大鼠TCR Vβ8.2基因真核表达质粒的构建及表达

目的：构建含大鼠TCR Vβ8．2基因的重组真核表达质粒，并检测其在体内外的表达。方法：以RT-PCR法分离Lewis大鼠脾淋巴细胞中的TCR Vβ8．2基因片段，插入到真核表达载体pTARGET中，构建重组表达载体pTARGET-TCR Vβ8．2，并转化E．coli JM109，经蓝白斑筛选阳性菌落，进行菌落PCR和测序鉴定。将重组质粒以肌注法免疫BALB／c小鼠，采集注射部位股四头肌处的肌肉，用RT-PCR及免疫组化染色法检测TCRVB8．2基因在注射部位的转录和表达：通过脂质体介导，将再组质粒导入COS-7细胞中进行瞬时表达，用免疫细胞化学染色法检测靶基因在真核细胞内的表达。结果：测序鉴定证实，TCR Vβ8．2基因已被正确插入到pTARGET载体中，并检测到在肌肉组织和COS-7细胞内重组蛋白的表达。结论：成功地构建重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ8．2，并在体内体外均可检测到其转录和表达，为进一步进行TCR VβDNA疫苗的研究奠定了基础。     

大鼠CD36基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建大鼠CD36真核表达载体,并在293T细胞中表达.方法:应用RT-PCR技术,从大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞提取的总RNA中,获得CD36基因编码序列片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,通过荧光显微镜和Western blot检测其在293T细胞中的表达.结果:酶切和测序证明重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36构建成功,荧光显微镜及Western blot确认目的基因序列在293T细胞中过表达.结论:成功构建大鼠CD36基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36,并在293T细胞中过表达.     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...     

赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础.方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32.脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot检测目的基因的表达.结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达.结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据.     

人类心发育候选基因ZNF569融合EGFP真核表达载体的构建及表达

目的:构建真核表达重组体pEGFP-ZNF569,并鉴定其在哺乳动物COS-7细胞系能否正确表达.方法:把ZNF569基因ORF定向克隆入带有EGFP报告基因的真核表达载体,构建真核表达重组体pEGFP-ZNF569,脂质体介导将pEGFP-ZNF569转染入哺乳动物COS-7细胞,以一步法RT-PCR检测其在哺乳动物COS-7细胞中的表达情况.结果:双酶切及测序鉴定表明成功构建真核表达重组体pEGFP-ZNF569,并在COS-7细胞中成功地表达了融合荧光蛋白.RT-PCR检测显示RT-PCR扩增产物与ZNF569目的基因片段大小相符,确实源于重组质粒转录后的mRNA.结论:真核表达重组体pEGFP-ZNF569的成功构建及在体外真核细胞中有效表达,为进一步研究ZNF569在心发育过程中的信号调控奠定了一定的实验基础.     

利用pIRES载体构建TCR独特型重组质粒

目的 利用可同时表达两个基因片段的pIRES作为载体,构建TCR独特型重组质粒,为制备诱导抗T细胞肿瘤免疫的TCR独特型DNA疫苗提供基础.方法 设计引物,提取Jurkat及Molt4细胞株RNA为模板,RT-PCR法特异性扩增CDR3区,与pIRES经酶切连接后氯化钙法转化,重组质粒经酶切鉴定后测序.结果 构建出3种重组质粒pIRES-Jurkat Vβ8、pIRES-Molt4 Vβ2①和pIRES-Molt4 Vβ2②,其中pIRES-Molt4 Vβ2②测序正确,可体外表达Vβ2蛋白.结论 利用真核表达载体pIRES可成功构建TCR重组质粒,并有可能用于进一步克隆佐剂基因片段入pIRES的多克隆位点,提高DNA疫苗的免疫原性.     

pcDNA3.1-Smac真核表达载体的构建及表达

目的:构建人的smac基因真核表达载体pcDNA3.1-Smac,并在肺腺癌A549细胞中表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人睾丸组织中扩增到smac基因,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Smac.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至肺腺癌A549细胞中.采用RT-PCR、Western blot法检测外源基因smac的表达,MTT法检测细胞生长抑制率.结果:PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人smac基因克隆及真核表达载体peDNA3.1-Smac构建成功.在mRNA水平和蛋白水平,转染后的细胞中外源基因smac表达均明显增加.转染smac质粒72 h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组显著增加.结论:成功构建重组真核表达载体peDNA3.1-Smac,并在肺癌A549细胞中进行了表达;验证了转染后对肺癌细胞生长有抑制作用.     

