hLMO4基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建hLMO4真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法提取人乳腺癌MCF-7细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hLMO4全长编码基因,亚克隆至pCDNA3.1-myc-hisA表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞BGC823中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位。结果hLMO4全长基因序列克隆到了真核表达载体pCDNA3.1-myc-hisA中,酶切鉴定片段为500bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为23KD。pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位以细胞核为主,在细胞浆内少量表达。结论成功的构建了hLMO4全长基因真核表达载体,pEGFP-LMO4蛋白定位于乳腺癌细胞质和核内。     

DDX5通过上皮-间质转化促进人乳腺癌细胞侵袭

目的 探究DEAD box RNA解旋酶-5(DEAD-box helicase 5, DDX5)蛋白对乳腺癌MCF-7细胞侵袭转移作用的影响及其机制。方法 利用慢病毒感染法，构建过表达Flag-DDX5的人乳腺癌MCF-7稳转细胞系，划痕实验和Transwell实验检测DDX5蛋白过表达后对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响；Western blot实验检测上皮-间质转化(EMT)标志物上皮-钙黏蛋白(E-cadherin),纤维连接蛋白(Fibronectin),波形蛋白(Vimentin)的表达。结果 成功构建了稳定过表达DDX5的乳腺癌MCF-7稳转细胞系；DDX5蛋白过表达后，乳腺癌细胞迁移和侵袭能力明显增强，乳腺癌细胞E-cadherin的表达明显下调，Fibronectin与Vimentin的表达明显上调。结论 DDX5可能参与乳腺肿瘤细胞EMT过程，促进乳腺癌的恶性转移，进而影响乳腺癌的进程。     

F-box结构域参与FBXO39蛋白对MCF-7细胞增殖的调控

目的:探讨F-box结构域对FBXO39蛋白调控MCF-7细胞增殖的影响。方法:以MCF-7细胞cDNA文库为模板,采用PCR方法扩增FBXO39基因的全长cDNA序列并克隆到真核表达载体pEGFP-C2;以pEGFP-FBXO39质粒为模板,构建pEGFP-FBXO39ΔF(F-box结构域缺失)质粒;将重组质粒转染MCF-7细胞后,Western blot验证FBXO39和FBXO39ΔF的表达水平;激光共聚焦显微镜观察FBXO39和FBXO39ΔF的亚细胞定位情况;免疫荧光检测内源性FBXO39在MCF-7细胞中的定位。MTT和EdU试剂盒检测MCF-7细胞的增殖情况;流式细胞术检测MCF-7细胞周期;免疫组化检测FBXO39在乳腺癌及其癌旁组织中的表达差异。结果:本研究成功构建了pEGFP-FBXO39和pEGFP-FBXO39ΔF真核表达载体。F-box结构域对FBXO39蛋白的细胞定位没有影响。FBXO39促进了MCF-7细胞的增殖,而FBXO39ΔF对MCF-7细胞增殖无明显影响。FBXO39高表达于乳腺癌组织。结论:F-box结构域对FBXO39蛋白的细胞定位没有产生明显影响,但对维持FBXO39的生物学作用至关重要。FBXO39可能与乳腺癌的发生相关。     

CARMA3过表达促进乳腺肿瘤细胞生长

目的构建人CARMA3真核表达载体,探讨其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达及其与肿瘤发生发展的关系。方法以T7-CARMA3为模版,利用特异PCR引物扩增CARMA3基因全长编码序列,将其定向克隆至TMp3×FLAG-cmv-10载体,融合蛋白表达载体命名为Flag-CARMA3。将Flag-CARMA3转染到MCF-7乳腺癌细胞系中,Western blot和Real-Time PCR法检测基因和蛋白表达。MTT检测过表达Flag-CARMA3的细胞生长能力。结果成功构建Flag-CARMA3真核表达载体,Flag-CARMA3融合基因和蛋白在MCF-7乳腺癌细胞系中表达。MTT实验证实Flag-CARMA3过表达增强MCF-7乳腺癌细胞生长能力。结论 CARMA3促进乳腺肿瘤细胞生长。     

