抗Doppel蛋白(叠朊蛋白)单克隆抗体细胞系的建立及其初步鉴定

鼠Ｄｏｐｐｅｌ蛋白（叠朊蛋白）是一种新发现的朊蛋白样糖蛋白（ＰｒＰ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ），糖基化前的分子质量（Ｍｒ）约为１５　０００，在幼年动物的小脑与成年动物的睾丸和心脏有高水平的表达，其编码基因（Ｐｒｎｄ）位于相应朊蛋白基因（Ｐｒｎｐ）下游１６　ｋｂ处（人的则在下游２７　ｋｂ处），与Ｐｒｎｐ编码蛋白ＰｒＰ的Ｃ端２／３序列有２４％的同源性，共编码１７９个氨基酸［１］，含２个糖基化位点，并由糖基磷脂酰肌醇（ＧＰＩ）锚定于细胞膜表面［２］。虽然Ｄｏｐｐｅｌ蛋白的功能目前尚不十分清楚，但已…     

人CD19分子胞外区在大肠杆菌中的表达研究

本实验应用计算机优化设计，利用ＰＣＲ 和分子克隆技术，以ｐＵＣ１９／ＣＤ１９ 重组质粒为模板，扩增出人ＣＤ１９ 分子的胞外区基因，并与表达载体相连，经３０ ℃扩增菌体，４２ ℃诱导，实现了在Ｅ－ｃｏｌｉ 中融合表达相对分子质量（ Ｍｒ） 为４１ ０００ 的蛋白谱带。初步纯化的包涵体可溶于２ ％ ＳＤＳ，为对其单克隆抗体（ｍＡｂ） 的制备奠定了基础。     

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因在大肠杆菌中的融合表达

用ＥｃｏＲ Ⅰ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切已构建的含单纯疱疹病毒Ｉ 型胸苷激酶（ ＨＳＶ１ ＴＫ） 基因的ｐ ＵＣ１８／ＴＫ 质粒，将切出的ＴＫ 基因片段克隆入原核表达载体ｐ ＷＲ４５０１ 中，构建成ＨＳＶ１ ＴＫ 基因重组表达质粒ｐ ＷＲ４５０１／ＴＫ。以ＨＳＶ１ ＴＫ 特异性引物ＴＫ１ Ｆｏｒ 和ＴＫ２ Ｒｅｖ 进行ＰＣＲ 鉴定可扩增出预期的５０３ ｂｐ 的ＴＫ 基因编码区部分序列；ＥｃｏＲ Ⅰ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切质粒ｐ ＷＲ４５０１／ ＴＫ， 可切出约１１５０ｂｐ 的ＤＮＡ 片段， 表明重组质粒中已插入ＨＳＶ１ ＴＫ基因片段。用ＩＰＴＧ 诱导ｐ ＷＲ４５０１／ＴＫ／ＪＭ１０９ ，表达出相对分子质量（ Ｍｒ） 约为９７ ０００ 的ＴＫ 和β半乳糖苷酶（ Ｍｒ５５ ０００） 融合蛋白。薄层扫描显示，该融合蛋白含量占菌体蛋白总量的２７ ．４７ ％ 。     

差异表达基因克隆技术的新进展

分离并克隆差异表达基因是目前功能性研究的热点ｍＲＮＡ差异展示是筛选差异表达基因最有效的技术之一，它的主要不足是有一定假阳性，ＲＤＡ，ＳＳＨ，ＤＳＤ，ＬＳＨ技术能够克服假阳性，但也具有一定的不足，应根据需要选择运用，随着能扩增长片段及具自动校正功能的Ｔａｑ酶出现及应用，这些技术将会不断完善与发展，具有广阔的应用前景。     

动脉粥样硬化斑块形成时血管平滑肌细胞增生相关基因的cDNA全长克隆及其功能的初步探讨

目的　克隆动脉粥样硬化斑块形成时血管平滑肌细胞（ＳＭＣ） 增生相关基因的ｃＤＮＡ 全长,并对其功能进行初步探讨。方法　选用氧化低密度脂蛋白（ｏｘＬＤＬ） 作为刺激物作用于培养的人主动脉ＳＭＣ,利用减除杂交技术构建减除文库,克隆相关基因片段,在全长文库构建的基础上筛选相关基因的ｃＤＮＡ全长。并进行原核系统内蛋白表达及量效关系检测。结果　发现了４ 个新基因片段,克隆了一个新基因ｃＤＮＡ 全长,该基因在原核系统内有大约相对分子质量为４４ ０００ 的蛋白表达,其高表达可能与ＳＭＣ增生有关。结论　筛选克隆的新基因ＰＳＭＣＨ１ 在动脉粥样硬化斑块形成时可能有较重要的生物学作用。     

差异显示逆转录PCR技术及其应用和进展

差异显示逆转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）技术是一种筛选和克隆差异表达基因的新方法。该方法利用ｃＤＮＡ逆转录技术、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）的高效扩增和凝胶电泳分离技术，能同时显示多种来自相关细胞的ｍＲＮＡ样品。可用于多种研究目的，如鉴别和观察基因表达的改变；差异表达基因的迅速测序并与基因库比较；单个的差异表达基因片段能迅速克隆并制成探针从ｃＤＮＡ文库或基因组文库中分离基因等。ＤＤＲＴ－ＰＣＲ技术具有迅速、简便、灵敏和高效等优点，已被广泛地应用于癌症、心脏疾病、细胞分化、衰老及其它领域的研究中，并且在应用中被不断地改进和发展而更趋合理和完善。     