人RASSF1A基因的真核表达载体的构建及其表达

目的 通过构建人RASSF1A基因的真核表达载体,为研究其在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞增殖抑制等方面奠定基础.方法 采用RT-PCR从人外周血的单个核细胞RNA中扩增出人RASSF1A基因的全长cDNA,利用DNA重组技术将其插入到真核表达栽体pcDNA3.1(+)中获得重组质粒.利用脂质体将重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2中,采用RT-PCR.westem-blot检测RASSF1A的瞬时表达.结果 酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF1A基因已被完整、正确地插入到pcDNA3.1(+)质粒载体中,RT-PCR及Western-blot结果显示转染细胞的RASSF1A表达水平上调.结论 成功构建了RASSF1A基因的真核表达栽体pcDNA3.1(+)/RASSF1A.     

大鼠Akt1基因真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建Akt1基因真核表达载体pDC316-Akt1，观察其在293细胞（人胚肾母细胞）中的表达。方法采用RT-PCR方法自大鼠肝组织总RNA中克隆Akt1 DNA片段，测序鉴定正确后，插入真核表达载体pDC316的EcoRⅠ、HindⅢ的酶切位点，构建Akt1真核表达载体Akt—pDC316，脂质体介导法转染293细胞，36h后Western blot检测转染293细胞中Akt1的含量。结果经测序鉴定，构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符。将Akt-pDC316转入293细胞，可见55000位置有Akt1的表达。经Western blot检测，具有良好的表达浓度。结论构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分表达。     

pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒的构建及体外表达

目的 构建PGC-1α真核表达载体pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒,鉴定及体外表达.方法 通过RT-PCR方法从组织中克隆PGC-1α基因片段,酶切后将其定向插入真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒.结果 双酶切法、测序法鉴定表明目的基因正确插入质粒.结论 成功构建了pEGFP-N1-PGC-1α真核表达载体,转染huh-7细胞后,可瞬时、有效表达,为进一步研究PGC-1α调节HBV、HPV生物合成奠定了基础.     

PBAD表达系统对抗-HBs Fab抗体表达的影响

目的研究PBADP替换Plac的原核表达系统对重组抗-HBs Fabs的表达效率、产量及其抗体活性的影响。方法通过Western blot、抗体不同稀释度的Dot blot和抗原特异性结合实验，对两种表达系统进行比较。结果在PBAD控制下表达的抗．HBs Fabs与Plac控制下的相比，Western blot显示两种表达系统都能完整表达抗-HBs Fab抗体，Mr为50000。PBAD表达系统表达的抗-HBs Fabs多以可溶形式存在于周质腔中，而Plac表达系统表达的抗-HBs Fabs更多的释放入培养上清液。抗体不同稀释度的Dot blot结果显示pBAD-抗HBs Fab表达系统表达的抗体效价较pComb3-抗HBs Fad高，乙型肝炎表面抗原特异性结合实验证实两种表达系统表达的抗体的抗原结合活性无明显差别。结论PBAD表达系统明显提高了抗-HBs Fab的表达量并保持了原抗体活性。     

一种高效表达小干扰RNA载体的构建研究

目的：用mir30前体骨架来构建高效表达小干扰RNA载体。方法：通过基因合成的方法，将mir30前体骨架进行全长基因合成，并在合成的mir30前体骨架中引入合适的酶切位点用于外源发夹DNA的克隆，然后将之克隆到含U6启动子的表达载体中。将针对绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的小干扰RNA克隆到以上表达载体中，通过转染及Western blot来检测新的小干扰RNA表达载体的基因沉默效率。结果：同目前常用的含polⅢ的小干扰RNA表达载体相比较，用mir30前体骨架表达针对GFP的小干扰RNA的表达载体可以明显抑制GFP的表达。结论：用mir30前体骨架构建的小干扰RNA表达载体可高效表达外源小干扰RNA。     

急性淋巴细胞白血病细胞β2整合素及L-选择素的表达与意义

目的和方法:研究急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞粘附分子β₂整合素(CD11a、CD11b)及L-选择素(CD62L)的表达及其临床意义。用流式细胞仪检测45例ALL及25例正常人骨髓单个核细胞的CD11a、CD11b、CD62L表达。结果:①CD11a、CD11b在ALL细胞上表达均明显低于正常人,CD11b低表达的阳性率为100%,50%患者有CD11a低表达。而60%患者CD62L在ALL细胞上表达升高。②CD11a在B-ALL表达明显低于T-ALL表达,CD62L在B-ALL表达高于T-ALL。③浸润组CD11a表达高于非浸润组(P＜0.05)。④ALL完全缓解组CD11a、CD11b的表达在正常范围。结论:急性淋巴白血病细胞上存在多个粘附分子的表达异常,检测粘附分子有助于判断白血病细胞类型及疗效。     

