登革病毒1～4型E蛋白结构域Ⅲ融合蛋白的表达纯化及功能研究

目的 了解原核表达的登革病毒（Dengue virus,DV）1～4型融合的E蛋白结构域Ⅲ直接抑制登革病毒感染及其抗体的中和作用.方法 通过连接肽将1～4型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区串联的基因产物插入PET30a在大肠埃希菌中进行表达、纯化后,应用Western Blot及间接ELISA验证表达产物.将融合蛋白免疫新西兰大白兔制备免疫血清,应用间接免疫荧光检测多抗血清的活性.将融合蛋白及多抗血清分别进行阻断实验和中和实验,对抗原及抗体的功能进行研究.结果 在大肠埃希菌中成功表达了串联的登革病毒1～4型E蛋白结构域Ⅲ融合蛋白,并得到兔抗免疫血清,分别对融合蛋白及兔抗免疫血清进行验证.融合蛋白能够阻断1～4型DV感染,兔抗免疫血清能中和1～4型DV,但中和抗体效价不同.结论 串联表达的登革病毒包膜蛋白Ⅲ区可抑制登革病毒感染,串联rEⅢ蛋白免疫新西兰大白兔产生的针对DV1～4型包膜蛋白结构域Ⅲ区的抗体对登革病毒具有中和作用.     

利用昆虫-杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16型L1蛋白

目的 获得人乳头瘤病毒16型（Human papillomavirus type 16,HPV16)L1蛋白。方法 以pFB1为载体构建HPV16L1杆状病毒表达质 ,并感染昆虫细胞Sf9结果 收集27℃,培养72h的感染重组病毒的Sf9,提取细胞蛋白。经SDS－PAGE蛋白电泳分析,发现有一相对分子质量为56000的蛋白表达,Western blot证实所表达的蛋白为HPV16L1。结论 昆虫一杆状病毒表达系统可有效地表达HPV16L1蛋白。     

新型呼肠病毒S1基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建新型呼肠病毒主要抗原蛋白盯1蛋白的真核表达质粒,研究其在真核细胞内的表达。方法将s1基因克隆人真核表达载体pCAGGS／MCS,构建真核表达质粒pc—s并转染~ero细胞。通过SDS—PAGE和Western—Blot试验,对转染后24,48及72h的细胞内蛋白表达进行研究。结果酶切分析表明重组质粒构建成功。SDS—PAGE和Western—Blot的检测结果一致表明,转染后s1基因可在Vero细胞内表达且72h的细胞内蛋白表达量最高。结论通过构建重组真核表达质粒,可使s1基因在真核细胞内高效表达,为进一步研究新型呼肠病毒与宿主受体的相互作用打下基础。     

人乳头瘤病毒58型L1壳蛋白在原核细胞中的高效表达及抗体制备

目的 人乳头瘤病毒58型（HPV58）是重要的高度致瘤性病毒之一。用原核细胞表达HPV58L1主要壳蛋白（McP）,并制备相应抗体血清,为基因工程疫苗研制打下基础。方法 用聚合酶链反应(PCR）扩增HPV58L1完整编码区基因,并克隆、测序。构建原核表达载体pRSETB58L1,表达的L1蛋白经SDS－PAGE纯化,免疫BALB／c小鼠。结果 在原核细胞中表达了HPV58L1壳蛋白,该壳蛋白的相对分子质量为60000,此蛋白与HPV16L1抗有交叉反应。获得抗HPV58L1壳蛋白特异性抗体,抗体滴度为1：80,并用该抗体屯昆虫细胞中表达的HPV58L1壳蛋白。结论 HPV58壳蛋白在原核细胞中获得的有效表达,纯化免疫小鼠后能产生抗HPV58L1特异性抗体,此抗体可用于鉴定真核细胞表达的HPV58L1壳蛋白。     

