PCR结合寡核苷酸探针杂交检测临床常见真菌的实验研究

目的 建立PCR结合生物标记的寡核甘酸探针斑点杂交技术,鉴定临床常见的真菌。方法 首先用真菌通用引物扩增白念球菌、热带念球菌、假热带念球菌、近平滑念球菌、光滑念球菌、解脂念球菌、克鲁斯念球菌、季也蒙念球菌、黄曲 霉、烟曲霉的核糖体大亚单位基因的保守区序列,然后用生物素标记的种特异性寡核苷酸探针与扩增产物杂交,并将此方法用于临床标本和临床分离菌株的检测。结果 通用引物可以扩增上述11种临床常见真菌的DNA,扩增片段长度在260bp左右。9种特异性探针分别与11种真菌标准菌株的PCR扩增产物杂交,结果表明每种探针都具有高度特异性。斑点杂交法和Southerm杂交法检测敏感性相同,为100fg;琼脂糖凝胶电泳法检测敏感性为1pg。通过69例临床标本和31例临床分析菌株的检测,PCR－杂交法的结果和真菌培养法的结果基本一致。结论 PCR结合生物素标记的寡核苷酸探针杂交技术可将9种临床常见真菌鉴定到种,方法快速、敏感、特异。     

反向点杂交快速诊断非缺失型α-地中海贫血

目的 建立一种简便快速筛查非缺失型α—地中海贫血点突变的反向点杂交(reverse dot blot,RDB)技术。方法 将生物素直接标记在引物上,选择性扩增人α2珠蛋白基因,将PCR产物与固化在膜条上的寡核苷酸探针杂交,洗膜、显色后分析结果。结果 采用生物素标记的引物：Bio—C1和Bio—C3可选择性扩增α2珠蛋白基因,PCR产物长度为1085bp,该标记片段与固相探针构成的反向点杂交检测体系,可以分辨出中国人群中已知的6种非缺失型α—地中海贫血点突变。结论 该反向点杂交检测体系无需巢式PCR扩增,一步选择性扩增的α2珠蛋白基因产物即可用于杂交;无需进行检测标记物(如生物素)反应,而将生物素直接标记在引物上;无需不同的洗膜条件,故较已报道的同类方法更为简单易行。RDB技术可用于快速诊断中国人非缺失型α—地中海贫血点突变。     

双重荧光定量RT-PCR快速检测流感病毒H1、H3亚型的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测流感病毒H1、H3亚型的方法。方法根据H1、H3亚型流感病毒HA基因的相对保守序列,设计两对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立优化反应体系后,将荧光定量RT-PCR的产物采用10倍稀释法,即107～100copies/μl,再次用荧光定量PCR方法检验建立体系的灵敏度和重复性,并建立相对定量标准曲线;利用多种流感病毒和具有相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性。结果 H1和H3亚型流感病毒的检测灵敏度为102copies/μl,扩增效率分别为101.35%和113.28%,标准曲线相关系数大于99%,重复性良好,特异度实验未发现有非特异性扩增。结论本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H1、H3亚型流感病毒。     

多聚酶链反应和寡核苷酸探针检测衣原体

本研究所用引物和探针序列选自衣原体１６Ｓ ｒＲＮＡ基因。以生物素末端标记制备探针。多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增物作琼脂糖凝胶电泳和ＤＮＡ斑点杂交，证实引物为衣原体属特异性。ＰＣＲ检测灵敏度达到相当于１个拷贝的衣原体ＤＮＡ分子。生物素化寡核苷酸探针ＤＮＡ斑点杂交的直接检测灵敏度为１００ｐｇ，结合ＰＣＲ扩增的检测灵敏度为１ｆｇ。本法高度敏感、特异，且方法简便，对于衣原体感染诊断和分子流行病学调查具有较好     

流感及H5N1亚型禽流感病毒液相检测芯片的制备

目的 建立利用液相芯片技术检测甲、乙型流感和H5N1亚型高致病性禽流感病毒的方法,并对该方法进行评价。方法 对GenBank中甲型流感病毒的NP、乙型流感病毒的HA以及高致病性禽流感病毒（H5N1）的H5、N1基因片段序列进行同源性比对,根据保守序列,设计针对各基因的简并引物和寡核苷酸探针,制备探针偶联微球,将样本核酸多重PCR扩增产物与微球进行杂交,以Bio-Plex液相芯片检测系统进行芯片检测。结果 该方法可以对甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒（H5N1）的H5、N1基因同时进行检测,病毒核酸的最低检出量为1pg,检测特异性高。结论 成功构建了甲、乙型流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒液相芯片检测系统,为流感、禽流感的快速检测、诊断奠定了基础。     

