抗Siglec-9抗体Fab段对LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应的作用研究北大核心CSCD

目的初步探讨抗Siglec-9抗体Fab段在小鼠巨噬细胞上对LPS诱导的炎症反应的作用及其机制。方法将小鼠巨噬细胞分为对照组、LPS组、LPS+Ab组、Ab组,采用实时荧光定量PCR技术检测TNF-α、IFN-β、IL-1、IL-6等炎性细胞因子的mRNA水平;采用ELISA检测炎性细胞因子的蛋白水平;通过Western blot初步探讨抗Siglec-9抗体Fab段影响炎性细胞因子表达量的作用机制。结果与LPS组相比,抗Siglec-9抗体Fab段抑制炎性细胞因子的mRNA和蛋白水平,降低TLR4信号通路磷酸化水平。结论抗Siglec-9抗体Fab段通过阻断TLR4信号传导通路抑制炎性细胞因子的m RNA和蛋白水平,在感染性疾病中具有潜在的应用价值。     

人源化抗 Siglec-9 抗体 Fab 片段的制备及鉴定

目的:构建人源化抗Siglec-9 抗体Fab 段原核表达质粒,表达、纯化此抗体以及特性分析,并初步探讨此抗体 的生物学功能。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)分别获得抗体轻链和重链的可变区及恒定区,经重叠延伸PCR 连接,酶切 后与原核表达载体pETDUET-1 重组,转入表达感受态Escherichia coli BL21 中,通过蛋白纯化系统AKTA 和His-trap Lambda Fab 纯化。使用SDS-PAGE、ELISA 以及Western blot 鉴定和分析。采用实时荧光定量PCR 初步检测抗Siglec-9 抗体Fab 段对 炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 的mRNA 表达量的影响。结果:成功获得抗体轻链和重链,构建人源化抗Siglec-9 抗体 Fab 段原核表达系统,经SDS-PAGE、Western blot、ELISA 检测证实抗Siglec-9 抗体Fab 段与Siglec-9 抗原特异性结合。抗 Siglec-9 抗体Fab 段可抑制炎性细胞因子TNF鄄琢、IL-1、IL-6、IL-8 的mRNA 表达量。结论:人源化抗Siglec-9 抗体Fab 段进行了 原核系统表达、纯化和鉴定,并初步验证可抑制炎性细胞因子的mRNA 表达量,为进一步研究该抗体的生物学特性及应用奠 定基础。     

紫茎泽兰精油化学分离物抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎性反应

目的探究紫茎泽兰精油化学分离物对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞抗炎活性和Toll样受体4(TLR4)蛋白表达的影响。方法将巨噬细胞分为空白对照组、 LPS组、 LPS联合紫茎泽兰精油化学分离物组。CCK-8法检测紫茎泽兰精油化学分离物的细胞毒性,实时定量PCR检测RAW264.7细胞白细胞介素6(IL-6)、 IL-10的mRNA水平, ELISA检测IL-6、 IL-10的蛋白水平, Western blot法检测RAW264.7细胞TLR4蛋白水平。结果剂量20 mg/mL的紫茎泽兰精油化学分离物对RAW264.7细胞无细胞毒性。LPS处理可引起RAW264.7细胞TLR4蛋白水平升高、 IL-6 mRNA和蛋白水平增加、 IL-10水平降低,分离产物可逆转以上作用。结论紫茎泽兰精油化学分离物抑制RAW264.7细胞TLR4蛋白表达和IL-6的分泌,促进IL-10表达,发挥抗炎作用。     

Fasudil通过TLR4通路抑制脂多糖诱导的小鼠BV-2小胶质细胞TNF-α和IL-1β的表达

目的探讨Fasudil对脂多糖(LPS)诱导BV-2小胶质细胞系促炎细胞因子表达中的作用。方法体外培养BV-2小胶质细胞系,实验分为PBS对照组、LPS刺激组、LPS联合Fasudil干预组,ELISA检测细胞TNF-α、IL-1β的释放,Griess法检测NO释放水平,流式细胞术检测Toll样受体4(TLR4)、TLR2蛋白表达。结果 LPS刺激BV-2细胞可导致TNF-α、IL-1β和NO的释放明显增加,还可导致炎性信号通路中的受体TLR4表达明显增加。Fasudil能明显抑制炎性因子的释放和TLR4的表达。结论 Fasudil可抑制LPS诱导的小胶质细胞NO、TNF-α和IL-1β释放,其作用机制可能与Fasudil下调TLR4通路有关。     

