Nkx2-5在单纯性先天性心脏病中的突变及表达研究

目的分析Nkx2-5基因在单纯性先天性心脏病（congenital heart disease,CHD）心肌组织中的突变及表达情况,探讨Nkx2-5基因突变、表达与单纯性CHD发生机制的关系。方法采用PCR-SSCP（单链构象多态性）方法对30例因CHD引产胎儿心脏组织进行Nkx2-5基因编码序列突变筛查;以β-actin为内对照,用RT-PCR方法检测Nkx2-5基因在单纯性CHD引产胎儿心肌组织中mRNA的表达情况。结果 30例单纯性CHD引产胎儿Nkx2-5基因2个外显子PCR产物经SSCP检测未发现突变;与正常对照心肌组织相比,单纯性CHD胎儿该基因mRNA表达呈下降趋势（P〈0.05）。结论单纯性CHD中Nkx2-5基因编码区的体细胞突变可能不是单纯性CHD的致病机制;Nkx2-5基因转录水平异常可能是该基因参与CHD形成的一种潜在机制。     

青岛地区一例单纯性高甲硫氨酸血症MAT1A基因突变分析

目的对1例在新生儿疾病筛查中利用串联质谱技术发现的可疑单纯性高甲硫氨酸血症患儿进行致病基因突变检测,为临床诊断和遗传咨询提供依据。方法从可疑单纯性高甲硫氨酸血症患儿外周血提取DNA,通过测序技术对可疑基因进行直接测序,对可疑突变进行Sanger验证。结果患儿只有足跟血甲硫氨酸指标升高,无其他临床症状。Ion Torrent半导体测序结果显示患儿携带MAT1A基因c.895CT和c.1067GC位点杂合突变,患儿父亲为c.895CT突变携带者,母亲为c.1067GC突变携带者。结论 MAT1A基因c.895CT和c.1067GC位点杂合突变为这例单纯性高甲硫氨酸血症患儿的致病原因,新一代半导体测序技术是遗传代谢病诊断的重要手段。     

先天性室间隔缺损中的一个GATA4基因新突变

目的 研究GATA4基因新突变导致先天性室间隔缺损(ventricular septal defect,VSD)的分子机制.方法 收集185例先天性VSD患者的临床资料和血标本,以200名健康者为对照.应用PCR扩增GATA4基因的全部外显子,采用双脱氧核苷链末端合成终止法对全部扩增片段进行测序以识别基因突变.克隆GATA4基因,通过定位诱变获得相应的突变体,应用脂质体将GATA4基因重组表达质粒及心房利钠肽基因启动子启动绿色荧光蛋白表达的报告载体转染HeLa细胞,应用逆转录-PCR研究GATA4基因突变对其编码的转录因子的活性的影响.结果 在1例VSD患者的GATA4基因发现1个新的杂合错义突变c.191G＞A,即第64位的密码子由GGA变为GAA,导致第64位的甘氨酸变为谷氨酸,即G64E突变.细胞表达分析显示GATA4突变G64E使转录因子的活性降低.结论 在先天性VSD患者发现GATA4新突变G64E,该突变可能通过抑制转录因子的活性而参与先天性VSD.     

Nkx2.5在肺血减少型先天性心脏病右室流出道心肌中突变及表达的意义

目的 观察Nkx2.5基因在肺血减少型先天性心脏病（CHD）患者中的突变及表达变化,探讨Nkx2.5基因在右室流出道梗阻发生中的分子调控机制.方法 选取2012年5月—2013年5月蚌埠医学院第一附属医院与安徽省立儿童医院心脏外科收治的56例肺血减少型CHD患者为实验组,同期收治的63例室间隔缺损患者为对照组.收集所有患者术前外周静脉血5 ml,采用PCR结合DNA测序技术对Nkx2.5基因的外显子进行序列检测,观察有无Nkx2.5基因突变;留取术中右室流出道肥厚心肌组织0.5 cm ×0.5 cm ×0.5 cm,提取心肌组织RNA,应用实时荧光定量PCR技术检测心肌中Nkx2.5基因mRNA的表达情况,分析Nkx2.5基因与肺血减少型CHD的关系.结果 实验组与对照组外周静脉血中均未检测出基因突变,实验组心肌组织Nkx2.5基因mRNA表达水平较对照组显著降低,差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 Nkx2.5基因突变可能与多因素有关;肺血减少型CHD的发生可能与心肌组织中Nkx2.5基因表达下降有关.     