人胰腺癌中MDM2癌基因的表达和对野生型p53的拮抗作用

为研究ＭＤＭ２癌基因和ｐ５３在胰腺癌中的相互关系和作用，我们用基因重组、基因转移和分子杂交技术探讨了ＭＤＭ２在胰腺癌细胞系中的表达和扩增情况，并研究了ＭＤＭ２对野生型（ｗｔ）ｐ５３的拮抗作用。结果显示，５株人胰腺癌细胞系均有ＭＤＭ２基因不同程度的表达。ＭＤＭ２表达载体转染转化的胰腺癌细胞系ＰＣ－２／ｓ－ｗｔｐ５３细胞（已转染有野生型ｐ５３的胰腺癌细胞）后，ＭＤＭ２可以部分地解除野生型ｐ５３对胰腺癌细胞生长的抑制作用，证实ＭＤＭ２基因对野生型ｐ５３的功能有拮抗作用。     

癌基因MDM_2和抑癌基因p53在肉瘤组织中的变化及其相关性

目的：研究ＭＤＭ２癌基因和ｐ５３抑癌基因在人肉瘤发生中的作用。方法：应用分子杂交和免疫组化技术检测了５０例肉瘤组织、１３例良性间叶瘤和１０例癌组织中ＭＤＭ２及ｐ５３的分子改变。结果：ｐ５３过表达率在肉瘤为２４／５０（４８％）；ＭＤＭ２扩增和过表达在肉瘤为１９／４９（３８．８％）和２７／４９（５５％），而在良性间叶瘤分别为１／１３（７．７％）和１／１２（８．３％），癌组均为１／１０（１０％）；ＭＤＭ２基因的异常在不同类型肉瘤间存在差异性；ＭＤＭ２扩增和过表达间存在不一致性：１９例扩增中１６例有过表达，而１１例过表达者无基因扩增。两基因改变的相关分析发现，２４例ｐ５３阳性中１８例有ＭＤＭ２改变。结论：ＭＤＭ２癌基因异常与间叶性肿瘤的恶性表型高度相关，并有一定类型特异性；ＭＤＭ２与ｐ５３的改变在肉瘤的发生中密切相关     

MPTP诱导的褐鼠黑质基因差异表达的研究

本研究目的在于获取１－甲基－４－苯基－１，２，３，６－四氢吡啶（ＭＰＴＰ）诱导的褐鼠黑质差异表达的表达序列标签（ＥＳＴ）。通过ＭＰＴＰ腹腔注射建立褐鼠帕金森病模型，利用差别显示反转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ ＰＣＲ）技术分析ＭＰＴＰ 处理褐鼠与正常褐鼠黑质基因差异表达的状况，并筛选差异表达基因片段。结果经ＤＤＲＴ－ＰＣＲ 筛选并通过反Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 杂交去除假阳性，最终获得２ 个差异表达基因片段。对其中一个片段进行克隆、测序和同源性比较发现，该片段为一个新的ＥＳＴ 序列，并且与胰岛素原样α肽具有同源性。本研究的结果提示，差异表达序列的分析有可能为研究ＭＰＴＰ诱导的褐鼠黑质变性的分子机理提供线索。     

抗人RBC血型B抗原双价小分子抗体基因的构建与表达

目的： 分离抗人红细胞血型Ｂ抗原单克隆抗体（ｍＡｂ） ５Ｄ１２ 可变区基因, 构建并表达其双价小分子抗体（ｄｉａｂｏｄｙ） 融合蛋白, 为用原核细胞生产抗血型Ｂ抗原工程抗体进行基础研究。方法： 设计合成抗体重、轻链可变区引物, 通过加端ＰＣＲ技术, 在ｍＡｂ ５Ｄ１２ ＶＨ 和ＶＬ基因两端引入连结短肽和适当的限制性酶切位点,体外连接构建５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 基因, 并将其克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ２ 中, 在Ｅ－ｃｏｌｉ ＴＧ１ 中表达。运用ＰＣＲ和双脱氧核苷酸链末端终止法分析其核苷酸序列。结果： ＤＮＡ 序列分析表明, ５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 基因全长为６９９ｂｐ;其中ＶＨ 长３５１ｂｐ , 编码１１７ 个氨基酸; ＶＬ 长３２４ｂｐ , 编码１０８ 个氨基酸, 两者以五肽连接头相连; 重组体表达产物经ＳＤＳＰＡＧＥ显示, ＧＳＴ５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 表达产物的相对分子质量（ Ｍｒ） 为５１ ０００ 左右, 与预期结果相符。光密度扫描结果表明, ＧＳＴ５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 融合蛋白占菌体总蛋白的２４－６％ , 表达产物主要以不溶性的包涵体形式存在。结论： 成功地构建并表达了５Ｄ１２ 双价小分子抗体基因, 在原核细胞中获得较高水平