降钙素基因相关肽通过降低炎性小体活性抑制巨噬细胞功能

目的探讨降钙素基因相关肽(CGRP)抑制巨噬细胞炎性反应的机制。方法使用不同浓度CGRP处理LPS活化/未活化的小鼠巨噬细胞(RAW264.7),实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测巨噬细胞内促炎细胞因子白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和还原型辅酶Ⅱ氧化酶-活性氧簇-NOD样受体蛋白3(NLRP3)mRNA表达水平;酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测细胞上清分泌型IL-1β和TNF-α蛋白表达量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞内NLRP3蛋白表达水平。结果 CGRP显著降低LPS活化/未活化RAW264.7细胞内炎性因子IL-1β、TNF-α、NLRP3 m RNA水平与蛋白水平,同时,NLRP3下游调节分子Caspase-1的蛋白水平被显著下调。在mRNA水平,NLRP3随CGRP剂量变化而变化的趋势与IL-1β、TNF-α非常相似。结论CGRP抑制巨噬细胞炎性激活,其机制可能与CGRP抑制NLRP3表达与活性有关。     

肺泡巨噬细胞TLR4/MyD88信号通路参与并介导了机械通气所致的肺损伤

目的探讨肺泡巨噬细胞Toll样受体4/髓样分化因子88(TLR-4/My D88)信号通路在呼吸机相关性肺损伤中的作用。方法 30只成年SD大鼠行经口气管插管,给予40 m L/kg潮气量通气240 min,建立呼吸机相关性肺损伤模型,机械通气结束后,使用4℃PBS经气管导管缓慢注入并回收支气管肺泡灌洗液(BALF),提纯肺泡巨噬细胞。收集并培养肺泡巨噬细胞,随机分为3组:PBS刺激组(CON组);TNF-α刺激联合PBS组(STI组);TNF-α刺激联合抗TLR4单克隆抗体(m Ab)干预组(ANT组);每组8个样本。CON组细胞用PBS结合2 h后,继续用PBS培养16 h;STI组细胞用PBS结合2 h后,采用20 ng/m L TNF-α培养16 h;ANT组细胞用PBS液及TLR4 m Ab结合2 h后,用20 ng/m L TNF-α培养16 h。ELISA检测各组上清液TNF-α、IL-1β、IL-6的表达;反转录PCR检测各组肺泡巨噬细胞TLR4、TLR9、髓样分化因子88(My D88)、核因子κB(NF-κB)的mRNA表达,Western blot法检测各组肺泡巨噬细胞TLR4、TLR9、My D88、NF-κB的蛋白表达。结果与CON组比较,STI组及ANT组细胞培养上清液TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度明显增高;STI组肺泡巨噬细胞TLR4 mRNA、My D88 mRNA、NF-κB mRNA表达水平与蛋白表达水平明显增高;ANT组肺泡巨噬细胞TLR4 mRNA、My D88 mRNA、NF-κB mRNA表达水平与蛋白表达水平无明显变化。与STI组比较,ANT组细胞培养上清液TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度明显降低;肺泡巨噬细胞TLR4 mRNA、My D88 mRNA、NF-κB mRNA表达水平与蛋白表达水平明显下调。3组TLR9 mRNA与蛋白表达水平相近。结论炎症因子刺激可调节TLR4、My D88、NF-κB分泌增加,肺泡巨噬细胞TLR4-My D88信号通路参与并介导了机械通气所致的肺损伤。     