青岛地区先天性心脏病患儿GATA-4基因突变的研究

目的研究山东省青岛地区先天性心脏病患儿GATA4基因突变情况。方法采用PCR直接测序技术对70例先天性心脏病患儿GATA-4基因的全部外显子进行基因突变筛查。结果在1例先天性心脏病室间隔缺损患儿中发现GA-TA4基因的杂合性突变,为第4外显子cDNA的886位点发生G〉A的杂合突变（c.886G〉A）,结果导致其编码蛋白的第296密码子由甘氨酸突变为丝氨酸（p.G296S）,为错义突变。结论在山东省青岛地区先天性心脏病患儿中发现了GATA-4基因的p.G296S突变,该突变可能导致先天性心脏病。     

先天性心脏病胎儿心肌转录因子GATA-4基因突变检测

目的分析先天性心脏病胎儿中GATA-4基因的突变情况，期望为进一步阐明先天性心脏病发病的分子机理提供新的实验依据。方法应用PCR—DNA测序技术在20例先心病胎儿病变部位的心肌组织中筛查GATA-4基因突变。结果20例中，在1例先心病胎儿（ASD、VSD）中检测到一个突变（V267M），位于外显予4；在3例先心病胎儿中发现编码241位氨基酸（半胱氨酸）密码子的第三位碱基均存在杂合同义突变（C→T），位于外显子3，并证实是一个单核苷酸多态性（SNP）位点（rsl062215）。结论GATA-4基因突变（V267M）可能与胎儿先天性心脏病发病有关：GATA-4723C／T基因多态性（rs1062215）与胎儿先天性心脏病的关系有待进一步证实。     

一个新的ACTC1基因5’端剪切位点突变可能在先天性心脏病室间隔缺损发病中起重要作用

背景：ACTC1是先天性心脏病的候选基因,且与人类先天性心脏病房间隔缺损有关。 目的：对110个先天性心脏病核心家系中ACTC1基因进行突变筛查。 方法：在110个先天性心脏病核心家系与300例无报道有心脏畸形的正常人之间进行对照试验。使用5对引物将ACTC1基因的6个编码区片段进行PCR体外扩增,从PCR产物中筛查基因突变。 结果与结论：在ACTC1基因的第五外显子下游5’端剪切位点第3个碱基发现了1个G-A的全新的突变。这个突变存在于1个患有单纯性室间隔缺损的女孩和她30岁的没有报道过心脏畸形的父亲,且该突变没有在300例正常对照组中筛出。提示该突变可能与人类先天性心脏病室间隔缺损有关。     

补体因子Ⅰ缺乏患儿1例分子与临床特征研究

目的探讨1例补体因子Ⅰ(complement factorⅠ,CFⅠ)缺乏患儿CFⅠ基因突变、蛋白表达水平、免疫表型及临床特征。方法对1例临床表现为反复头痛伴发热,脑电图及脑脊液检查异常的疑似无菌性脑膜脑炎患儿行免疫学筛查,免疫相关基因新一代测序及ELISA检测CFⅠ蛋白表达。结果该患儿补体C3水平明显降低,抗体水平及外周血精细免疫分型正常,经基因分析发现CFⅠ基因第5号内含子拼接位点发生纯合772+1G>T突变,患儿父母均为该突变的携带者。ELISA检测示患儿CFⅠ蛋白表达量与正常对照相比明显降低。结论通过临床、免疫学筛查、基因分析及蛋白检测,确诊1例发生CFⅠ基因突变的补体缺乏患儿,为此前未见报道的新发突变。对反复发热伴头痛,脑膜脑炎诊断不明确及C3降低的患儿应考虑补体缺乏并进行补体相关基因分析以最终确诊。     

