RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白原核表达、纯化及鉴定

目的构建RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法利用重叠延伸PCR获得目的融合基因片段RGD-r SAK-α1M,插入带有His-GST标签的原核高效可溶性表达载体PEGX-6P-1中。经酶切鉴定后,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,经Ni+亲和层析柱纯化后用3C蛋白酶切除重组蛋白的His-GST标签,再利用DEAE离子交换柱和分子筛纯化蛋白。最后应用纤维蛋白平板溶圈法和血小板聚集抑制试验分别测定评价重组融合蛋白的溶栓活性和抗血小板聚集作用。结果 1)成功构建了RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白。2)实现了目的融合蛋白在大肠杆菌上清液中的高效表达,并纯化了融合蛋白。3)体外实验表明纯化后的融合蛋白纤溶活性同尿激酶标准品无明显差异。4)融合蛋白抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶明显提高。结论经文献检索确认为首次获得了纯化的RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白,并验证了其纤溶活性和尿激酶标准品无明显差异,而抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶增强,为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。     

截短型BAP31/GST基因重组质粒的构建及融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的构建编码截短型肿瘤抗原BAP31(△BAP31)与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白(△BAP31/GST)进行纯化和初步鉴定。方法 PCR扩增编码△BAP31的基因片段,上下游分别引入EcoR I及Xho I酶切位点,亚克隆至含有GST标签的原核表达载体pGEX4T-1中,构建重组表达载体pGEX4T1-△BAP31,将该载体转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达△BAP31/GST,用GST亲和层析分离纯化原核表达的△BAP31/GST,表达产物分别用SDS-PAGE和West-ern blot进行鉴定。结果重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定和IPTG诱导表达△BAP31/GST的SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为40 000,与理论值相符,并主要以可溶性蛋白形式存在;经过对融合蛋白表达条件的优化,在IPTG浓度为1 mmol/L,诱导6 h目的蛋白表达量最高;灰度扫描分析发现,融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的70.6%,纯化产物的纯度最高可达94.5%,Western blot证实该△BAP31/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应,分子量为△BAP31与GST分子量之和,提示为融合蛋白。结论成功构建了编码△BAP31基因原核表达载体pGEX4T1-△BAP31,利用大肠杆菌表达系统和GST亲和层析,获得了较高纯度的△BAP31/GST融合蛋白,为进一步研究肿瘤抗原BAP31的功能及开发以BAP31作为靶点的肿瘤疫苗提供了试验基础。     

抗重组GST单克隆抗体的制备及其在融合蛋白纯化中的应用

目的 制备抗重组GST的单克隆抗体（mAb),并用来纯化重组GST融合蛋白,方法 用含重组GST融合蛋白基因的pGEX4T-1质粒转化E.coliBL21,IPTG诱导GST融合蛋白表达,亲和层析和凝胶过滤法分离表达的重组GST融合蛋白,以此蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠,按传统的杂交瘤技术制备mAb。将抗GSTmAb经ProteinA纯化后,与Sepharose4B偶联。结果 经3次亚克隆后,获得两株分泌抗GST载体特异性mAb的杂交瘤,采用该mAb对两种不同的GST融合蛋白进行亲和层析纯化后,经SDS-PAGE鉴定达到了商品化Glutathione-Resin的亲和层析纯化效果。结论 用抗GST蛋白特异性mAb亲和层析纯化融合蛋白是一种经济、实用的方法,且可用于Glutathione-Resin亲和层析纯化后的二次纯化。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB活性片段的克隆、表达及抗原免疫保护性初步研究