微板酶联夹心杂交法定量检测人IL-18 mRNA

目的：建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术，定量检测人IL-18mRNN。方法：针对人IL-18mRNA RT-PCR产物—条链的不同区域序列设计—对特异探针，其中一条为捕获探针，5’端为氨基修饰，可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合，“竖直”地包被在微孔板内；另一条为检测探针，3’端标记生物素。提取人外周血单个核细胞中总RNA，进行RT-PCR扩增IL-18 mRNA，产物热变性后加入已包被捕获探针的微孔板内进行杂交，再加入检测探针与已杂交的产物结合，最后经亲和素-辣根过氧化物酶(SAV-HRP)系统检测杂交信号。结果：该法检测IL-18mRNA RT-PCR产物的灵敏度明显高于琼脂糖凝胶电泳，重复性良好，且结果数据化。结论：该方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，适合于PCR扩增产物的定量检测。     

应用巢式RT-PCR扩增HA和NA基因片段并测序鉴定甲型H1N1流感病毒

目的 建立一种利用巢式RT-PCR特异扩增HA和NA基因片段并测序鉴定甲型H1N1流感病毒的技术.方法 设计两套共7条特异引物,通过巢式RT-PCR分别扩增甲型H1N1流感病毒HA和NA基因片段并测序,所得序列与人感染甲型流感病毒主要HA和NA亚型序列进行进化树分析以对结果作进一步鉴定,蛋白序列比对后分析其特征.结果 4例甲型H1N1流感患者流感病毒HA和NA基因RT-PCR扩增均分别得到442 bp和543 bp片段产物.核苷酸序列进化分析表明,该4例患者HA和NA序列分别与2009年爆发的甲型H1N1流感病毒HA及NA序列聚集在一起,与季节性H1、H2、H3、人禽流感H5亚型及季节性N1、N2、人禽流感N1亚型特异分开.蛋白序列分析表明,4例患者流感病毒HA蛋白裂解位点附近氨基酸序列均为PSIQSR↓GLF,不具有高致病性流感病毒的特性,NA蛋白第275位氨基酸为His,未出现H275Y的耐药变异.结论 本方法能特异扩增甲型H1N1流感病毒HA和NA基因片段,测序后可用于甲型H1N1流感病毒的进一步鉴定;同时,得到的序列也可用于流感病毒致病力及耐药性的分析.     

基于LAMP技术建立解脲支原体基因试纸条检测方法

目的 建立一种灵敏度高、特异性强、检测速度快的方法检测解脲支原体.方法 基于环介导恒温扩增技术(LAMP),根据解脲支原体序列特征设计3对引物进行解脲支原体DNA切口酶核酸恒温扩增,扩增过程在一对引物中标记生物素,随着扩增的进行生物素直接引入扩增片段中,扩增结束后产物在密闭装置中进行免疫试纸条显色反应,根据显色卡的颜色判定结果的阴阳性.结果 该技术检测解脲支原体较实时荧光PCR技术灵敏度要高10倍以上,其它病原体检测均阴性该方法特异性与实时荧光PCR技术相当.结论 恒温扩增联合试纸条技术检测解脲支原体具有较高的敏感性和特异性,检测速度快,适合各医院开展.     

长臂光敏生物素和光敏地高辛核酸探针检测医学真菌灵敏度的比较研究

建立应用长臂光敏生物素核酸探针和光敏地高辛核酸探针杂交。检测真菌的方法，并比较二者检测临床常见医学真菌的敏感性。设计并合成医学真菌通用引物，用PCR扩增白色念珠菌标准株的核糖体RNA基因，用长臂光敏生物素或光敏地高辛标记其纯化的扩增产物制备成相应的核酸探针，然后用上述两种探针对标本中的PCR扩增产物进行Southern杂交，检测医学真菌。通过用白色念珠菌感染大鼠，建立念珠菌病的实验动物模型，验证血培养法、PCR法和PCR扩增结合Southern杂交，检测真菌的敏感性。结果表明，这两种核酸探针可分别与白色念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌、黄曲霉菌、烟曲霉菌等9种真菌杂交呈阳性结果：与临床常见的细菌、病毒和哺乳动物组织细胞DNA杂交结果为阴性。利用实验动物模型比较了血培养法、PCR法和PCR扩增结合长臂光敏生物素核酸探针Southern杂交法检测真菌血症的灵敏度，实验证明后者的敏感性最高。总之，应用长臂光敏生物素核酸探针和光敏地高辛核酸探针与标本PCR扩增物杂交，检测上述真菌既特异和敏感，又不需放射性同位素。光敏地高辛核酸探针检测医学真菌的灵敏度略高于长臂光敏生物素核酸探针。     

