实时荧光定量PCR检测BCR-ABL融合基因的临床意义

目的探讨BCR-ABL(P210型)融合基因的检测在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)诊断和预后判断、监测CML残留病灶等方面的重要意义。方法采集邯郸市中心医院慢性粒细胞白血病患者骨髓或外周血,用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RQ-PCR)方法检测BCR-ABL P210型融合基因,其中男43例,女27例,年龄从18到64岁。正常对照30例。结果 BCR-ABL P210融合基因阳性的结果58例,其比率为82.9%。BCR-ABL P210融合基因阴性的结果12例,其比率为17.1%。正常对照30例均为阴性结果。在慢性粒细胞白血病患者中BCR-ABL P210融合基因阳性检出与阴性检出差异有显著性意义(P0.05)。结论对于慢性粒细胞白血病患者进行BCR-ABL P210融合基因的检测,有利于其早期诊断。实时荧光定量PCR技术检测BCR-ABL融合基因准确可靠,对于评价疗效、监测微小残留病变(minimal residual disease,MRD)以及预测疾病进展具有重要的临床应用价值。     

实时荧光定量PCR的应用体会

对于病毒的监测和疾病的诊断,定性检测已不能满足临床需要,实时荧光定量PCR技术(realtime quantitative PCR)于1996年由美国Aplied Biosystems公司推出.     

实时荧光定量PCR检测幼儿腹泻腺病毒

目的:建立实时荧光定量PCR方法,并检测腺病毒Ad40或Ad41感染的粪便标本。方法:用T-A克隆技术构建含腺病毒基因的载体作为标准模板,采用Taqman探针标记技术,建立实时荧光定量PCR方法。采集幼儿腹泻标本248例,分别用直接免疫荧光法和实时荧光定量PCR检测腺病毒Ad40和Ad41,比较两种方法的阳性检出率。结果:实时荧光定量PCR灵敏度和准确度(95.60%和96.80%)均高于直接免疫荧光法(78.5%和82.40%)(P0.05),而两者特异度差异无统计学意义(97.30%vs 96.70%,P0.05)。248例待检样本,直接免疫荧光法检出率为2.42%(6/248),实时荧光定量PCR检出率为7.66%(19/248),明显高于直接免疫荧光法(χ2=3.675,P0.05)。结论:成功建立实时荧光定量PCR检测腺病毒Ad40或Ad41方法。其灵敏度、准确度和阳性检出率经均优于直接免疫荧光法,且简便快速。     

实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的研究

目的采用TaqMan探针建立检测沙眼衣原体的实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法。方法根据沙眼衣原体外膜蛋白A的基因（ompA）序列设计引物和探针,以克隆的ompA部分基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量检测方法。结果建立的荧光定量PCR检测方法的最低检出限为5 copies/反应,检测线性范围100～107线性关系良好（r2=0.997）,比巢式PCR敏感100倍;且与鹦鹉热衣原体、淋球菌、解脲脲原体、大肠杆菌等病原菌DNA以及人基因组DNA均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。以巢式PCR作参比,建立的荧光定量PCR法检测沙眼衣原体的阳性符合率为100.00%,阴性符合率为95.09%,总符合率为96.81%。结论建立的检测沙眼衣原体实时荧光定量PCR具有特异性强和敏感性高的特点,可快速检测样本中微量沙眼衣原体DNA,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选。     

实时荧光定量PCR分析脐血T细胞亚群中TRECs水平

近期研究发现成人胸腺仍存在活化T细胞合成的功能，胸腺近期功能需要通过测定胸腺近期输出的幼稚(Naive)T细胞的数量来衡量。而能够作为Naive T细胞的标志的是T细胞受体删除DNA环(T-cell receptor excision DNA circles，TRECs)。我们的前期研究也提供了正常人外周血T细胞和胸腺细胞中TRECs含量的情况，本研究进一步分析脐血中不同组分T细胞的TRECs含量特点。     

实时荧光定量PCR检测常见性传播疾病病原体基因

目的;用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术准确定量检测常见性病病原体基因,为临床治疗提供依据.方法采用实时FQ-PCR技术,检测了临床送检标本3641份.结果淋球菌(NGH)1416份、沙眼衣原体(CT)1165份、解脲支原体(UU)765份,人乳头瘤病毒(HPV6.11)214份、梅毒螺旋体(TP)81份,阳性率分别为26%(368/1416)、27%(315/1165)、36.5%(279/765)、77%(165/214)、21%(17/81).阳性率差异有高度显著性(P＜0.001).NGH、CT、UU、HPV6.11、TP阳性标本DNA平均拷贝数2.3×106、8.5×105、2.4×104、5.6×107、3.8×105.146例治疗后复查,其转阴率为NGH63.9%(39)、CT70%(33)、UU44.7%(17).治疗后复查转阴率差异有显著性(P＜0.05),其DNA拷贝平均数有明显下降.结论实时FQ-PCR技术检测常见性病病原体基因,具有简便、快捷、特异性高、定量准确等优点,对其诊断和治疗有指导意义.     