原发性肝癌患者PD-1基因拷贝数及其转录和蛋白表达水平的研究

目的 检测原发性肝癌患者PD-1基因拷贝数及其转录和蛋白表达水平,研究宿主免疫调节因子PD-1基因拷贝数差异与肝癌的相关性.方法 采用实时荧光定量PCR法检测24例原发性肝癌患者PD-1基因拷贝数和外周血单个核细胞PD-1 mRNA表达水平,采用流式细胞术检测外周血CD8+T细胞PD-1蛋白表达水平.对照组为26例血清抗-HBs阳性健康者.结果 肝癌组和对照组PD-1基因单拷贝率分别为34.62％和4.17％,多拷贝率分别为61.54％和95.83％,两组间分布差异有统计学意义(x2 =7.639,P=0.006),肝癌组人群PD-1基因多倍体率显著高于对照组.PD-1mRNA表达平均值对照组为2.35E-03,肝癌组为1.23E-03,Mann-whitey检验比较两组间表达差异有统计学意义,肝癌组明显低于健康对照组(U=153,P=0.009);CD8+T细胞PD-1蛋白表达频率对照组(3.72±0.32),肝癌组PD-1表达频率(16.13±1.68),肝癌组PD-1表达比健康对照组高,差异有统计学意义(t=-7.073,P=0.000).结论 PD-1基因多拷贝可能是HBV感染者发生肝癌的高危因素.PD-1基因拷贝数差异与原发性肝癌的关系值得进一步研究.     

HIV-1 C亚型Gp120蛋白表达、纯化及其抗体制备的研究

目的 制备HIV-1 C亚型Gp120蛋白及其抗体.方法 用PCR技术从表达C亚型HIV-1全长gp16O基因的质粒上扩增gP120基因羧基末端部分片段,其长度为612个核苷酸,编码204个氨基酸.将测序鉴定正确的gp120基因片段克隆到原核表达载体pET-30a上,以包涵体的形式在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,Gp120蛋白C端融合6×His标签便于纯化.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备C亚型Gp120特异性兔多克隆抗体,用间接ELISA法测定抗体滴度,并用Western Blot方法验证该抗体是否可识别在哺乳动物细胞内表达的C亚型Gp160蛋白.结果 成功地获得高纯度的C亚型Gp120融合蛋白,用其制备的多克隆抗体滴度可达1:204 800,该抗体可特异性识别在COS-1细胞中瞬时表达的C亚型Gp160蛋白.结论 获得了高纯度的C亚型Gp120融合蛋白及其高效价的抗体.     

H5N1-NP蛋白的原核表达及与宿主蛋白相互作用的初步研究

目的 原核表达并纯化禽流感病毒A/Anhui/1/2005（H5N1）的NP蛋白,并筛选人支气管上皮BEAS-2B细胞总蛋白中能够与纯化的NP蛋白相互作用的蛋白.方法 一方面,构建了含有NP基因的原核表达质粒pET30a-NP,并在大肠埃希菌中获得了可溶性表达.亲和层析和离子交换层析两步对NP蛋白进行纯化.另一方面,制备了BEAS-2B细胞总蛋白.在此基础上,联合应用Pull-down与LC-MS/MS技术来筛选并确认细胞中与纯化的NP蛋白相互作用的成分.结果 构建的pET30a-NP质粒在IPTG诱导下在原核细胞中实现了可溶表达,经过两步纯化后,得到可溶的NP蛋白纯品.Pull-down与LC-MS/MS技术初步筛选到BEAS-2B细胞中20个可能与NP蛋白相互作用的细胞蛋白.还需要进一步的实验来验证他们和NP蛋白之间的相互作用.结论 获得了高纯度的可溶NP蛋白及筛选到20个可能与其相互作用的BEAS-2B细胞候选蛋白.     

丙型肝炎病毒亚单位融合蛋白的表达及免疫原性测定

目的获得高纯度的丙型肝炎亚单位融合蛋白并评价其免疫原性。方法利用原核表达系统,以pET—11d作为载体,在大肠埃希菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达获得融合蛋白,之后采用DEAE阴离子交换和镍离子柱亲和层析进行纯化。通过Western Blot验证融合蛋白的抗原活性。同时以该蛋白免疫实验动物后测定血清中的抗体滴度。结果成功获得很高纯度的丙型肝炎亚单位融合蛋白,EIA显示融合蛋白能够诱生出高滴度的抗体。结论原核表达系统表达的丙型肝炎病毒亚单位融合蛋白具有较强的免疫原性,为丙型肝炎病毒治疗性和预防性疫苗的研制提供了一条新的途径。     

氯通道ClC-2融合蛋白的原核表达及体外磷酸化

目的：检测ClC-2是否能被促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化，为进一步研究其在细胞增殖、分化过程中的调控机制提供基础。方法：从含有家兔ClC-2cDNA的质粒pSPORT1中PCR扩增ClC-2胞浆内的羧基端DNA编码序列，构建重组载体pGEX-4T-1／ClC-2CT；重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株；经异丙基β-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导后，通过Gluthathion Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白；并行融合蛋白的体外磷酸化实验。结果：酶切、测序鉴定重组载体pGEX-4T-1／ClC-2CT构建正确，并纯化得到GST／ClC-2CT融合蛋白。而且该融合蛋白能被MAPK磷酸化，而GST不能被MAPK磷酸化。结论：氯通道ClC-2能被MAPK磷酸化。     