孤立型室间隔缺损胎儿的基因组拷贝数变异分析及文献回顾

目的评估拷贝数变异(CNVs)检测对于孤立型室间隔缺损(VSD)胎儿遗传学病因的诊断价值。方法选取2017年12月至2020年12月郑州大学第一附属医院超声检查发现的69例孤立型VSD胎儿, 同时检索万方、万方医学、中国知网等数据库, 2016年1月1日至2021年1月1日以"室间隔缺损""拷贝数变异"以及"产前"为关键词, 连同文献报道的839例胎儿, 共计908例孤立型VSD胎儿作为研究对象。对69例胎儿进行低深度全基因组测序, 并合并文献数据进行回顾性分析。结果在908例样本中, 共检出33例致病性异常, 总体检出率为3.63%。其中包括11例(1.21%)非整倍体以及22例(2.42%)致病性CNVs。后者涉及12种综合征, 具体包括5例22q11.21缺失、2例4q末端缺失以及1例9q亚端粒缺失, 均与心脏发育相关。22例致病性CNVs胎儿中, 15例具有已知的妊娠结局, 12例为自主终止妊娠, 3例出生后室间隔自然闭合, 但其中1例具有其他异常。结论孤立型VSD的胎儿具有较高的染色体异常检出率, 因此建议对其进行CNV-seq检测。     

一例假肥大型肌营养不良家系DMD基因分析及产前诊断

目的对1例临床症状疑似假肥大型肌营养不良(DMD/BMD)的患儿进行基因诊断,并进行携带者筛查及产前诊断。方法使用多重链接探针扩增技术(MLPA)进行DMD基因79个外显子缺失或重复检测,同时应用高通量测序技术(NGS)对神经肌肉相关基因进行靶向测序,并通过Sanger测序对先证者及家系成员进行验证。结果 MLPA检测未发现患儿DMD基因外显子发生缺失或者重复突变,NGS测序发现DMD基因第39号外显子c.5544-5548delGATAA半合子突变。Sanger测序验证发现患儿母亲、弟弟(胎儿)均存在c.5544-5548delGATAA突变。结论本研究发现一种尚未病例报道的新发突变,该缺失突变是导致患儿发病的原因,MLPA结合NGS技术可有效提高疾病的诊断效率,为产前诊断提供准确信息。     

多囊卵巢综合征患者的生长分化因子9基因的突变分析

目的通过对多囊卵巢综合征（PCOS）妇女的生长分化因子9（GDF-9）基因的突变分析，探索GDF-9基因与PCOS的发病机制的关系。方法对120例PCOS患者釉80例正常对照的GDF-9基因进行聚合酶链反应（PCR）特异扩增，应用单链构象多态性（SSCP）分析和DNA测序方法检测基因突变。结果PCOS患者的GDF-9的所有外显予均未发现错义突变。结论GDF-9因子的DNA变异可能与PCOS的发病没有相关关系。研究PCOS患者的GDF-9的mRNA与蛋白表达水平与其发病的关系可能是今后的研究方向。     

全反式维甲酸对脐血红系祖细胞HOXB6基因表达的调控作用

目的探讨脐血造血干祖细胞（HSPC）向红系（CFU-E）祖细胞增殖过程中HOXB6mRNA表达及全反式维甲酸（ATRA）对HOXB6mRNA表达的影响。方法1.采用造血祖细胞体外培养技术,以ATRA持续干扰人类造血干祖细胞,观察人脐血HSPC经促红细胞生成素（EPO）诱导后,在培养过程第3天,7天和12天CFU-E集落生成情况。2.采用实时荧光定量PCR技术（FQ-RT-PCR）检测造血祖细胞增殖分化过程中HOXB6基因的表达水平。3.结果用DNA相对拷贝数和RNA表达相对量（2-△△Ct）表示HOXB6基因相对表达量。结果1.人类造血干祖细胞向红系祖细胞增殖分化过程中,各组细胞HOXB6基因均表达;2.随时间延长,CFU-E HOXB6-mRNA表达在第3天,第7天,第12天均持续表达;3.与正常对照组比较,ATRA可上调HOXB6基因的表达。结论1.在脐血CFU-E祖细胞的不同增殖阶段,HOXB6基因呈现持续稳定的表达,提示HOXB6是人类造血干祖细胞向红系祖细胞正常增殖分化过程中的调控基因之一;2.ATRA能显著上调HOXB6基因的表达。     

