蛋白酶9的表达,但其对聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥促成骨细胞凋亡效应是否有干预作用尚不清楚。目的:探讨乌司他丁对骨水泥颗粒诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞凋亡及Ⅰ型胶原、骨钙素、基质金属蛋白酶2 mRNA表达的影响。方法:取第六七代生长状态良好的MC3T3-E1鼠前成骨细胞,分4组培养,骨水泥组加入1 g/L的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥悬液;高、低剂量乌司他丁组在加入1 g/L的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥悬液后,再分别加入5 000,500 U/mL的乌司他丁;设置单独培养的细胞为空白对照。MTT法检测细胞增殖活性,茜素红染色检测细胞矿化程度,流式细胞仪检测细胞凋亡率,半定量RT-PCR检测细胞中Ⅰ型胶原、骨钙素、基质金属蛋白酶2 mRNA的表达。结果与结论:与空白对照组比较,骨水泥抑制了MC3T3-E1细胞增殖活性(P0.05),促进了细胞凋亡(P0.05),在加入不同浓度乌司他丁后,细胞增殖活性逐渐增强(P0.05),凋亡率降低(P0.05),且呈剂量时间依赖关系;骨水泥降低了细胞中Ⅰ型胶原、骨钙素表达(P0.05),升高了基质金属蛋白酶2表达(P0.05),在加入5 000 U/mL乌司他丁后,细胞基质金属蛋白酶2表达降低,Ⅰ型胶原、骨钙素表达升高(P0.05)。骨水泥组无矿化结节,其他组均有矿化结节形成。结果表明乌司他丁对骨水泥诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞凋亡具有一定的抑制作用,可促进成骨细胞中Ⅰ型胶原、骨钙素的生成,并降低基质金属蛋白酶2的表达水平。     

葛根素干预小鼠成骨细胞分化相关特征性蛋白mRNA的表达

背景:研究证实葛根素对小鼠卵巢以及与睾丸切除所致骨质疏松具有很好的防治作用,但关于葛根素对成骨细胞分化的影响却少有报道。目的:观察葛根素对成骨细胞碱性磷酸酶mRNA、骨涎蛋白mRNA、骨桥蛋白mRNA以及骨钙素mRNA表达的影响情况。方法:体外培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞,随机分为3组。空白对照组仅更换培养基;葛根素组更换为含有葛根素1×10-6 mol/L培养基;雌二醇组更换为含有雌二醇1×10-7 mol/L培养基。RT-PCR法测定MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶、骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨钙素mRNA的表达结果与结论:葛根素和雌二醇能够延长碱性磷酸酶表达时间,在第12天达到高峰;葛根素和雌二醇在第10天和第12天能够增加骨涎蛋白mRNA的表达。葛根素和雌二醇在第5天和第12天能够减少骨桥蛋白的表达;葛根素和雌二醇在第10天和第12天能够增强骨钙素表达。结果表明葛根素能够通过影响成骨细胞分化相关特征性蛋白mRNA表达,促进成骨细胞的分化,可能是葛根素抗骨质疏松的重要的细胞分子机制之一。     

miR-132-3p过表达对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

文题释义： miRNA：是一类小的非编码RNA,长度约为22个核苷酸,其主要通过结合靶标mRNA的3'UTR区诱导靶标mRNA降解或抑制其翻译,从而在转录及转录后水平调控相关基因的表达。miRNA在细胞增殖、分化及凋亡等多种生物学活动过程中起着非常重要的调控作用,并且发现它是调控骨组织细胞增殖和分化过程的重要因子之一。 MC3T3-E1细胞：是新生C57BL/6小鼠颅顶骨中分离培养所建立的一株成骨细胞株,它能够展现骨组织中成骨细胞的各个发育阶段和各种生物学特性。作为研究成骨细胞增殖和分化的理想模型,被广泛应用于国内外各种骨组织工程学研究。 背景：机械牵引力能够影响MC3T3-E1细胞的增殖分化过程,并引起细胞内miR-132-3p的差异表达。然而,牵引力是否通过调控miR-132-3p的表达来影响成骨细胞增殖分化仍需进一步研究。 目的：明确12%牵引力作用下MC3T3-E1细胞中成骨分化标志因子及miR-132-3p表达变化,并进一步探讨miR-132-3p对细胞增殖分化的影响。 方法：MC3T3-E1细胞分别加载0%,12%牵张应力,检测应力加载后碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白及miR-132-3p mRNA的表达水平;细胞内瞬时转染miR-132-3p模拟物及其阴性对照,qRT-PCR检测转染后碱性磷酸酶、骨钙蛋白、Runt标志转录因子2 mRNA的表达,CCK-8法检测miR-132-3p对细胞增殖能力的影响。 结果与结论：①12%牵张应力作用下,MC3T3-E1细胞中碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白mRNA表达水平下调(P < 0.01),miR-132-3p表达水平显著升高(P < 0.05);②细胞内转染miR-132-3p后,miR-132-3p模拟物组成骨分化标志因子碱性磷酸酶、骨钙蛋白、Runt标志转录因子2 mRNA表达水平显著降低(P < 0.05);③相比于阴性对照组,miR-132-3p 模拟物转染24,48,72 h后细胞增殖能力明显降低(P < 0.001),且在转染48 h后降低最明显;④结果说明12%周期性循环牵张应力能够通过过表达miR-132-3p负向调节MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化。 ORCID: 0000-0003-0696-3329(孙芬) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

