唐山市甲型H1N1流感病毒血凝素基因序列分析

目的 分析2010—2016年唐山市甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因序列进化特征.方法 选取唐山市3家哨点医院流感样病例分离到的24株甲型H1N1病毒,通过RT-PCR和测序方法获得HA基因的全长序列,运用分子生物学软件和统计学软件对序列进行拼接、比对和分析.结果 同源进化分析显示,24株甲型H1N1流感病毒HA基因与疫苗株A/California/7/2009的核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.0%~99.0%和97.0%~98.5%.进化分析显示,2010—2016年唐山地区流行的甲型H1N1流感病毒属于1、7、6三个基因分支,其中6分支毒株分为6C、6B、6B.1和6B.2亚支.氨基酸位点分析显示,不同毒株与疫苗株比较存在8~16处氨基酸位点改变,其中7个变异涉及3个抗原表位:H138Q/Y和S203T突变位于Ca区,N125S、K153E、S162N、K163T/Q突变位于Sa区,S185T突变位于Sb区同时也位于受体结合部位;2015—2016流行季6B.1分支毒株抗原位点S162N突变增加了新的潜在糖基化位点.结论 与疫苗株比较,随着时间推移唐山地区甲型H1N1流感病毒发生了抗原漂变,未来仍应关注6B分支流行株的变化.     

2009年泉州市H1N1流感监测及基因特性分析

目的 了解2009年泉州地区H1N1流感监测情况,分析泉州市H1N1流感病毒的HA和NA基因特征,探讨该病毒的遗传变异及分子特性.方法 对泉州市H1N1流感监测期间的病人咽拭子采用real-time RT-PCR方法检测病毒核酸,MDCK细胞培养进行病毒分离、鉴定,并提取其中2株代表性毒株病毒RNA;采用RT-PCR扩增病毒HA和NA基因,纯化产物进行核苷酸序列测定;用DNAStar Megalign软件进行序列分析.结果 1020份咽拭子中有200份为H1N1流感病毒核酸阳性,70份季节性流感病毒核酸阳性,其中53份为H3N2亚型,14份为H1N1亚型,3份为B型,并分离到29株甲型H1N1流感病毒株.HA基因经核苷酸序列测定显示,该毒株与北美流行株高度同源,由HA基因核苷酸序列推导的氨基酸系列与疫苗株A/Brisbane/59/2007相比,有22个位于抗原决定簇的氨基酸位点发生变异,但受体结合特异性仍为人样受体.NA基因耐药性位点分析,显示对达菲药物依然敏感.结论 2009年泉州市H1N1流感流行毒株与北美流行株高度同源,相对于疫苗代表株出现了HA蛋白抗原性的改变.     

甲1型流感病毒新分离株HA基因的序列分析

目的 研究新分离的H1N1亚型流感病毒株的HA1基因序列。方法 甲型流感病毒通过鸡胚增殖后提取RNA、逆转录合成cDNA,经PCR扩增和产物纯化构建重组质粒,用双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定;并进行基因特性分析。结果 新分离到的3株流感病毒株（H1N1）HA1区基因长度为981bp,编码327个氨基酸;与A/桂防/10/94和A/Bayern/07/95（H1N1）标准株比较其同源性分别为92.8%和91.3%,丢失了第130位氨基酸和304位糖基化位点;新分离的3株甲型流感病毒（H1地）标准株比较其同源性分别为92.8%和91.3%,丢失了第130位氨基酸和304位糖基化位点,新分离的3株甲型流感病毒株（H1N1）HA1区氨基酸同源性高达98%;A/桂防/10/94和A/Bayern/07/95(H1N1)毒株HN1氨基酸的同源性高达96%。结论 新分离到的3株H1N1毒株HA编码氨基酸不同于A/Baydrn/07/95(H1N1)和A/桂防/10/94（H1N1）标准株,它们可能为新的甲型流感病毒变异性。     