苦参碱抑制LPS诱导巨噬细胞IL-1β、TNF-α分泌及机制研究

目的:探讨苦参碱抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导巨噬细胞分泌炎症因子包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)对Toll样受体4(TLR4)、c-Jun表达的影响。方法:购买并培养小鼠RAW264.7巨噬细胞株,分成四组,即空白对照组、苦参碱组、LPS组、苦参碱干预组,通过浓度为100μg/L的LPS DMEM孵育1 h,之后将LPS弃去,然后加入不含血清的DMEM或125.25 mg/L苦参碱DMEM继续培养。分别收集上述四组细胞处理完毕后5、30、60、120min的细胞及培养液。通过PCR法检测小鼠RAW264.7巨噬细胞TLR4及c-Jun mRNA的表达,通过免疫细胞化学法检测小鼠RAW264.7巨噬细胞c-Jun蛋白的表达;通过ELISA法测定各组培养液中TNF-α、IL-1β的分泌。结果:苦参碱诱导组与空白对照组相比,TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun蛋白的表达量和TNF-α及IL-1β分泌量各项指标差异无统计学意义(P0.05);LPS组各个时间点TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun蛋白的表达量和TNF-α及IL-1β分泌量明显高于空白对照组,且高水平能够维持2 h以上(P0.05);苦参碱干预组能够有效的抑制LPS诱导的巨噬细胞TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun蛋白的表达量,降低炎症因子TNF-α、IL-1β的分泌量。结论:苦参碱可能通过抑制LPS诱导的巨噬细胞丝裂原活化的蛋白激酶信号通路上TLR4、c-Jun的过表达从而有效的降低终末炎症因子TNF-α及IL-1β的释放,进而有效的抑制炎症反应,减轻内毒素炎症反应的程度。     

妊娠期脂多糖接触激活体内TLR4信号通路引起胚胎脑内炎症应激

目的: 观察孕鼠腹腔脂多糖 (LPS) 注射后母体外周血单个核细胞 (PBMNC) 上Toll样受体4 (TLR4) 信号通路激活情况和胚胎脑组织中炎症性细胞因子的水平。方法: 10.5 d孕鼠腹腔注射LPS 0、3、6、12、24、48 和72 h后,通过蛋白免印迹测定孕鼠PBMNC 上TLR4、分化抗原14 (CD14)、髓样分化蛋白2 (MD-2)、p65和p50蛋白水平,Luminex 100免疫荧光法测定孕鼠血清、羊水、脑组织及胚胎脑组织细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白水平,实时RT-PCR测定孕鼠PBMNC和胚胎脑组织TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA水平。结果: LPS腹腔注射诱导激活孕鼠PBMNC上TLR4信号通路,TLR4、CD14和MD-2蛋白水平短暂增高,核因子κB (NF-κB) 激活片段p65 和p50蛋白水平增高,TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA水平增高(P<0.01);孕鼠外周血和羊水TNF-α、IL-1β和IL-10水平短暂增高(P<0.01),脑内IL-1β蛋白水平短暂升高(P<0.01);胚胎脑内TNF-α和IL-1β蛋白和mRNA水平显著增高(P<0.01)。结论: 妊娠期母体LPS接触可激活母体外周免疫细胞TLR4信号通路,引发胚胎脑内炎症应激状态,可能增加出生后相关疾病的发生风险。     

天抗(TK)对脂多糖诱导小鼠炎症模型的抗炎作用及其机制

目的研究天抗(TK)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠炎症模型的抗炎作用及机制研究。方法将42只昆明小鼠随机分为正常对照(NC)组、模型对照(LPS)组、地塞米松(DXM)组、天抗低(TK-L)、中(TK-M)和高(TK-H)剂量组(0.2,0.8和3.2 g/kg)。各组分别灌胃给药7 d后,腹腔注射30 mg/kg的LPS诱导小鼠急性炎性模型,6 h后处死小鼠,检测小鼠脾脏指数,ELISA测定小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平;生化法检测小鼠血清中SOD和MDA的表达;qRT-PCR检测小鼠脾脏TLR4、MyD88、TRAF6、p65、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达水平;Western blot检测小鼠脾脏TLR4、MyD88、TRAF6、p-p65和p65蛋白表达水平。结果与LPS组相比,TK组小鼠的脾脏指数明显降低,血清和脾脏组织中IL-1β、IL-6、TNF-α和MDA水平显著下降,SOD水平明显升高,小鼠脾脏组织的TLR4、MyD88、TRAF6和p-p65等蛋白及mRNA表达水平均明显降低。结论天抗对LPS诱导的小鼠急性炎症模型具有抗炎作用,其作用机制可能是通过TLR4/MyD88/NF-κB(p-65)信号通路抑制炎症因子的释放。     