不同分子亚型乳腺癌细胞系中RUNX3蛋白表达及定位研究

目的:检测人类Runt相关转录因子3(RUNX3)在不同分子亚型乳腺癌细胞系中的表达及其亚细胞定位情况,为进一步揭示RUNX3的失活机制和发现新的治疗靶点提供理论依据。方法:在5种乳腺癌细胞(MCF-7、T47D、SKBR-3、MDA-MB-231和BT-549)及正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)中,通过Western blot和免疫荧光实验检测RUNX3的蛋白表达和亚细胞定位情况;采用来普霉素B(Leptomycin B)抑制RUNX3的出核,利用CCK-8法检测细胞活力的改变,EdU染色检测细胞增殖情况,Western blot和免疫荧光实验检测RUNX3的蛋白表达和亚细胞定位的改变。结果:与MCF-10A细胞相比,5种乳腺癌细胞系中RUNX3的核定位减少、胞浆定位增多。经Leptomycin B处理后,CCK-8实验结果显示5种乳腺癌细胞的活力明显减弱,EdU染色显示5种乳腺癌细胞增殖能力明显降低,Western blot和免疫荧光实验显示5种乳腺癌细胞胞浆中的RUNX3蛋白表达量明显降低、胞核中的RUNX3蛋白表达量明显增多(P0.05)。结论:不同分子亚型乳腺癌细胞中均存在RUNX3的胞浆转位失活现象,针对性地逆转RUNX3的出核过程可以明显降低肿瘤细胞的活力和增殖能力,可能成为乳腺癌潜在的治疗靶点。     

hBPI与EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在MCF-7细胞中的表达和定位

目的：探讨人细菌透性增加蛋白（hBPI）在哺乳细胞中的表达和亚细胞定位。方法：以本人克隆得到的质粒pBE1为模板，利用一对带有Kozak序列以及删除终止密码子的引物进行PCR，获得的产物与pEGFP-N1载体连接，构建pBE2哺乳细胞特异表达载体并稳定转染MCF-7细胞，获得了转基因细胞系。提取其基因组DNA，PCR扩增检查BPIcDNA片段和EGFP片段是否已整合入MCF-7细胞基因组中。提取总RNA，通过RT—PCR方法检查BPI-EGFP在转录水平的表达。Western blot进一步鉴定融合蛋白的表达定位。结果：荧光显微镜观察显示，BPI—EGFP融合蛋白分布在整个细胞质中，并且在核膜周围有高表达。PCR扩增证实了BPIcDNA片段和EGFP片段已整合人MCF-7细胞基因组中。RT—PCR证明了hBPI和EGFP的融合蛋白在MCF-7细胞中在转录水平的表达。Western blot分析显示hBPI-EGFP以定位于细胞质和分泌到MCF-7细胞外两种形式表达。结论：hBPI-EGFP融合蛋白与天然的嗜中性的多核粒细胞中的定位和转运特点是一致的。     

CISD2在乳腺癌组织中的表达及其对人乳腺癌MCF-7细胞增殖与侵袭的影响

目的检测CDGSH铁硫结构域2 (CDGSH iron sulfur domain 2, CISD2)在乳腺癌组织中的表达及其对人乳腺癌MCF-7细胞增殖与侵袭的影响。方法选取46乳腺癌组织及10例对应的癌旁正常组织,免疫组织化学方法与Western blot方法检测乳腺癌和癌旁组织中CISD2蛋白的表达。应用化学合成小干扰RNA技术沉默人乳腺癌MCF-7细胞中CISD2基因的表达,Western blot实验验证基因沉默效率。采用CCK-8和克隆形成实验检测转染后MCF-7细胞的增殖和侵袭情况。结果与癌旁正常组织相比,乳腺癌组织中CISD2蛋白表达的平均光密度值明显上调, siRNA能够明显抑制人乳腺癌MCF-7细胞CISD2的表达。CISD2基因沉默后,人乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力和侵袭能力显著降低,P0.01。结论 CISD2可能是治疗乳腺癌的潜在靶点。     