实时荧光定量PCR快速分子诊断唐氏综合征

目的　探讨快速诊断唐氏综合征的检测方法 .方法　采用实时荧光定量PCR技术 ,检测唐氏患者 2 3例、正常人 33例 ,定量分析比较ΔCt值 .结果　正常组和唐氏组ΔCt值有显著性差异 (p <0 .0 0 1) ,并建立了相应的参考值范围 .结论　实时荧光定量PCR具有简单、快速、特异性高等优点 ,可用于快速诊断唐氏综合征     

肾移植后BK病毒感染者实时荧光定量PCR检测

背景：对于BK病毒感染、BK病毒相关性肾病的认识缺乏规范的实验室诊断程序和标准化的无创性检验方法。 目的：建立肾移植后患者尿液和外周血BK病毒感染负荷实时荧光定量PCR检测方法。 方法：针对BK病毒基因组,自主设计特异性引物BKV-F和BKV-R,Taqman荧光探针BKV-P,Taqman荧光探针BKV-P的5’端标记有荧光基团,在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团;然后处理待测样本,进行PCR反应。 结果与结论：将检测阳性的扩增产物进行基因测序,测序结果经BLAST比对后证实为BK病毒基因序列;利用上述方法对56份样本进行检测,其中,20份BK病毒血清样本及20份BK病毒尿液样本检测均为阳性,有S型扩增曲线。动态范围测定显示在103~1010 copies/mL之间标准曲线具有良好的相关性。5份健康人尿液样本,5份血液样本及6份临床常见的其他病原体血液样本检测均为阴性,无S型扩增曲线。结果表明该方法可进行定性、定量检测,特异性好,反应快速,一般30 min即可得到反应结果,并且成本低、假阳性少。     

实时荧光定量PCR快速分子诊断唐氏综合征

目的探讨快速诊断唐氏综合征的检测方法.方法采用实时荧光定量PCR技术,检测唐氏患者23例、正常人33例,定量分析比较ΔCt值.结果正常组和唐氏组ΔCt值有显著性差异(p<0.001),并建立了相应的参考值范围.结论实时荧光定量PCR具有简单、快速、特异性高等优点,可用于快速诊断唐氏综合征.     

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

目的在传统产物增强性反转录酶（PERT）活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法。方法以噬菌体MS2RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶（1×10-1～1×10-9U/μl）标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性。同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度。结果将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值。不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl。结论成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标。     

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

目的 在传统产物增强性反转录酶(PERT)活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法.方法 以噬菌体MS2 RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶(1×10-1～1×10-9 U/μl)标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA.采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性.同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度.结果 将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值.不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7 U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112 bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl.结论 成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标.     

实时荧光定量PCR在医学遗传学方面的应用

实时荧光定量PCR是近年来发明使用的一种核酸检测技术，因高精确度、高灵敏性、污染少^[2,3]等优点已在生物医学基础科研及医学临床中得到广泛应用，本文就其在遗传学方面的应用作简要综述。     

实时荧光定量PCR在医学遗传学方面的应用

实时荧光定量 PCR是近年来发明使用的一种核酸检测技术 ,因高精确度、高灵敏性、污染少 [2 ,3]等优点已在生物医学基础科研及医学临床中得到广泛应用 ,本文就其在遗传学方面的应用作简要综述     

利用双色实时荧光定量PCR法快速进行产前诊断

目的利用双色实时荧光定量PCR法进行21-三体与18-三体的快速产前诊断。方法分别以21号的APP基因与18号染色体的TYMS基因为目的基因设计引物和不同荧光标记的Taqman探针,以相对定量指标△CT值判断21号与18号染色体的数目;并将其检测结果与传统染色体核型分析方法进行对比。结果60例羊水细胞区分出了4例21-三体,3例18三体标本,正常人的△CT值为-0．89±0．22,21-三体患者及18-三体患者的ACT值分别-0．04±0．17和-1．55±0．24,患者与正常人标本组之间无交叉重叠,均有明显差异（P〈0．001）。结论实验建立的双重实时荧光定量PCR能用于快速诊断羊水细胞的21-三体和18-三体等非整倍体。     