金雀异黄素对脂多糖诱导的巨噬细胞MAPK和TLR信号转导通路的影响

目的研究金雀异黄素对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路和Toll样受体(TLR)通路的影响。方法用100 ng/mL脂多糖和金雀异黄素分别处理RAW264.7巨噬细胞不同时间后,采用Western blot法检测对MAPK信号通路蛋白磷酸化的影响;采用RT2 ProfilerTMPCR芯片检测金雀异黄素对LPS诱导的TLR信号转导通路基因表达的影响。结果 LPS能够显著诱导蛋白p38和p42/44磷酸化,激活MAPK信号通路,金雀异黄素能够加强其作用,同时,LPS能够显著诱导TLR信号转导通路的细胞因子基因表达,包括IFN-β、IL-10、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、集落刺激因子2(CSF-2)、CSF-3、趋化因子CCL2和CXCL10、环氧合酶2(COX-2)、NF-κB1和IκB-α等,金雀异黄素能够显著降低这些上调基因的表达。结论金雀异黄素能够显著增强LPS激活的MAPK信号通路并抑制TLR信号通路的激活。     

荔枝草乙酸乙酯提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞抗炎作用及相关机制研究

目的在荔枝草抗炎有效部位筛选的基础上,深入研究荔枝草乙酸乙酯提取物(LZC)体外抗炎的作用及相关机制,为荔枝草的临床开发利用提供实验数据和理论依据。方法以脂多糖(LPS)刺激小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7建立炎症模型,检测LZC对该炎症模型释放的炎症因子以及炎症信号通路TLR4/MyD88/NF-κB中关键基因表达的影响。结果荔枝草乙酸乙酯提取物在6.25~25μg/ml范围内,可显著抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞炎症因子PGE2、NO、TNF-α和IL-6的释放水平,且具有量效关系。进一步研究结果显示,荔枝草乙酸乙酯提取物也能显著抑制TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白和mRNA水平的表达。结论荔枝草乙酸乙酯提取物可通过TLR4信号通路减少炎症相关因子的释放从而发挥抗炎的作用。     

阻断TLR2结合降低β2GP1-抗β2GP1复合物刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的表达

目的探讨β2糖蛋白1(β2GP1)-抗β2GP1复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)中Toll样受体2(TLR2)的作用。方法用β2GP1-抗β2GP1复合物、TLR2激动剂Pam3CSK4及TLR4激动剂脂多糖(LPS)、TLR2阻断剂抗小鼠TLR2-Ig G(m TLR2-Ig G)及TLR4阻断剂TAK-242对BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞进行体外处理。用实时荧光定量PCR检测TNF-αmRNA水平,Western blot法及免疫荧光细胞化学方法检测TNF-α蛋白表达;采用流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞表面TLR2的水平。结果β2GP1-抗β2GP1复合物、Pam3CSK4及LPS均能够显著增加BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞表达TNF-αmRNA及蛋白水平,抗m TLR2-Ig G能够抑制上述刺激物促进细胞TNF-α表达的效应,但弱于TAK-242的抑制效应,抗m TLR2-Ig G与TAK-242联合使用未显示更强的抑制效应。流式细胞术结果显示,β2GP1-抗β2GP1复合物、Pam3CSK4及LPS均能增加小鼠腹腔巨噬细胞TLR2的表达,而抗m TLR2-Ig G、TAK-242以及二者联合使用均未显示对TLR2表达的抑制效应。结论TLR4、TLR2都增强β2GP1-抗β2GP1复合物对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的刺激作用。     