PD-L1重组蛋白的表达及生物学活性分析

目的 构建细胞程序死亡因子1配体1(PD-L1)的重组表达质粒,在原核系统中表达并分析其生物学活性.方法 经密码子优化后合成PD-L1全基因序列,构建硫氧还原蛋白-pET43b/(PD-L1)重组表达质粒并在大肠埃希菌中表达;用ELISA验证表达产物与其受体结合的生物学活性.结果 正确构建了PD-L1重组表达质粒及其大肠埃菌基因工程菌,能稳定、高效地表达目的 蛋白,相对分子质量为47×103,目的 蛋白能与其受体特异性结合.结论 成功获得有生物学活性的PD-L1重组蛋白,为研制单克隆抗体及其与病毒感染慢性化的关系提供基础条件.     

杆状病毒为载体的重组汉坦病毒S基因在Vero—E6细胞中的表达及其生物活性

目的 将汉坦病毒HV Z10株S基因（HV5）插入已含CMV基因的杆状病毒转移载体pDual-CMV,筛选重组杆状病毒BAC-pDual-CMV-HVS,转化Vero-E6细胞,用于血清汉坦病毒抗体的检测。方法 以pEGFP-N1质粒为模板,通过PCR扩增CMV基因序列,酶切插入杆状病毒转移载体pFastTBacDUAL,构建含CMV的转移载体pDual-CMV。酶切含HV S基因的pMD19-Z10S质粒,插入pDual-CMV,构建pDual-CMV-HVS,转化感受态DH10BAC,筛选并取重组杆状病毒基因,转染TN细胞,筛选重组杆状病毒BAC-pDual-CMV-HVS。BAC-pDual-CMV-HVS转化Vero-E6细胞,制备抗原片,用于血清中抗汉坦病毒抗体的检测并与传统方法进行比较。结果 经测序成功构建重组杆状病毒转移载体pDual-CMV-HVS,按杆状病毒表达系统操作方法,成功筛选BAC-pDual-CMV-HVS,转化VeroE6细胞,经汉坦病毒抗体阳性血清检测,HV S基因在细胞中得到表达,与传统方法一致。结论 成功筛选BAC-pDual-CMV-HVS重组杆状病毒,可用于汉坦病毒抗原片的制备,该抗原片制备方法简便、无需特殊设备,可用汉坦病毒抗体的检测。     

HCV E1基因序列的原核高效表达及表达产物的初步应用

目的 在原核表达系统中对HCV E1基因进行克隆和高效表达,并初步探讨表达产物在抗－HCV筛选中的作用。方法 通过RT－PCR法从HCV RNA阳性的血清标本中扩增出HCV E1片段,并在扩增用的引物中引入克隆所需的酶切位点,克隆产物经Xba I和EcoR I酶切后,在T4DNA连接酶的作用下克降人经同样双酶切的原核表达载体PMS－31b中,并用此连接产物转化大肠埃杀菌POP2136,挑取具有氨苄抗性的菌东扩大培养后提取质粒进行酶切鉴定,鉴定出的阳性菌经42℃诱导后用SDS－PAGE检查其表达状况,并用Western blot鉴定表达产物有特异性,同时用初步纯化的表达产物用ELISA法检测病人血清。结果 经Sma I酶切后PCR产物被切成144bp和356bp的两个片段,在具有氨苄抗性的菌中提取的质粒经Sma I和Xba I酶切后产生了一356bp的片段;42℃诱导后在SDS－PAGE中出现了一条相对分子质量为31000的条带,其表达量约为17％,经Western blot鉴定后在该处出现了阳性信号;ELISA实验显示在抗HCV阳性的血清中的阳性率约为29．8％（26／90）,而在抗HCV阴性的 血清中其阳性率约为3．9％（3／76）。结论 通过RT－PCR方法将HCV E1基因从HCV RNA阳性的血清标本中调出,构建了HCV E1的原核表达载体－PMS－E1,其表达量为17％,表达产物具有良好的特异性,有望应用于抗HCV的检测中。     