室间隔缺损胎儿心室肌组织微小RNAs时序性表达差异研究

目的采用微小RNAs（miRNAs）表达谱芯片分析不同孕龄（孕早期与孕中期）室间隔缺损（VSD）胎儿心室肌组织中时序性表达差异的miRNAs。方法连续性纳入2009年7～12月南京医科大学附属南京妇幼保健院因病理因素流产经解剖证实为VSD且不合并其他畸形的胎儿为VSD组。以同期因生理性难免流产,并经解剖证实无心脏畸形和其他器官畸形的胎儿为对照组,依据孕龄与VSD组1：1匹配。根据孕龄,将VSD组和对照组分别分为孕早期亚组和孕中期亚组。采用Agilent Human2.0 miRNAs表达谱芯片观察胎儿心室肌组织miRNAs表达变化,芯片数据采用生物信息学方法进行分析,包括差异miRNAs筛选,预测miRNAs靶基因Gene Ontology分析,靶基因信号通路分析,并采用实时PCR法验证芯片结果。结果 VSD组和对照组各纳入6例,两组孕早期亚组和孕中期亚组均各3例。①通过差异miRNAs筛选,发现孕早期VSD亚组与孕中期VSD亚组间有33个时序性表达差异的miRNAs。19个miRNAs在孕早期VSD亚组表达上调,在孕中期VSD亚组表达下调;14个miRNAs在孕早期VSD亚组表达下调,在孕中期VSD亚组表达上调。②生物信息学预测到2761个靶基因,大部分miRNAs的靶基因中含有与心脏发育直接相关的关键基因（TBX5、GATA4、TBX1和NKX2-5等）。③靶基因GeneOntology分析表明其中与细胞进程、代谢过程和生物调控相关的靶基因分别占整个靶基因数量的23.5%、18.3%和17.7%。④靶基因信号通路分析发现,WNT信号通路中的靶基因在孕早期VSD亚组与孕中期VSD亚组中存在时序性差异。⑤随机挑选孕早期VSD亚组与孕中期VSD亚组时序性表达差异的4个miRNAs（hsa-miR-19a、hsa-let-7e、hsa-miR-134和hsa-miR-206）进行验证,定量PCR结果显示,孕早期VSD亚组分别上调3.2（hsa-miR-19a）和4.1倍（hsa-let-7e）,下调5.3（hsa-miR-134）和4.4倍（hsa-miR-206）;孕中期VSD亚组分别下调4.8（hsa-miR-19a）和3.4倍（hsa-let-7e）,上调4.5（hsa-miR-134）和3.9倍（hsa-miR-206）。结论时序性表达差异的miRNAs在胎儿VSD畸形的发生中可能起着重要作用,但本研究样本量较小,需要进一步扩大样本量进行验证。这些差异表达miRNAs的预测靶基因与细胞发育、分化和代谢密切相关,含有与心脏发育直接相关的关键基因,部分靶基因为WNT信号通路中的关键因子,提示VSD的发生发展是机体在miRNAs的参与下,在多个层面上使基因表达失控的共同结果。     

SEPT12基因中单核苷酸多态性G5508A与原发男性不育关系的研究

目的探讨SEPT12基因多态性与原发男性不育的关系。方法采用PCR和测序技术,对67名原发不育男性和100名对照者的SEPT12基因（的热点区段）进行扩增和测序。结果 SEPT12基因G5508A多态性的基因型有三种：GG,GA,和AA。在原发不育男性和对照者中,这三种基因型的比例有显著性差异（卡方检验,P≤0.05）结论 SEPT12基因中单核苷酸多态性G5508A对男性的精子发生,生育能力有影响,这个观点还需要更多的实验来验证。     

PDTC可改变TNF-α诱导的eNOS基因表达下调

目的探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中内皮型一氧化氮合酶基因（eNOS）表达的作用以及PDTC对此作用的改变。方法将培养的内皮细胞分为3组：1组为无任何处理的HUVEC,2组为子痫前期（PE）患者血清作用的HUVEC,3组为用正常晚孕妇女血清作用的HUVEC。用逆转录-聚合酶链反应检测三组细胞中eNOS mRNA的表达。酶联免疫吸附实验（ELISA）检测PE患者和正常孕妇血清中TNF-α含量。用1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml 3种浓度的TNF-α分别作用三组细胞6h,以及用浓度为3ng/ml的TNF-α作用三组细胞分别长达6h、12h、24h,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测eNOS mRNA的表达;将二硫代氨基甲酸吡硌烷（PDTC,5mmol/ml）与TNF-α（3ng/ml）同时作用以及TNF-α（3ng/ml）单独作用三组细胞6h,RT-PCR检测eNOS基因mRNA的表达。结果三组细胞中都有eNOS表达,2组表达量显著低于1组和3组（P〈0.01）。ELISA结果显示,PE患者血清中TNF-α含量显著高于正常晚孕妇女（P〈0.01）。TNF-α作用HUVEC细胞后eNOS表达显著低表达,并成时间和剂量依赖关系（P〈0.01）。PDTC和TNF-α同时作用的HUVEC和TNF-α单独作用的HUVEC相比,其eNOS表达显著增高（P〈0.01）。结论可下调eNOS在HUVEC中的表达,PDTC可改变TNF-α诱导的eNOSN表达的下调。     