小檗碱和育亨宾对内毒素血症小鼠脾脏TLR4信号通路中相关基因表达的影响

目的: 观察小檗碱和α₂肾上腺素能受体拮抗剂育亨宾对内毒素血症小鼠脾脏Toll样受体4(TLR4)信号通路84种基因表达的影响,并初步探讨其作用机制。方法: 雄性BALB/c小鼠随机分为对照组、脂多糖(LPS)组、小檗碱+LPS组、小檗碱+育亨宾+LPS组、育亨宾+LPS组、小檗碱组、小檗碱+育亨宾组和育亨宾组。分别用蒸馏水、小檗碱(50 mg/kg)、小檗碱+育亨宾(50 mg/kg+2 mg/kg) 和育亨宾(2 mg/kg)灌胃,每天1次,连续3 d,第3 d灌胃1 h后,腹腔注射LPS(20 mg/kg)或生理盐水。腹腔注射1 h后,用RT² Profiler^TM PCR Array分析技术检测小鼠脾脏TLR4信号通路84种基因mRNA的表达;用Western blotting分析小鼠脾脏TLR4信号通路的抑制分子细胞因子信号抑制物(SOCS)1、SOCS3和白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK)-M蛋白的表达。结果: LPS可上调小鼠脾脏TLR4信号转导通路中相关炎症因子的mRNA表达,包括CXCL10、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IFN-β。小檗碱能显著下调下调髓样分化因子(MyD88)依赖信号通路下游TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达,也能MyD88非依赖信号通路下游基因IFN-β和CXCL10 mRNA的表达(P<0.05)。育亨宾能显著下调内毒素血症小鼠脾脏IL-1α、IL-1β 和IFN-β mRNA的表达(P<0.05),但对TNF-α、IL-6和CXCL10 mRNA表达的下调作用与LPS组相比没有显著差异(P>0.05)。小檗碱与育亨宾合剂能显著下调内毒素血症小鼠脾脏IFN-β和CXCL10 mRNA的表达,但不能显著下调内毒素血症小鼠脾脏IL-1α、IL-1β、TNF-α 和IL-6 mRNA的表达。LPS攻击后1 h,小檗碱和(或)育亨宾均不能增强内毒素血症小鼠脾脏SOCS1、SOCS3和IRAK-M蛋白的表达。结论: 小檗碱和育亨宾均能抑制LPS诱导的MyD88依赖和非依赖信号通路下游部分基因的表达,这种抑制作用的机制与SOCS1、SOCS3和IRAK-M蛋白无关。     

MTB Hsp 16.3通过TLR4对小鼠M1型巨噬细胞的作用研究

探讨MTB Hsp16.3通过TLR4对小鼠M1型巨噬细胞的作用。从BALB/c小鼠胫腓骨取骨髓来源巨噬细胞,经IFN-γ诱导得到M1型巨噬细胞,MTB Hsp16.3与M1型巨噬细胞共培养,qRT-PCR和ELISA检测M1/M2型巨噬细胞相关细胞因子表达水平;用siRNA-TLR4和PMB抑制M1型巨噬细胞,qRT-PCR和ELISA检测IL-10、Arg1、iNOS、TGF-β及TNF-α等细胞因子的表达水平,western blotting法检测MAPK-NF-κB信号通路中各蛋白的表达水平。结果发现MTB Hsp16.3作用后的M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的细胞因子IL-10、TGF-β及Arg1mRNA在各时间点均升高,M1型细胞因子TNF-α、iNOS表达水平降低。抑制TLR4后,IL-10、Arg1及TGF-β水平降低,TNF-α、iNOS、IL-6表达水平升高,MAPK-NF-κB信号途径被抑制。由此MTB Hsp16.3可能通过TLR4促进小鼠M1型巨噬细胞发生M2样转化。     

没食子酸通过拮抗脂多糖诱导的TLR4/NF-κB活化抑制RAW264.7巨噬细胞炎性反应

目的观察没食子酸对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞Toll样受体4/核因子κB(TLR4/NF-κB)通路的影响。方法将巨噬细胞分为空白对照组、LPS组、LPS联合没食子酸组、LPS联合NF-κB抑制剂吡咯二硫代甲酸(PDTC)组和LPS联合地塞米松(DM)组。处理后的细胞培养24 h,ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、IL-6水平,实时定量PCR检测TLR4、NF-κB mNRA水平,Western blot法检测p65、p-p65、TLR4、磷酸化的NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的蛋白表达水平。结果 LPS诱导RAW264.7巨噬细胞后TNF-α、IL-1、IL-6水平升高,没食子酸可降低LPS诱导引起的TNF-α、IL-1和IL-6表达水平升高。LPS刺激后TLR4 mRNA及蛋白表达增加,NF-κB活化,没食子酸可拮抗以上作用,阻止NF-κB活化。结论没食子酸可通过TLR4/NF-κB通路抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎性反应。     