广东新型甲型H1N1病毒血凝素基因分子进化与变异

目的 揭示广东地区2009-2011年新型H1N1病毒血凝素基因(HA)进化特征及抗原表位变异特征.方法 采用时空抽样方法抽样,检测2009-2011年广东分离的24株新型H1N1病毒HA基因核苷酸序列,与GenBank中44株国外相应序列比较;比对HA基因核苷酸序列,分析基因分子变异,构建分子遗传动力学MCMC进化树;同时分析2009-2011年广东毒株HA基因的抗原表位变异情况.结果 68株HA基因进化树显示,广东毒株进化树主干至少分为6大分支;其中2011年毒株聚类为2个(Ⅴ和Ⅵ)主要分支,各具基因特征.变异频率较高的位点包括391、467、202和214位,正向选择位点包括8、145和391;广东毒株抗原表位区发生S145L/P、L208I、Q240R、S160G和G187R位点变异.2009年广东毒株HA基因分支Ⅰ毒株可能于2010年传播到亚洲、欧洲和澳洲地区.结论 广东新型H1N1病毒HA基因变异具有传播特征(Ⅰ)和地区特征(Ⅵ),位于抗原表位Ca、Sa和Sb的氨基酸发生变异,其中位点145等变异频率较高,承受着正向选择压力.     

2009-2011年广东省甲型H1N1流感病毒血凝素基因的进化特征

目的 了解2009-2011年广东甲型H1N1流感病毒血凝素基因的HA1进化特征。方法 选取广东甲型H1N1流感病毒83株,提取病毒RNA,经RT-PCR反应扩增HA1并测序,测定的序列用生物信息软件分析,与GenBank中相关序列比较,并对推导的编码氨基酸序列进行进化分析。结果 2009-2011年广东甲型H1N1流感病毒HA1基因的进化速率是5.2× 10-3,高于人季节性H1N1病毒;变异氨基酸多数位于HA蛋白表面,其中部分位于抗原决定簇;在两例死亡病例分离株HA1的第222位氨基酸发生D222G/D222N变异。结论 遗传进化分析表明,甲型H1N1流感病毒发生了一定程度的变异,造成2011年初在广东的再次流行。HA1的第222位氨基酸变异可能与疾病的严重程度有关。     

一起甲型H1N1流感疫情病原检测及其HA与NA基因特性研究

目的 确认引起一起流感暴发疫情的病原,阐明该病原的血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)的特性.方法 疫情中最早出现流感样症状病例的咽拭子样本用real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感病毒核酸,采用鸡胚分离法进行病毒培养,选取两病毒分离株进行HA和NA核苷酸序列测定,并进行基因特性分析.结果 此次流感疫情是由甲型H1N1流感病毒引起的,其HA和NA基因均与参比毒株的HA和NA基因高度同源,NA基因没有发生H274Y突变.结论 本研究的甲型H1N1流感病毒分离株为疫苗亲本株和中国分离株的类似株,对神经氨酸酶抑制剂类药物(如达菲)敏感.     

1999-2007年佛山市流感病毒活动情况及甲3亚型病毒HA1基因分析

目的总结1999-2007年佛山市流感病毒流行情况,分析甲3亚型（H3N2）毒株流行与其HA1基因进化的关系。方法用MDCK细胞分离流感病毒,培养后血凝阳性者进行型别鉴定。随机抽取每年2～3株甲3亚型毒株的细胞培养物提取RNA后进行HA1基因的逆转录,对其核苷酸和氨基酸序列及亲缘关系进行分析。结果甲型和乙型流感病毒在佛山市人群中同时流行。甲型流感毒株是人群感染流感的主要型别。HA1区氨基酸序列与历年的流感疫苗推荐株相比,点突变率为0.3%～6.08%。发生替换的重要位点包括了抗原决定簇的17个位点、抗体结合部位的10个位点和1个糖基化位点。结论佛山市的甲1和甲3亚型流感毒株活动呈此起彼伏的优势株转换现象。甲3亚型新旧毒株交替迅速,大致按照毒株分离的年代聚类成进化树的不同小侧枝,表明新的流行株出现后可能迅速突破地域局限。提示地区实验室及时监测和研究流感毒株的发生和发展是流感监测网络建设的基础。     