不同浓度骨碎补总黄酮复合可注射骨修复材料对MC3T3-E1成骨细胞作用的实验研究

目的本实验旨在观察中药骨碎补提取物骨碎补总黄酮(AFDR)复合海藻酸基可注射骨修复材料对成骨细胞MC3T3-E1体外培养的影响。方法将成骨细胞株MC3T3-E1随机分为空白对照组、单纯使用海藻酸基可注射骨修复材料组、AFDR0.04mg/L、0.16mg/L、0.64mg/L、1.28mg/L、5.12mg/L 7组,体外复合海藻酸基可注射骨修复材料,以24h和48h为观察时间点,倒置显微镜观察MC3T3-E1细胞形态,台盼蓝拒染法检测MC3T3-E1存活率,MTT法观察细胞增殖效应,碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素定量检测分别观察不同浓度骨碎补总黄酮促进MC3T3-E1分化作用,采用Von kossa钙化染色法观察其促MC3T3-E1细胞钙化作用。结果①倒置显微镜下观察复合海藻酸基可注射骨修复材料的MC3T3-E1细胞形态,细胞形态呈三角形、多边形、长梭形等,呈集落样生长,无接触抑制,有伪足伸出,胞液透亮,核圆形。AFDR各组不同程度促进成骨细胞的增殖、分化:7组能不同程度的促进成骨细胞的增殖、分化,与空白对照组比较,以0.16 mg/L和0.64mg/L剂量组的成骨细胞增殖数量最多,1.28mg/L,5.12mg/L的AFDR对细胞增殖作用不明显;②MC3T3-E1平均存活率≥90%;③骨碎补总黄酮(AFDR)0.16 mg/L和0.64mg/L剂量组在培养24小时和48小时,其OD值与空白对照组及组间均有显著性差异,可促进MC3T3-E1细胞增殖(P0.05和P0.01);④AFDR 0.16 mg/L和0.64mg/L剂量组能使MC3T3-E1的ALP活性升高(P0.05);⑤AFDR 0.64mg/L剂量组能促进MC3T3-E1骨钙素合成(P0.05);⑥AFDR 0.16 mg/L和0.64mg/L剂量组均可促进细胞钙化(P0.05)。结论 AFDR可显著促进在海藻酸基可注射骨修复材料上MC3T3-E1的增殖、分化和钙化,其作用具有时间依赖和剂量依赖关系。     

肿瘤坏死因子α干预小鼠成骨细胞cbfa1/runx2基因的表达

背景：肿瘤坏死因子α可降低牙周膜纤维细胞碱性磷酸酶的活性,抑制牙周膜纤维细胞向成骨细胞的功能转化。 目的：观察肿瘤坏死因子α对小鼠成骨细胞生长及cbfa1/runx2基因表达的影响。 方法：取生长良好的小鼠成骨细胞系MC3T3/E1细胞,分别以20,40,60,80 μg/L的肿瘤坏死因子α进行干预,以正常培养的细胞作为对照。采用RT-PCR法检测MC3T3/E1细胞cbfa1/runx2 mRNA的表达;PNPP法测定碱性磷酸酶活性;MTT法检测细胞活力。 结果与结论：正常培养的MC3T3/E1细胞cbfa1/runx2 mRNA呈阳性表达,随着肿瘤坏死因子α浓度的增高,其表达水平逐渐下降。同时MC3T3/E1细胞活力和碱性磷酸酶活性也随肿瘤坏死因子α浓度的增高而下降。提示肿瘤坏死因子α可抑制MC3T3/E1细胞生长,而cbfa1/runx2可能参与了成骨细胞的分化过程。     

聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响

背景:研究表明聚乳酸/羟基磷灰石复合材料与自然骨结构和性能相似,具有骨传导性和良好的生物相容性。目的:观察聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物与成骨细胞株MC3T3-E1的生物相容性。方法:分别采用普通完全培养基(对照组)与聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物浸提液(实验组)培养第3代成骨细胞株MC3T3-E1,培养3,5,7 d,采用CCK-8法检测细胞的吸光度值;在培养第7,14天检测细胞碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原、核心结合因子α1/成骨特异性转录因子表达。将聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物与第3代成骨细胞株MC3T3-E1共培养,培养7,14 d细胞骨架染色及扫描电镜观察细胞在支架材料上的形态。结果与结论:随着时间的延长,成骨细胞株MC3T3-E1的吸光度值明显增加,两组细胞吸光度值比较差异无显著性意义。实验组培养第7天细胞碱性磷酸酶活性高于对照组(P0.05),培养第14天细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、核心结合因子α1/成骨特异性转录因子表达高于对照组(P0.05)。种植7 d后细胞在材料上贴附生长,细胞呈多角形;种植14 d后细胞较7 d前数目明显增多,且完全伸展,呈多角形和梭形。表明聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物对成骨细胞有良好的生物相容性,无细胞毒性。     

骨形态发生蛋白2诱导C2C12和MC3T3-E1的成骨分化与自噬

背景：一系列研究表明自噬与分化有密切联系;骨形态发生蛋白2是诱导C2C12、MC3T3-E1成骨分化经典途径,是研究成骨分化过程的理想模型。 目的：观察自噬与骨形态发生蛋白2诱导细胞株C2C12、MC3T3-E1成骨分化的关系。 方法：Real-Time PCR检测MC3T3-E1与C2C12在骨形态发生蛋白2(100 μg/L)诱导培养3 d后成骨与自噬相关指标变化。碱性磷酸酶染色检测不同浓度3-甲基腺嘌呤(0,1,5,10 mmol/L)对骨形态发生蛋白2(100 μg/L)诱导培养7 d MC3T3-E1与C2C12成骨指标碱性磷酸酶变化,Western Blot检测C2C12和MC3T3-E1在骨形态发生蛋白2(100 μg/L)诱导不同时间点(0,12,24,48,72,96 h)LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表达水平。 结果与结论：在骨形态发生蛋白2诱导细胞株C2C12、MC3T3-E1成骨分化过程中,诱导自噬相关mRNA与蛋白水平均有增高趋势,且自噬相关蛋白LC3水平增高与时间相关。同时,抑制自噬成骨分化过程中碱性磷酸酶表达水平降低。因此,自噬与骨形态发生蛋白2诱导细胞株C2C12、MC3T3-E1成骨分化过程有密切关系。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

Influence of multilayer rhBMP-2 DNA coating on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells seeded on roughed titanium surface

For bone morphogenetic protein (BMP) gene therapy to be a viable approach for enhancing implant osseointegration clinically, requires the development of efficient nonviral delivery vectors that can coat the implant. This study evaluated a multilayer cationic liposome-DNA complex (LDc) coating as a delivery vehicle for recombinant human BMP-2 (rhBMP-2). Multilayered coatings, comprising hyaluronic acid (HA) and LDc, were fabricated onto titanium using a layer-by-layer (LBL) assembly technique. Preosteoblastic MC3T3-E1 cells were cultured on the roughened titanium surfaces coated with multilayers of HA/LDc, or on uncoated or HA/liposome only surfaces as controls. The amount of rhBMP-2 secreted by the MC3T3-E1 cells and the effect of the various surfaces on cell viability, proliferation, alkaline phosphatase (ALP) activity, osteocalcin (OC) secretion, and calcium deposition were evaluated. Messenger RNA levels of OC, ALP, Runx2, and Osx were also investigated. The results demonstrated that rhBMP-2 protein secreted into culture medium at 3 days was significantly higher than control groups. MC3T3-E1 cells cultured on the HA/LDc coating displayed significantly higher ALP activity and OC secretion at 7 days and 14 days culture, respectively. MC3T3-E1 cells cultured on HA/LDc upregulated expression of the osteoblast differentiation markers, especially on days 12 for OC and on days 6 and 12 for ALP and Osx. In conclusion, MC3T3-E1 cell cultured on the multilayer HA/LDc coating surface can secret rhBMP-2 protein and the protein levels were effective in inducing early osteogenic differentiation. ? 2012 Wiley Periodicals, Inc. J Biomed Mater Res Part A 100A: 2766-2774, 2012.     