微小RNA-7基因敲减对LPS诱导的脑部炎症的影响

为研究微小RNA-7(microRNA-7, miR-7)基因敲减(knock down, KD)对LPS诱导的脑部炎症的影响并探讨其意义,课题组用LPS腹腔注射(2.5mg/kg体质量)WT小鼠建立脑部炎性损伤模型;HE染色观察小鼠脑组织病理学变化,real-time PCR探针法检测脑组织中miR-7的表达变化;进一步,用LPS腹腔注射(2.5mg/kg体质量)WT小鼠和miR-7KD小鼠;12h后,HE染色观察小鼠脑组织病理学变化;real-time PCR检测脑组织中炎性细胞因子IL-6、TNF-α和TGF-β的mRNA变化水平;ELISA检测脑组织中炎性细胞因子IL-6、TNF-α和TGF-β的变化水平;Western blotting检测信号通路Akt和p-Akt以及炎性信号通路NF-κB和p-NF-κB的表达变化。结果显示小鼠炎性损伤模型脑组织中,HE示WT小鼠在注射LPS后,脑组织中炎性细胞浸润显著增多且miR-7的表达水平显著升高(P0.01);HE结果示miR-7 KD小鼠脑组织中炎性细胞浸润较WT小鼠显著增多;real-time PCR结果示促炎细胞因子IL-6(P0.01)和TNF-α(P0.01)的表达水平均显著升高,而抑炎细胞因子TGF-β(P0.01)的表达水平显著降低;ELISA结果显示,促炎细胞因子IL-6(P0.01)和TNF-α(P0.01)的表达水平均显著升高,而抑炎细胞因子TGF-β的表达水平显著降低(P0.01); Western blotting结果示miR-7 KD模型小鼠脑组织Akt和p-Akt表达没有明显变化,NF-κB(P0.05)和p-NF-κB(P0.01)表达均明显增加。由此miR-7基因敲减显著促进了脑组织炎性损伤的发生,与NF-κB信号通路传递改变相关,本研究为后续深入探讨miR-7在脑部炎症相关疾病的发生机制中的作用提供了前期实验基础。     

三百棒通过调控TLR4/NF-κB信号通路对脂多糖诱导的RAW264.7细胞极化的影响

目的：探讨三百棒醇提物(TAAE)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7极化趋向以及其对炎症反应的影响。方法：用LPS诱导RAW264.7细胞建立炎症模型。CCK-8法检测细胞活力;ELISA检测细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10)的水平;Griess法检测细胞培养上清液中一氧化氮(NO)的分泌情况;荧光染色双标法观察巨噬细胞的极化状态;免疫荧光染色检测NF-κB定位及表达;Transwell检测TAAE对RAW264.7细胞迁移和趋化性的影响;RT-qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1、NF-κB和TLR4的mRNA水平;Western blot检测iNOS、COX-2、TLR4、NF-κB、p-NF-κB、IκBα和p-IκBα蛋白水平。使用TLR4通路抑制剂TAK-242进一步验证TAAE对TLR4/NF-κB信号通路的影响。结果：与模型组相比较,TAAE降低LPS诱导的炎症模型RAW264.7细胞中M1型促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)及NO水平,促使M2型抑炎因子(IL-10和Arg-1)分泌...     

重组腺病毒介导的sTLR2和sTLR4体外抗炎效应的实验研究

目的观察重组腺病毒介导的sTLR2和sTLR4对炎症模型细胞因子表达水平的影响。方法将人单核细胞系THP-1细胞随机分为正常对照组、炎症对照组、重组腺病毒AdTLR2组、重组腺病毒AdTLR4组、重组腺病毒AdTLR2+AdTLR4组。AdTLR2和AdTLR4单独或者联合作用于各组细胞,通过RT-PCR方法检测TLR2和TLR4 mRNA表达,应用ELISA法对上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量进行检测,探讨AdTLR2和AdTLR4对LPS诱导的THP-1细胞上清细胞因子表达水平的影响。结果通过RT-PCR方法检测THP-1细胞转染AdTLR2+AdTLR4后,TLR2和TLR4能够获得高表达。AdTLR2和AdTLR4单独和联合作用于LPS所致炎症细胞后,细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量较炎症对照组显著降低,且联合作用较单独作用组进一步降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论重组腺病毒AdTLR2和AdTLR4能够降低LPS所致炎性细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量,并且联合使用的抗炎效果优于AdTLR2或AdTLR4的单独作用。提示制备的重组腺病毒能够分泌sTLR2和sTLR4,能有效抑制炎性细胞的活化,减少细胞因子的释放,具有一定的抗炎作用。     