目的探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)抗原IsdB活性片段(IsdB2)免疫保护作用。方法利用生物信息学技术预测分析出IsdB活性片段(IsdB2),PCR扩增编码IsdB2的基因片段,亚克隆至GST标签融合表达的原核表达载体pGEX-6P-2中,将载体转化入大肠杆菌XL-1 blue,通过IPTG诱导表达IsdB2/GST融合蛋白,利用GST亲和层析初步纯化获取IsdB2蛋白。用IsdB2蛋白抗原辅以氢氧化铝佐剂对小鼠进行免疫实验,统计小鼠存活率对IsdB2抗原的免疫性进行初步研究。结果重组质粒经过BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定、核酸序列测定和IPTG诱导表达IsdB2/GST及酶切获取IsdB2蛋白的SDS-PAGE分析表明,IsdB2蛋白相对分子质量大小约72 000,GST标签相对分子质量大小约26 000,与预期相符合。用IsdB2蛋白对小鼠进行3次疫苗免疫实验,IsdB2对小鼠的保护率分别为84.6%、50%和60%。结论成功构建重组表达载体pGEX-6P-2-IsdB2,利用大肠杆菌表达系统、GST亲和层析和酶切方法获得IsdB2蛋白抗原,通过3次动物疫苗免疫实验结果表明IsdB2具有免疫保护性,为研制新型有效的MRSA疫苗奠定实验基础。     

人survivin蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的 构建人肿瘤抗原survivin的原核表达载体,优化在大肠杆菌中的表达条件,并对survivin/His融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定.方法 设计针对survivin基因序列的特异引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人survivin全长基因序列(538 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28 a-survivin,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达survivin/His融合蛋白,并采用Ni亲和层析凝胶纯化重组蛋白.纯化后的重组蛋白经Western blot法、ELISA鉴定其抗原活性.结果 重组表达载体经BamH Ⅰ和HindⅢ鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)24000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90％.Western blot法和ELISA检测证实纯化的survivin蛋白能够与特异性抗体发生反应,表明其具有良好的抗原活性.结论 成功构建了原核表达载体pET28 a-survivin,利用大肠杆菌表达系统实现了融合蛋白的可溶性表达并进行纯化,纯化后survivin蛋白经鉴定具备较高的抗原活性.     

无融合标签人胱抑素C重组蛋白的制备

目的构建人胱抑素C(CysC)基因的原核表达质粒pCold TF-CysC,表达并制备去标签蛋白的CysC。方法用人CysC的全长编码基因插入原核表达载体pCold TF并测序鉴定。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导、镍柱纯化后获得带有His标签的重组蛋白TF-CysC。利用GST-HRV 3C蛋白酶去除该融合蛋白的TF标签,再经分子筛一步法同时去除TF标签、3C蛋白酶获得CysC,SDS-PAGE鉴定其纯度。用该CysC免疫新西兰大白兔,制备抗血清,并用间接ELISA及Western blot鉴定。结果测序结果与Genbank中人CysC序列一致,实现了CysC可溶性高表达。纯化的无标签CysC纯度大于95%,分子质量约为13.3 ku,与预期相符。免疫家兔后,获得的抗血清效价达到1∶4×106以上,能特异性识别市售CysC蛋白。该蛋白稳定性良好,在4℃保存一个月未见明显下降。结论成功应用原核表达系统,获得了可用作免疫诊断试剂标准品的CysC,为进一步建立CysC的免疫检测方法奠定了基础。     

VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达、纯化及鉴定

目的: 构建人血管内皮细胞生长因子II型受体(VEGFR2)胞膜外区第三及第四个免疫球蛋白样结构域与GST融合蛋白VEGFR2 D3.4/GST基因的原核表达载体, 在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白.方法: 由公司合成VEGFR2胞膜外区第三、第四免疫球蛋白样结构域氨基酸的编码序列, 克隆入原核表达载体pGEX-4T1中GST标签的下游, 构建重组表达载体pGEX4T-VEGFR2D3.4, 将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3) pLysS, IPTG诱导表达VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白, 经不同浓度尿素洗脱纯化后, 表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果: SDS-PAGE分析表明, 表达产物的相对分子质量(Mr)为46 000, 与理论值相符, 主要以包含体形式存在; 灰度扫描分析融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38.6%, 纯化产物纯度最高为87.1%, Western blot 证实该蛋白为VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白.结论: 利用大肠杆菌表达系统, 获得了较高纯度的包含体形式VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白.     