应用实时荧光定量PCR快速分子诊断唐氏综合征

目的探讨一种快速、准确诊断唐氏综合征的方法。方法采用实时荧光定量PCR技术，对25例唐氏患者、50名正常人外周血标本，扩增21号及1号、19号染色体上的多态位点，定量分析比较正常组及唐氏患者组的4对△Ct值。结果唐氏患者组△Ct值明显低于正常组，两组比较差异有统计学意义（P〈0．001）。初步建立了临床应用的参考值范围，可以有效区分出唐氏样本和正常样本。结论应用实时荧光定量PCR技术可快速、准确诊断唐氏综合征，为唐氏综合征的快速产前诊断开辟了新的途径。     

实时荧光定量PCR检测人乳头瘤状病毒基因

目的了解妇女中人乳头瘤状病毒（HPV）的感染率,为有效防治宫颈疾病发生提供依据。方法采用实时荧光定量PCR检测技术对401例本院妇产科门诊就诊疑似HPV感染者取宫颈分泌物,进行HPV6、11型和HPV16、18型检测。结果总阳性率36.66%,其中HPV6、11型阳性率43.02%,HPV16、18型阳性率24.26%,同时做HPV6、11型和HPV16、18型检测,阳性率14.71%。并且半数妇女年龄集中在25-45岁之间。结论女性感染HPV非常普遍,应给予高度重视。     

实时荧光定量PCR技术在致病菌检测中的应用

目的本文将实时荧光定量PCR(Real-time Q-PCR)法检查致病菌与细菌培养法作比较,探讨对指导临床诊断治疗的意义。方法采用Real-time Q-PCR法和细菌培养法对100份标本进行6个微生物项目的检测,并比较两种方法的灵敏度、特异性和准确性。结果 Real-time Q-PCR法检测结果与细菌培养法,除完全符合的19例标本之外,另有8例用细菌培养法为阴性的标本,用Real-time Q-PCR法检测为阳性。结论 Real-time Q-PCR法较细菌培养法具有准确性好、灵敏度高、特异性强和检测快速等优点,是快速筛查致病菌的理想检测方法之一。     

实时荧光定量PCR检测乳腺癌SOCS2基因表达

目的检测乳腺良恶性组织中细胞因子信号转导抑制因子（supressors of cytokine signaling,SOCS2）的mRNA表达及其临床病理意义。方法以18SrRNA为内j对照采用实时荧光定量PCR法,定量测定新鲜乳腺癌组织、癌旁组织和乳腺良性增生组织中。SOCS2 mRNA的表达并分析其与临床病理指标的关系。结果各组阳性率：乳腺癌35.00％（14／40）、癌旁乳腺组织100％（15／15）和乳腺良性增生组织81.25％（13／16）,其表达之间的差异具有统计学意义（P〈0．05）;乳腺癌组织的SOCS2表达水平与TNM分期和淋巴结转移呈明显的相关性（P〈0,05）。结论SOCS2在乳腺癌中的表达可能提示患者具有较好的预后。     

实时荧光定量PCR在检测人ANP基因表达的应用

目的建立心房钠尿肽（ANP）基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行初步评价。方法以基因表达产物为模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,对样本中的心房钠尿肽含量进行相对定量,比较不同样本组的基因表达水平。结果所建立的实时荧光定量PCR方法熔解曲线中熔解峰单一。肺癌患者胸腔样本的ANP含量为对照样本的4.68倍,血清样本为对照样本的16.03倍。结论所建立的ANP实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性。肺癌患者胸腔液和血清中ANP的含量明显增高。     

实时荧光定量PCR技术的理论研究及其医学应用

背景:实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目的:对实时荧光定量PCR的理论进行研究并探讨其在医学方面的应用和进展。方法:以real-time fluorescence quota PCR,theorem,application为检索词,检索PubMed数据库(2000-01/2008-12)。以实时荧光定量PCR,原理,应用为检索词,检索万方数据库(2000-01/2008-12),清华同方中文系列数据库(2000-01/2008-12)。文献检索语种限制为英文和中文。以细胞因子和肿瘤耐药基因的表达为评价指标。纳入实时荧光定量PCR技术的方法学研究和实时荧光定量PCR技术的医学应用研究。排除重复性研究和Meta分析。结果与结论:实时荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点,成为分子生物学研究中的重要工具。实时荧光定量PCR的应用范围非常广泛,包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定等,已广泛应用于医学临床,它能对结核分枝杆菌、乙型、丙型肝炎、爱滋病病毒、淋球菌、沙眼衣原体等病原体进行准确的定量检测。其定量范围极宽,无需做梯度稀释,特异性更强,克服了假阳性。由于传统的PCR技术不能准确定量,使其在实际应用方面受到很大限制。因此,对PCR产物进行准确定量,尤其是病毒性病原的动态监控,成为迫切需要。