TREM-1促进巨噬细胞的迁移并参与脂多糖诱导的小鼠心肌功能障碍

目的探讨髓系细胞触发受体-l(triggering receptor expressed oil myeloid cells-1,TREM-1)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠心肌功能障碍的作用以及对巨噬细胞RAW264.7迁移的影响。方法将健康C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组、LPS组、LPS+LP17组、LPS+TAK-242组并进行相应处理,6 h后超声心电图检测小鼠心功能指标,12 h取心肌组织HE染色观察病理改变,免疫组化染色观察巨噬细胞表面分子F4/80阳性表达,ELISA检测血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β及IFN-γ的表达情况,实时荧光定量PCR检测TREM-1、BNP以及炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ的mRNA水平;培养巨噬细胞RAW264.7,将细胞随机分为正常组、LPS组、LP17+LPS组、TAK-242+LPS组并进行对应处理,实时荧光定量PCR检测TREM-1与TLR4的mRNA水平,ELISA检测细胞培养液中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β及IFN-γ的表达情况,Transwell小室观测RAW264.7细胞迁移情况,蛋白免疫印迹检测RAW264.7中TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白水平。结果与对照组相比,超声心电图检测结果显示LPS组小鼠的EF与FS下降,LVD增大,IVS减小,LVPW变薄,变化均显著(P0.05),实时荧光定量PCR结果显示TREM-1 mRNA与BNP mRNA表达水平上升(P0.05),免疫组化染色法显示F4/80有大量阳性表达(P0.01),ELISA检测显示炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ的含量增加(P0.05),实时荧光定量PCR检测也表明这些炎性因子mRNA水平升高(P0.05);与LPS组小鼠相比,注射TREM-1抑制剂LP17使EF、FS上升,有效抑制了LVD增大、IVS减小以及LVPW变薄的现象(P0.05),TREM-1 mRNA与BNP mRNA表达水平均降低(P0.05),心肌损伤减轻,F4/80阳性表达减少(P0.01),炎症因子水平也明显下降(P0.05),与注射TLR4抑制剂TAK-242的效果一致。与对照组相比,LPS诱导RAW264.7细胞后,细胞中TREM-1 mRNA与TLR4 mRNA水平升高(P0.05),炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ的含量增加(P0.05),细胞大量迁移(P0.01),细胞中TLR4、MyD88、NF-κBp65、p-IκBα蛋白水平升高(P0.05);与LPS组相比,TREM-1抑制剂LP17预处理后再给予LPS诱导,细胞中TREM-1 mRNA与TLR4 mRNA水平降低(P0.05),炎症因子的含量下降(P0.05),RAW264.7细胞迁移被抑制(P0.01),TLR4、MyD88、NF-κBp65、p-IκBα蛋白水平也明显降低(P0.05)。结论给小鼠注射TREM-1抑制剂可有效减轻LPS诱导的心肌功能障碍,抑制RAW264.7细胞TREM-1表达可抑制细胞的迁移,TLR4/NF-κB途径可能参与了这一过程。     

四妙勇安汤含药血清对巨噬细胞TLR4/MyD88信号通路及其下游炎症因子的影响

目的研究四妙勇安汤含药血清对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)信号通路及TNF-α、IL-6等炎症因子表达的影响,初步探讨其抗动脉粥样硬化的作用机制。方法采用大、中、小剂量四妙勇安汤水煎剂灌胃干预清洁级SD大鼠,制备含药血清;经MTT法观察含药血清对细胞增殖的影响后,选择剂量浓度为20%的含药血清干预体外培养的经LPS活化的巨噬细胞,采用ELISA法检测细胞上清液中TNF-α及IL-6含量;荧光定量PCR及Westernblot法检测细胞TLR4、MyD88的mRNA及蛋白的表达变化。结果用LPS刺激细胞后,引起TLR4、MyD88、TNF-α及IL-6的高表达,与正常血清对照组相比,差异具有统计学意义(P0.01);而用四妙勇安汤含药血清干预后,能显著抑制各项指标的高表达,与模型组相比,差异具有统计学意义(P0.05或P0.01)。结论四妙勇安汤含药血清能够有效抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应,其机制可能与调控TLR4/MyD88信号转导通路有关,这可能是该方防治动脉粥样硬化及免疫炎症性疾病作用的机制之一。