稳定表达人巨细胞病毒蛋白pUL23细胞系建立及其功能研究

目的:建立稳定表达人巨细胞病毒UL23基因的HELF细胞系,研究病毒蛋白在宿主细胞内行为,为进一步研究人巨细胞病毒蛋白pUL23的功能提供依据。方法:通过PCR技术从人巨细胞病毒基因组中扩增出UL23基因,通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-N1-FLAG-UL23。将该载体导入Am-phoPackTM-293细胞,收获重组逆转录病毒,然后感染HELF细胞,HELF经持续G418抗性筛选后获得稳定表达UL23基因的细胞系。采用激光共聚焦显微镜观察病毒蛋白在细胞内的定位。结果:RT-PCR、Western blotting结果证实病毒基因UL23能够整合到宿主细胞基因组中,并能在宿主细胞中稳定表达病毒蛋白。共聚焦显微镜观察到病毒蛋白pUL23定位于细胞质,处于细胞核周边。结论:利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术,成功构建了稳定表达UL23基因的转基因细胞系。该病毒蛋白在宿主细胞质中的定位,提示病毒蛋白发挥功能的空间位于细胞核周边,有利地推进了人巨细胞病毒蛋白pUL23功能研究的进程。     

人脂肪酸合成酶启动子在乳腺癌细胞中的转录活性分析

目的分析人脂肪酸合成酶（FAS）启动子在乳腺癌细胞中的转录活性,并与cerbB2启动子、midkine启动子相比较,为其乳腺癌靶向基因治疗提供依据。方法Western blot和间接免疫荧光法检测FAS蛋白在3种人乳腺癌细胞系SKBR3、MCF-7、MDA-MB-231以及正常成纤维细胞系NIH3T3中的表达。构建pGL3-FAS、pGL3-cerbB2和pGL3-midkine荧光素酶表达载体,并分析其在SKBR3、MCF-7、MDA-MB-231和NIH3T3细胞系中的相对转录活性。结果FAS蛋白在3种乳腺癌细胞系中均有表达,其中在SKBR3细胞中表达量最高,在MDA-MB-231细胞中表达量最低,而在正常成纤维细胞系NIH3T3中不表达。FAS蛋白主要定位于细胞质。FAS启动子在3种乳腺癌细胞系中均具有较强的转录活性,转录活性明显高于强启动子SV40和肿瘤特异性启动子midkine;而在正常成纤维细胞中,转录活性很低。FAS启动子在cerbB2高表达的SKBR3细胞中转录活性最高,与cerbB2启动子相当;在cerbB2表达较弱的MCF-7和MDA-MB-231细胞中的转录活性则明显高于cerbB2启动子。结论FAS启动子在乳腺癌细胞中具有强转录活性,较cerbB2启动子作用范围更广,较midkine启动子转录活性更高,而在正常细胞中转录活性很低,具有良好的乳腺癌靶向性,可作为乳腺癌广谱基因治疗的靶向工具。     

PI3K/AKT信号通路的抑制促进B7-H4分子的核转移

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路对负性共刺激分子B7-H4细胞定位的调控作用。方法体外培养稳定转染B7-H4/HEK293细胞,采用PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002和/或出核转运抑制剂来普霉素B(LMB)处理细胞之后,免疫荧光技术结合激光共聚焦显微镜检测B7-H4蛋白在B7-H4/HEK293细胞中亚细胞定位的变化;Western blot法检测B7-H4蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核表达水平的变化。结果激光共聚焦显微镜观察结果显示,PI3K抑制剂LY294002作用于B7-H4稳定转染的B7-H4/HEK293细胞后,与空白对照组相比,B7-H4发生核转移,加入出核转运抑制剂LMB后,核转移的程度显著增加;Western blot法结果显示,LY294002抑制PI3K/AKT信号通路活性24 h后,B7-H4在细胞膜和细胞质中的定位均显著降低(P0.05),而细胞核中B7-H4的定位显著增加(P0.05)。结论 PI3K/AKT信号通路可抑制B7-H4的核转移。