Analysis of CDKN1C in Beckwith Wiedemann syndrome

In this study we have examined 32 patients with Beckwith Wiedemann Syndrome (BWS) for mutations affecting the CDKN1C gene, including seven cases of familial BWS. Mutations were not detected in the coding region of the CDKN1C gene in any individual with BWS. However in two patients, two G/A base substitutions at adjacent positions in the 5'UTR were detected. These substitutions were also found in normal controls. Expression of CDKN1C in somatic tissues was examined in 18 of the 32 cases using semi-quantitative RT-PCR. CDKN1C expression was significantly reduced in the peripheral blood of three cases compared with controls. These results suggest that, although coding region mutations in the CDKN1C gene are rare in BWS, mutations disrupting CDKN1C expression may be found. Three of five informative patients exhibited biallelic CDKN1C expression in lymphocytes, cord blood, and kidney tissue, respectively. Biallelic expression was not associated with overall CDKN1C levels significantly different to those in controls. Patients who expressed CDKN1C biallelically, or who were low CDKN1C expressors, maintained monoallelic methylation in the Differentially Methylated Region 2 (DMR2) of the IGF2 locus. One patient expressing CDKN1C biallelically, maintained imprinted gene expression at the IGF2 locus. These results suggest that biallelic CDKN1C expression does not significantly perturb the overall levels of CDKN1C expression in somatic tissue. They also confirm other studies showing that the mechanisms associated with regulating CDKN1C expression and imprinting are separate from those regulating IGF2 imprinting.     

维生素D受体在妊娠期肝内胆汁淤积症中的异常表达

目的通过研究维生素D受体（VDR）在妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregancy,ICP）孕妇外周血、脐血及胎盘中的表达,探讨VDR与ICP发病的关系。方法采用荧光定量PCR法检测ICP组和正常对照组外周血、脐血及胎盘组织中的VDR的mRNA表达,ICP组和正常对照组均为52例。两组孕妇胎盘中VDR蛋白表达水平采用免疫组化法检测。结果 （1）ICP组外周血、脐血及胎盘组织中VDR的mRNA表达水平均明显低于对照组,差异有统计学意义（P值均〈0.05）,ICP组中VDR mRNA在脐血中的表达明显高于在外周血及胎盘中的表达,差异有统计学意义（P值均〈0.05）;（2）ICP组胎盘中VDR的蛋白阳性表达率明显低于正常对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 VDR在ICP孕妇外周血、脐血及胎盘中的表达均低于正常孕妇,可能在ICP发病中起一定的作用。     

白血病患者外周血FLT3基因突变的研究

目的本实验通过对不同类型白血病患者外周血Flt3基因突变的研究，探讨Flt3基因与白血病发生的相关性，以骨髓标本对照，确定外周血Flt3基因检测白血病的新方法。方法从34例白血病患者和10名健康人外周血标本中提取基因组DNA，聚合酶反应（PCR）扩增Flt3基因外显子14-15，PCR产物经电泳纯化后进行DNA测序分析。结果对34例血样标本均扩增出Flt3基因的外显子14—15的靶基因片段经琼脂糖电泳显示3例阳性带。选择11例特征性标本测定外显子14—15的DNA序列，发现5例突变，其中2例为ITD，内串联复制重复序列分别为30bp和33bp，编码10和11个氨基酸；3例均在近膜区（JM）外显子14、L576P，发生点突变，其中1例伴有内含子14缺失，长度90bp。10名健康者标本均为阴性。结论Flt3基因突变和白血病发生、发展相关，外周血可以替代骨髓检测Flt3突变；FLT3-ITD阳性患者化疗缓解率低、易复发、预后差；外显子14、L567，突变点是否为Flt3一个新的突变热点需进一步研究。