人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及其真核表达的研究

目的　克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白（ ＭＣＰ） 的ｃＤＮＡ,并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法　应用ＲＴＰＣＲ 方法,从Ｕ９３７ 细胞总ＲＮＡ 中扩增编码人ＭＣＰ 分子的ｃＤＮＡ片段, 快速克隆于ｐＧＥＭＴＥａｓｙ 载体,测定其序列。将该片段重组于ｐＬＸＳＮ 载体,电穿孔转染ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞,经ＦＡＣＳ 检测筛选表达ＭＣＰ 的阳性细胞克隆,用补体溶破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果　ＲＴＰＣＲ 扩增得到１ １４４ｂｐ 的编码人ＭＣＰ 分子的ｃＤＮＡ 片段,序列分析表明该ｃＤＮＡ编码的蛋白为ＳＴＣ＋ ＣＹＴ２ 亚型。细胞转染筛选获得多个表达ＭＣＰ 的ＮＩＨ３Ｔ３ 阳性细胞克隆,补体溶破试验证实其具有抑制人补体经典途径和旁路途径溶破的功能。结论　本研究为进一步探讨不同亚型结构的ＭＣＰ 分子与功能的关系及其应用奠定了基础。     

EB病毒潜伏膜蛋白2重组逆转录病毒的构建及表达

目的　寻找在真核细胞中表达Epstein Barr(EB)病毒潜伏膜蛋白 2 (Latentmembraneprotein 2 ,LMP2 )的有效途径 ,研究LMP2蛋白功能及深入探讨其在诱导细胞免疫应答中的作用。方法　将EB病毒LMP2蛋白的基因重组至逆转录病毒载体LXSN上 ,通过脂质体将重组质粒导入PT6 7细胞 ,G418筛选抗性克隆 ,收集含重组病毒的上清 ,将其感染小鼠成纤维细胞NIH 3T3 ,测定病毒滴度 ,提取转染细胞DNA进行PCR鉴定 ,间接免疫荧光法检测外源基因在感染病毒的NIH 3T3中的表达。结果　培养上清的病毒滴度为 5 .8× 10 5 PFU ml,聚合酶链反应 (PCR)结果证实 ,转染细胞的DNA中含有目的基因的特异性片段。免疫荧光结果表明EBV LMP2基因在小鼠成纤维细胞中获得表达。结论　重组逆转录病毒成功地将EB病毒LMP2基因整合到细胞中并得以表达     

GST-hVinexin融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建GST-hVinexin融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法从COS-7细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hVinexin基因全长,通过BamHI和SalI酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hVinexin,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。结果电泳后酶切结果证实hVinexin大小为990bp,测序证明成功构建了原核表达质粒GST-hVinexin,并诱导表达GST-hVinexin融合蛋白,进一步用Western blot方法验证了其融合蛋白的表达。结论成功构建了GST-hVinexin原核表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌表达,为进一步纯化Vinexin及研究其结构与功能提供了前提基础。     

云南省陇川县HIV-1流行毒株膜蛋白基因C2-V3区序列测定和分析

使用ＰＣＲ对２１份采集于１９９５年中的云南陇川县ＨＩＶ－１阳性静脉吸毒者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）样品进行扩增，从１７份样品中获得了ＨＩＶ－１膜蛋白（ｅｎｖ）基因的核酸片段，并对其Ｃ２－Ｖ３及邻区４５０个核苷酸序列进行了测定和分析。研究结果表明，１７份陇川样品中存在Ｂ和Ｃ两种亚型的ＨＩＶ－１毒株序列，各亚型内的基因离散率分别为４．７％和３．３％。与Ａ～Ｅ参考亚型及部分Ｂ和Ｃ亚型代表株序列相比较，属陇川Ｂ亚型的１４个毒株与包括泰国、缅甸及云南瑞丽在内的Ｂ亚型毒株序列十分接近，基因离散率在３．９％～４．５％的范围内；属陇川Ｃ亚型的３个毒株则与代表印度毒株的Ｃ亚型共享序列及瑞丽Ｃ亚型毒株序列十分相似，其基因离散率均为２．５％。以上数据提示，ＨＩＶ－１在陇川的流行时间不长，且Ｂ和Ｃ亚型毒株的传入时间相差１年左右。对Ｂ亚型毒株Ｖ３环序列的分析还发现，位于Ｖ３环顶端的四肽序列中ＧＰＧＱ占６４．３％，ＧＰＧＲ则仅占２８．６％，且编码其精氨酸（Ｒ）的密码子均为ＣＧＡ而不是ＡＧＡ。此结果与作者根据早期瑞丽ＨＩＶ－１毒株序列研究结果得出的推测相吻合。