应用巢式RT-PCR扩增HA和NA基因片段并测序鉴定甲型H1N1流感病毒

目的 建立一种利用巢式RT-PCR特异扩增HA和NA基因片段并测序鉴定甲型H1N1流感病毒的技术.方法 设计两套共7条特异引物,通过巢式RT-PCR分别扩增甲型H1N1流感病毒HA和NA基因片段并测序,所得序列与人感染甲型流感病毒主要HA和NA亚型序列进行进化树分析以对结果作进一步鉴定,蛋白序列比对后分析其特征.结果 4例甲型H1N1流感患者流感病毒HA和NA基因RT-PCR扩增均分别得到442 bp和543 bp片段产物.核苷酸序列进化分析表明,该4例患者HA和NA序列分别与2009年爆发的甲型H1N1流感病毒HA及NA序列聚集在一起,与季节性H1、H2、H3、人禽流感H5亚型及季节性N1、N2、人禽流感N1亚型特异分开.蛋白序列分析表明,4例患者流感病毒HA蛋白裂解位点附近氨基酸序列均为PSIQSR↓GLF,不具有高致病性流感病毒的特性,NA蛋白第275位氨基酸为His,未出现H275Y的耐药变异.结论 本方法能特异扩增甲型H1N1流感病毒HA和NA基因片段,测序后可用于甲型H1N1流感病毒的进一步鉴定;同时,得到的序列也可用于流感病毒致病力及耐药性的分析.     

1995-2007年深圳市H1N1流感病毒血凝素基因的序列分析

目的 研究1995-2007年深圳市流行的H1N1流感病毒血凝素(HA)的基因特性.方法 选取在该期间分离培养到的64株H1N1流感病毒,对其进行HA片段核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,用Simmonic软件和Mega软件对其进行分析.结果 深圳市H1N1流感毒株在进化树上可以划分为A、B、C三个分枝.部分2005-2006年毒株与2001年毒株在同一分枝上.通过同源性分析发现部分WHO所推荐的疫苗株在时间上滞后于深圳株.深圳H1N1株的4个抗原决定簇及受体结合位点均发生了氨基酸的替换.除1995年外其余年份的毒株均在137位上发生了氨基酸的缺失.结论 1995-2007年深圳市H1N1毒株氨基酸的变异主要集中在抗原决定簇及受体结合部位.并且抗原决定簇的变异活跃区域随时间的推移发生了转移.     

2004-2008年我国流行的A型流感病毒抗原性及HA1基因特性的研究

目的 了解我国2004-2008年A(H1N1、H3N2)型流感病毒流行情况、抗原性和基因特性变异关系,了解疫苗株与我国流行株之间抗原性变化情况.方法 选择2004年以来我国分离的A(H1N1、H3N2)型流感病毒进行抗原性及HA1区基因序列,通过比对HA1蛋白位点变异情况,分析我国流感病毒抗原性及基因特性变化情况.结果 A(H1N1)亚型流感毒株抗原性2004-2007年分离的A(H1N1)亚型流感病毒的抗原性与疫苗株A/New Caledonia/20/1999(H1N1)类似;2008年我国流行的A(H1N1)亚型毒株的抗原性与2008-2009年北半球的流感疫苗株A/Brisben/59/2007(H1N1)类似.2004-2005年分离的A(H3N2)亚型流感病毒的抗原性与疫苗株A/Fujian/411/12002(H3N2)比较发生了变异;2006-2007年我国流行的H3N2毒株与A/Wiscansin/67/2006(H3N2)类似,2008年我国流行的H3N2毒株与疫苗株A/Brisben/10/2006(H3N2)类似.结论 2004-2008年我国流行的A(H1N1、H3N2)亚型流感病毒的抗原性和基因特性发生了改变.     