人源抗狂犬病毒二硫键稳定抗体在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌pMAL-P2x系统中表达anti-rabiesMBP-ScdsFv融合蛋白,酶切获得目的蛋白ScdsFv,进行纯化、鉴定及简单活性分析。方法利用DNA重组技术,将全长的ScdsFv蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-p2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coliER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Xa酶切后,经Ni柱、AmyloseResin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和Western blot对其进行鉴定,ELISA检测其结合活性。结果成功地构建了重组质粒pMAL-ScdsFv,经诱导表达、蛋白酶切、亲和纯化后获得目的蛋白。ELISA检测其具有抗原特异结合活性,其热稳定性有显著提高。结论抗狂犬病毒ScdsFv蛋白具有良好的结合活性和生物学活性稳定性,可作为候选分子用于狂犬病的防治研究。     

利用SUMO系统高效可溶性表达重组人TNF-a

目的:从人淋巴细胞中克隆人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)基因,构建原核表达载体,通过表达、纯化,获得具有生物学活性的hTNF-α,为深入研究和利用hTNF-α奠定基础.方法:利用RT-PCR方法从人淋巴细胞中克隆hTNF-α基因,并分别插入到pGEX-6P-1的GST标签和pHisSUMOexpression 的SUMO(small ubiquitin-like modifier)标签下游构建成重组表达载体pGEX-6P-1-hTNF,和pHisSUMO-hTNF-a.将两种载体分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3),比较两种载体hTNF-α表达量及可溶性的差异.选择表达效果较好的重组载体对hTNF-α进行诱导表达,经纯化并切去融合标签后获得成熟hTNF-α蛋白.以1929细胞为靶细胞,利用MTT比色法检测其细胞毒活性.结果:克隆得到hTNF-α编码基因,利用pGEX-6P-1载体表达的GST-hTNF-α融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的27%,主要以包涵体形式表达,经低温诱导后可溶性提高了约50%,但表达量有所降低.而利用pHisSUMO-expression表达的SUMO-hTNF-α融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的30%以上,且主要以可溶形式存在.本实验中选择SUMO系统表达hTNF-α,纯化后成熟蛋白纯化产物纯度达98%以上.活性测定结果表明,获得的成熟hTNF-α对1929的细胞毒活性为5.01×108U/mg.结论:与GST标签相比,SUMO利于hTNF-α的可溶性表达.经过纯化并切去融合标签后获得了纯度较高的具有生物学活性的hTNF-α蛋白.     

人钾离子通道调节蛋白的原核表达及纯化

目的:探讨人钾离子通道调节蛋白(KCNRG)的原核表达体系和纯化条件,为该蛋白的功能机制研究提供工具。方法:以pc DNA3. 1-KCNRG-2ex重组质粒为模板,采用特异引物扩增KCNRG基因编码区。PCR产物双酶切后克隆入p ET28a-MBP-His和p GEX-4T-1载体中。重组的p ET28a-KCNRG-MBP-His和p GEX-4T-1-KCNRG质粒转化Top10感受态细胞。鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化Rosetta(DE3)蛋白表达菌株,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western blot检测重组融合蛋白的表达。结果:PCR扩增产物长度为819 bp。经双酶切和测序,鉴定重组质粒p ET28a-KCNRG-MBP-His和p GEX-4T-1-KCNRG构建成功。SDS-PAGE检测,KCNRG-MBP融合蛋白在菌液的上清中表达,KCNRG-GST融合蛋白主要以包涵体形式表达。Western blot检测,重组KCNRG-MBP蛋白和重组KCNRG-GST蛋白分别能被抗6×His抗体和抗GST抗体识别。经镍柱亲和层析纯化,获得纯化的KCNRG-MBP融合蛋白(凝胶成像系统软件分析纯化蛋白的纯度90%)。结论:成功构建重组质粒p ET28a-KCNRG-MBP-His,并实现KCNRG-MBP融合蛋白的可溶性原核表达。