人源抗-HAV Fab真核表达载体的构建及表达

目的 构建人源抗－ＨＡＶＦａｂ真核表达载体并进行表达。方法 采用ＤＮＡ重组技术将抗体重轻链基因与信号肽基因连接,并分别插入真核表达载体ｐＣｄｈｆｒｌ、ｐＣＤＮＡ３．１;以脂质体介导法转染ＣＨＯ细胞,经Ｇ４１８筛选细胞,ＥＬＩＳａｂ基因的表达。结果 成功地构建了Ｆａｂ表达载体。转染细胞后,经ＥＬＩＳＡ检测,细胞增养上清中有抗原结合活性的Ｆａｂ片段。结论Ｆａｂ真核表达载体的构建及其在ＣＨＯ细胞中的表达     

真核表达载体pEGFP-GPC3的构建及表达

目的:构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)真核表达载体pEGFP-GPC3,并在小鼠树突状细胞(DC)表达.方法:将质粒pCMV-SPORT6-GPC3和载体pEGFP-N1分别进行双酶切获得目的基因GPC3片段和空载体,回收纯化后用T4连接酶将两者连接并转化E.coli DH5α菌株,用EcoR I、BamH I双酶切鉴定后通过脂质体法转染到DC中,然后进行荧光检测和Western blot分析.结果:构建的真核表达载体pEGFP-GPC3,转染DC后,荧光显微镜下可见转染的DC中有EGFP-GPC3融合蛋白的表达,Western blot分析发现有相对分子质量(M,)大小约为67 000的蛋白条带.结论:成功地构建了真核表达载体pEGFP-GPC3并在转染DC后能在其中表达,为进一步研究GPC3基因的功能提供实验基础.     

人重组pEGFPC1-uPA ATF质粒的构建及表达的研究

目的构建含人uPA ATF基因的真核表达质粒，并研究其对小鼠细胞株Pam212细胞的影响。方法设计引物，利用PCR从原核表达质粒中扩增人uPAA1F基因片断，并导入真核表达载体的绿色荧光蛋白pEGFPCI中，利用电泳和测序检测构建状况，荧光显微镜观察和免疫细胞化学检测转染情况，通过MTT、体外迁移实验检测对小鼠Pam212细胞株的影响。结果电泳和测序表明构建的质粒准确，uPA ATF cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；质粒转染Pam 212细胞株成功，并且能抑制细胞的增殖和迁移。结论成功构建了真核表达载体pEGFPC1-uPA ATF质粒，明确了人uPA ATF基因片断能降低小鼠细胞的增殖和迁移，为进一步在体实验研究打下了基础。     

人PSCA基因真核载体的构建与表达

目的 克隆人PSCA(prosaae stem cell antigen)分子的cDNA,构建PSCA基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 从PSCA阳性细胞系LNCaP中提取总RNA,逆转录为cDNA.根据编码人PSCA的基因序列设计引物,以cDNA为模板,采用PCR技术扩增PSCA基因,将该基因插入到pcDNA3.1(+)真核载体,构建pcDNA3.1(+)-PSCA表达质粒.经限制性酶切鉴定和DNA序列测定结果证实后,将重组质粒pcDNA3.1(+)-PSCA转染Hela细胞,检测其体外瞬时表达.结果 测序证实得到人PSCA基因序列,序列分析显示没有发生无义突变.RT-PCR和免疫细胞化学分析结果分别表明转染细胞有目的 基因和分子的表达.结论成功克隆人PSCA基因,并在真核细胞中获得表达,为进一步构建基于PSCA的肿瘤疫苗奠定了基础.     

β雌激素受体沉寂表达载体的构建及表达

目的构建雌激素受体β(ERβ)亚型沉寂表达载体,并观察其转染成骨细胞后抑制ERβ基因表达的效果。方法参考人ERβ基因mRNA序列,设计、合成ERβ-shRNA的DNA Oligo后行PCR扩增,获得的shRNA双链DNA片段与pLVTHM-GFP质粒双酶切后连接,转化大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞。取鉴定正确的pLVTHM-GFP/ERβ-shRNA重组质粒转染人成骨hMG63细胞,实验分空白载体组、空白对照组和ERβ-siRNA组,转染48h后于倒置荧光显微镜下观察各组细胞的转染效果,并采用流式细胞术检测转染效率。抽提各组细胞的总RNA,经RT-PCR生成cDNA,Realtime-PCR检测ERβ基因的抑制效率。结果倒置荧光显微镜下观察显示,ERβ-siRNA组hMG63细胞90%以上呈现绿色荧光。流式细胞术检测ERβ-shRNA转染hMG63细胞的转染效率为92.3%。Realtime-PCR检测结果表明,ERβ-siRNA组ERβ表达量(0.17±0.01)仅约为空白载体组(1.00±0.01)的17.3%(P0.001),ERβ-siRNA对hMG63细胞ERβ基因的抑制效率约为83%。结论成功建立了人ERβ沉寂表达的成骨细胞模型,慢病毒载体介导的ERβ-siRNA能有效抑制成骨细胞ERβ基因的表达,满足了研究成骨细胞中ERβ相关功能的需要。