2006年广东省流感病毒流行的分子基础

目的了解广东省2006年流行性感冒（流感）流行情况的分子基础。方法选择广东省流感监测网络实验室分离的11株流感毒株,对血凝素基因进行基因和抗原性的分析。此外,还检测人群抗体水平。结果2006年流行的H1N1亚型病毒血凝素蛋白重链（HA1）区氨基酸序列与A/New Caledonia/20/99（H1N1）相比,同源性为95.7%～96.3%,有2个抗原决定簇的氨基酸发生了替换。Victoria系的HA1区基因与B/HongKong/330/2001相比,同源性为97.2%～97.5%,有6个位于抗原决定簇的氨基酸发生了替换,这种变化和B/Malaysia/2506/2004相一致,这在B型的基因种系发生树也得到证实。同时发现人群针对H1N1亚型和B/Victoria的抗体水平较低。结论2006年广东H1N1亚型和B/Victoria系病毒株发生了一定程度的变异,以及人群保护性抗体水平较低,共同造成其在本地的流行。     

金刚烷胺与利巴韦林对不同甲型流感病毒株的体外作用敏感性比较

目的评价金刚烷胺和利巴韦林对不同甲型流感病毒株的体外抑制作用,为临床选择抗流感病毒药物提供实验依据。方法分别接种甲型流感病毒标准实验株[H1H1（A/PR/8/34、A/FM1/47）,H3N2（A/Aichi/2/1968）]和临床分离株[H1N1（A/Guangzhou/GIRD02/2009、A/Guangzhou/GIRD166/2009）,H3N2（A/Guangzhou/GIRD18/2009、A/Guangzhou/GIRD26/2009）],于狗肾细胞（MDCK）,采用空斑试验观察金刚烷胺和利巴韦林对甲1和甲3型流感病毒不同实验株和分离株的敏感性。对测试毒株的MP基因进行序列测定和分析,了解金刚烷胺的药物敏感性。结果金刚烷胺在MDCK细胞的半数毒性浓度（TC50）为335μg/ml,对部分甲型流感病毒标准实验株[A/FM1/47（H1N1）、A/Aichi/2/1968（H3N2）]及临床分离株[A/Guangzhou/GIRD02/2009（H1N1）]有抑制作用（半数有效浓度IC50分别为14.9、20.1、16.8μg/ml）。利巴韦林的TC50为2.05mg/ml,对测试的所有毒株均有抑制作用（IC50为6.8～37μg/ml）。金刚烷胺耐药毒株均为单位点突变（第31位的丝氨酸S置换为天冬酰胺N,S31N）。结论甲型流感病毒对金刚烷胺较易出现耐药,而利巴韦林体外对金刚烷胺敏感株和耐药株均有显著的抑制作用,临床抗流感病毒治疗时可考虑应用。     

Genetic analysis of HA gene of pandemic H1N1 2009 influenza viruses circulating in India

The H1N1 2009 influenza pandemic took the health care workers by surprise in spite of warning about influenza pandemic. Influenza A virus has the ability to overcome immunity from previous infections through the acquisition of genetic changes by shift or drift. Thus, understanding the evolution of the viruses in human is important for the surveillance and the selection of vaccine strains. A total of 23 pandemic A/H1N1 2009 viral HA gene sequences were downloaded from NCBI submitted during March and May 2010 by NIV and were analysed. Along with that the vaccine strain A/California/07/2009 was also downloaded from NCBI. All the sequences were used to analyse the evolution of the haemagglutinin (HA) by phylogenetic analysis. The HA gene could be divided into four groups with shift from 1 to lV revealing that the HA genes of the influenza A viruses evolved in a sequential way, in comparison to vaccine strain A/California/07/2009. Amino acid sequence analysis of the HA genes of the A/H1N1 2009 isolates, revealed mutations at positions 100, 220 and additional mutations in different positions 114, 171, 179, 190, 208, 219, 222, 239, 240, 247, 251, 260 and 285 .The mutations identified showed the adaptation of the new virus to the host that could lead to genetic changes inherent to the virus resulting in a reassortant which could be catastrophic, hence continuous monitoring of strains is mandatory.     