miR-199a-3p 通过靶向 CABLES-1 调控流体剪切力介导的成骨细胞增殖

目的 探讨miR-199a-3p在流体剪切力(fluid shear stress, FSS)诱导成骨细胞增殖中的作用及其可能的分子机制。方法 对成骨细胞MC3T3-E1加载1.2 Pa FSS,时间分别为0、15、30、45、60、75、90 min。使用miR-199a-3p模拟物或miR-199a-3p抑制物转染MC3T3-E1细胞。使用将过表达的miR-199a-3p以及其阴性对照分别转染MC3T3-E1细胞,并以1.2 Pa FSS处理45 min。将pcDNA NC、pcDNA-CABLES-1、si RNA NC、si RNA CABLES-1转染至MC3T3-E1细胞中。分别共转染pc DNA-CABLES-1与miR-199a-3p mimic以及si RNA-CABLES-1与miR-199a-3p inhibitor。CCK-8实验检测细胞活性;RT-qPCR检测CABLES-1、 miR-199a-3p、CDK 6、Cyclin D1、PCNA表达水平;荧光素酶报告实验检测CABLES-1和miR-199a-3p的靶向关系。免疫荧光检测CABLES-1蛋白表达。...     

Dlx2基因过表达与前成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化过程中的细胞凋亡和周期调控*****◆

背景：Dlx2基因在颅神经嵴细胞迁徙进入第一鳃弓过程和颅颌面骨骼发育中起重要作用,但Dlx2基因对成骨细胞分化过程中细胞凋亡和细胞周期调控的影响尚未见报道。 目的：观察Dlx2基因过表达对前成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化过程中细胞凋亡和细胞周期调控的影响。 方法：构建反转录病毒pMSCV-puro-Dlx2并转染矿化诱导液培养下的MC3T3-E1细胞,构建稳定过表达Dlx2基因的细胞系MC3T3-E1-Dlx2。RT-PCR和Western blot验证Dlx2基因过表达细胞系的建立。Annexin V/PI双染色后流式细胞分选检测细胞凋亡,PI/RNase双染色后流式细胞分选检测细胞周期变化。 结果与结论：实验成功构建稳定过表达Dlx2基因的细胞系MC3T3-E1-Dlx2。发现Dlx2基因过表达促进细胞凋亡(P < 0.05),同时阻滞细胞周期于G1/G0期(P < 0.05),减低细胞增殖性,促进细胞分化行使功能。 关键词：成骨细胞分化;Dlx2基因;稳定过表达;细胞凋亡;细胞周期 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.022     

人洗涤血小板促进成骨细胞增殖与前列腺素E2的作用

背景：对于富血小板血浆促进组织再生的理想血小板浓度、哪些成分担当重要作用以及通过何种机制发挥作用等基础问题目前还不是很清楚。 目的：观察洗涤血小板对小鼠成骨细胞株——MC3T3-E1的增殖及其产生前列腺素E2作用的相关性。 方法：将从健康成人男性志愿者身上采集并制备的洗涤血小板经反复液氮冻溶后作用于小鼠成骨细胞株MC3T3-E1,分别加入体积分数5%-15%的洗涤血小板、富血小板血浆、乏血小板血浆或和其他样品(消炎痛、肿瘤坏死因子α和转化生长因子β抑制剂SB431542)培养。采用细胞和前列腺素E2测定试剂盒测定细胞增殖与前列腺素E2的生成量,采用RT-PCR测定环氧酶2 mRNA的表达。 结果与结论：体积分数5%洗涤血小板作用于MC3T3-E1细胞1 h后开始表达环氧酶2 mRNA、并诱导产生前列腺素E2,作用3 h时环氧酶2 mRNA的表达达到峰值,而前列腺素E2的产生量在作用后6 h达到峰值(40.5 μg/L)。随着体积分数的升高,洗涤血小板对MC3T3-E1细胞增殖的促进作用逐渐降低,并且当其体积分数达到15%时呈现对MC3T3-E1细胞增殖的显著抑制作用,而洗涤血小板对MC3T3-E1细胞产生前列腺素E2的作用随着其浓度的倍比增加而显著增强。添加消炎痛会明显抑制5%洗涤血小板对MC3T3-E1细胞增殖及前列腺素E2产生的促进作用,而添加肿瘤坏死因子α(100 μg/L)则会明显增大洗涤血小板对MC3T3-E1细胞产生前列腺素E2的促进作用。另外,SB431542(15 μmol/L)可明显抑制体积分数5%的洗涤血小板对MC3T3-E1细胞增殖及前列腺素E2产生的促进作用。提示洗涤血小板促进MC3T3-E1增殖与其诱导该细胞生成前列腺素E2有密切的相关性。     

Lipopolysaccharide (LPS) Induces the Apoptosis and Inhibits Osteoblast Differentiation Through JNK Pathway in MC3T3-E1 Cells