重庆市2009-2010年流行性感冒流行特征及监测结果分析

目的分析2009-2010年重庆市流感流行特征和监测结果,为控制流感提供科学依据。方法收集重庆市流感疫情资料、流感样病例监测资料、病原学资料和暴发疫情资料,并对资料进行分析。结果 2009-2010年重庆市出现流感流行,流行高峰集中在2009年9～10月,流行优势毒株为新甲型H1N1亚型,2010年1月以来则以季节性B型为主。城区监测点病毒分离阳性率显著高于农村监测点（χ2=133.04,P〈0.001）。聚集和暴发疫情主要集中在学校（96%）,流感疫情高发时间和病原学检测结果与监测情况一致。结论甲型H1N1流感在2009年出现流行并成为优势株,进入2010年B型流感活动加强,应及时加强流感样病例监测和病原学监测工作,防止出现流行。     

Genetic diversity of HA1 domain of hemagglutinin gene of pandemic influenza H1N1pdm09 viruses in New Delhi, India

Genetic analysis of pandemic 2009 influenza A (H1N1; H1N1pdm09) virus was undertaken to understand virus evolution during 2009 and 2010 in India. Surveillance of influenza viruses from July 2009 to December 2010 revealed major peaks of circulating H1N1pdm09 viruses in August–September and December–January 2009 and then in August–September 2010. To understand the diversity of the H1N1pdm09 virus, selected specimens (n = 23) from 2009 or 2010 were characterized by nucleotide sequence determination of the HA1 subunit of the HA gene. Phylogenetic analysis revealed that 22 clustered with clade 7 viruses characterized by S203T mutations, whereas one virus from 2010 fell within clade 6. None of the viruses from either 2009 or 2010 formed a monophyletic group, suggesting a continuum of independent introduction of circulating viral strains. Amino acid analysis revealed minor amino acid changes in the antigenic or receptor‐binding domains. Importantly, we observed mutations that were also present in 1918 pandemic virus, which includes S183P in 4 and S185T mutation in 3 of 13 viruses analyzed from 2010, while none of the 2009 viruses carried these mutations. Whether antibody‐mediated pressure is imposing such changes remains to be determined. Continued genetic surveillance is warranted to monitor pathogenicity as the virus evolves to acquire new features. J. Med. Virol. 84:386–393, 2012. © 2011 Wiley Periodicals, Inc.     

深圳地区甲1(H1N1)亚型流感病毒基因特性的研究

目的　了解近几年H1N1亚型毒株在深圳地区人群中活动加强及“O”相特性出现的分子生物学基础及其基因演变的特性。方法　病毒粒RNA经逆转录合成cDNA,用PCR扩增,产物纯化,采用双脱氧链末端终止法进行核苷酸序列测定并推导出其所编码的氨基酸序列。进化树分析用DNASTAR公司出品的序列分析软件,MegAlign(103版)的Editseq(369版)。结果　根据病毒粒HA1基因特性,至少1995年以来深圳地区人群中同时流行着基因特性不同的三系毒株;1995～1997年H1N1毒株与A新加坡686(H1N1)病毒相比较,其HA1蛋白分子上第54和155位上分别插入和缺失一个糖基化点,同时氨基酸序列发生了替换。结论　近年来深圳地区人群中同时流行着HA1基因不同的三系H1N1亚型毒株。由于HA1蛋白分子上氨基酸序列发生了替换,尤其糖基化位点插入和缺失,造成1995年以来H1N1毒株活动加强,这些可能与毒株“O”相特性再现密切相关。