Bone degradation is a serious complication of chronic inflammatory diseases such as septic arthritis, osteomyelitis, and infected orthopedic implant failure. Up to date, effective therapeutic treatments for bacteria-caused bone destruction are limited. In our previous study, we found that LPS promoted osteoclast differentiation and activity through activation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) pathway such as c-Jun N-terminal kinases (JNK) and extracellular signal regulated kinase (ERK1/2). The current study was to evaluate the mechanism of LPS on the apoptosis and osteoblast differentiation in MC3T3-E1 cells. MC3T3-E1 osteoblasts were non-treated, treated with LPS. After treatment, the cell viability, the activity of alkaline phosphatase (ALP) and caspase-3 were measured. The expressions of osteoblast-specific genes and Bax, Bcl-2, and caspase-3 were determined by real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Protein levels of Bax, Bcl-2, caspase-3, and phosphorylation of MAPKs were measured using Western blotting assays. The MAPK signaling pathway was blocked by pretreatment with JNK inhibitor SP600125. LPS treatment induced a significant decrease in cell metabolism, viability, and ALP activity in MC3T3-E1 cells. LPS also significantly decreased mRNA expressions of osteoblast-related genes in MC3T3-E1 cells. On the other hand, LPS significantly upregulated mRNA expressions and protein levels of Bax and caspase-3 as well as activation of caspase-3, whereas decreased Bcl-2 expression in MC3T3-E1 cells. Furthermore, LPS significantly promoted MAPK pathway including the phosphorylation of JNK and the phosphorylation of ERK1/2; moreover, pretreatment with JNK inhibitor not only attenuated both of phosphorylation-JNK and ERK1/2 enhanced by LPS in MC3T3-E1 cells, but also reversed the downregulated expressions of osteoblast-specific genes including ALP and BSP induced by LPS. In conclusion, LPS could induce osteoblast apoptosis and inhibit osteoblast differentiation via activation of JNK pathway.     

Hydroxyapatite accelerates differentiation and suppresses growth of MC3T3-E1 osteoblasts

Hydroxyapatite describes both the natural mineral phase of bone as well as the widely used calcium-phosphate implant substitute. Given that hydroxyapatite is a major component of the in vivo surface with which osteoblasts interact, it is surprising that most studies examining the regulation of osteoblast growth and differentiation utilize plastic surfaces. Here we demonstrate that the phenotype of mouse MC3T3-E1 osteoblasts is significantly altered on hydroxyapatite compared with plastic surfaces. Specifically, alkaline phosphatase activity and messenger RNA levels, markers of early stages of osteoblast differentiation, are increased in osteoblasts cultured on hydroxyapatite. The precocious appearance of alkaline phosphatase activity on the hydroxyapatite surface suggests that osteoblast differentiation is activated earlier compared with plastic surfaces. Osteocalcin expression, a marker of late-stage differentiation, is also increased on hydroxyapatite and further demonstrates enhanced differentiation. Cell counts indicate that fewer osteoblasts are present on hydroxyapatite versus plastic surfaces 24 h after plating. Measurement of osteoblast attachment, apoptosis, and necrosis indicated no differences between surfaces. In contrast, the number of bromodeoxyuridine-incorporating cells was significantly decreased on hydroxyapatite compared with plastic surfaces. Taken together, our findings indicate that hydroxyapatite enhances osteoblast differentiation while also suppressing growth.     

焦亡介导高糖引起的小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1炎症与损伤

目的:探讨细胞焦亡(pyroptosis)能否介导高糖(HG;45 mmol/L葡萄糖)引起的小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1炎症和损伤。方法:应用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测成骨细胞活力;Western blot测定成骨细胞的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)和胱天蛋白酶1(CASP1)的表达水平;ELISA法测定细胞培养上清液中白细胞介素18(IL-18)和IL-1β的水平;2',7'-二氯二氢荧光素二乙酯染色荧光显微镜照相法检测胞内活性氧(ROS)水平;罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位(MMP)水平;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定成骨细胞早期标志物ALP的活性;茜素红染色观察成骨细胞晚期标志物矿化结节的形成。结果:HG处理MC3T3-E1细胞24 h可明显促进NLRP3和CASP1的表达,引起IL-18和IL-1β的分泌增多,同时可使细胞活力降低,ROS生成和MMP丢失增加,成骨细胞分化与矿化功能下降(表现为ALP活性降低和矿化结节数量减少)。利用siRNA沉默CASP1表达可显著减轻HG引起的上述成骨细胞炎症和损伤。结论:焦亡可介导HG引起的MC3T3-E1细胞炎症和损伤。