Th1/Th2相关细胞因子基因检测方法的建立①

目的建立检测Th1/Th2相关细胞因子的方法。方法设计6对用于IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IFNγ和β-actin 基因扩增的引物，建立可用于Th1/Th2相关细胞因子检测的RT-PCR技术，同时用切口平移法制备6种细胞因子的cDNA探针，建立RNA斑点杂交技术。结果用RT-PCR和RNA斑点杂交技术检测20种肿瘤细胞株，发现11/20为Th2型细胞因子表达，8/20为Th0型，1/20未检测到细胞因子。结论RT-PCR技术和RNA斑点杂交技术是检测Th1/Th2相关细胞因子的有效方法。     

H9N2禽流感病毒一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立

目的 建立一种可同时检测禽流感病毒H9N2的HA和NA基因一步法双重荧光RT-PCR方法.方法 针对H9N2禽流感病毒的HA和NA基因保守区,设计相应的特异性引物以及探针,优化检测体系及反应条件,建立一步法双重荧光定量RT-PCR方法.对该方法的灵敏度、特异性、稳定性进行验证与评估,并对家禽粪便标本进行应用检测,以单重实时荧光RT-PCR方法作为参照,检测结果不一致的样本采用测序进行验证.结果 该方法特异性强,与H1、H3、H5、H7亚型禽流感病毒、鸡新城疫及鸡传染性支炎病毒均无交叉反应,对HA和NA基因的最低检出限分别可达50拷贝/μL和25拷贝/μL,组间与组内的变异系数在0.20 ～0.79％之间.对82份粪便标本进行检测,H9N2禽流感病毒的阳性率为8.14％ (7/82),与单重实时荧光RT-PCR法检测结果一致.结论 该方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可应用于临床禽流感样本的检测.     

多重RT-PCR方法检测甲型流感病毒

目的建立一种快速、敏感、特异的多重RT-PCR,同时检测甲型流感病毒中的3个分型:甲型H1N1流感病毒,季节性H1N1流感病毒,季节性H3N2流感病毒,并将此方法应用到实验室流感病毒核酸检测技术中。方法利用甲型流感病毒3个分型病毒的引物,在同一个RT-PCR反应体系中,对疑似流感咽拭子标本进行检测。结果多重RT-PCR对甲型流感病毒中分型病毒有较高的灵敏度和特异性,可直接从疑似流感标本中同时进行甲型流感病毒分型检测。结论此实验中采用的多重RT-PCR具有与常规RT-PCR一样的特异性和敏感度,而且比普通RT-PCR和病毒分离法更快速,也更简便。     

Substrate specificity of avian influenza H5N1 neuraminidase

AIM: To characterise neuraminidase(NA) substrate specificity of avian influenza H5N1 strains from humans and birds comparing to seasonal influenza virus.METHODS: Avian influenza H5N1 strains from humans and birds were recruited for characterising their NA substrate specificity by using a modified commercial fluorescence Amplex Red assay. This method can identify the preference of α2,6-linked sialic acid or α2,3-linked sialic acid. Moreover, to avoid the bias of input virus, reverse genetic virus using NA gene from human isolated H5N1 were generated and used to compare with the seasonal influenza virus. Lastly, the substrate specificity profile was further confirmed by high-performance liquid chromatography(HPLC) analysis of the enzymatic product. RESULTS: The H5N1 NA showed higher activity on α2,3-linked sialic acid than α2,6-linked(P 0.0001). To compare the NA activity between the H5N1 and seasonal influenza viruses, reverse genetic viruses carrying the NA of H5N1 viruses and NA from a seasonal H3N2 virus was generated. In these reverse genetic viruses, the NA activity of the H5N1 showed markedly higher activity against α2,3-linked sialic acid than that of the H3N2 virus, whereas the activities on α2,6-linkage were comparable. Interestingly, NA from an H5N1 human isolate that was previously shown to have heamagglutinin(HA) with dual specificity showed reduced activity on α2,3-linkage. To confirm the substrate specificity profile, HPLC analytic of enzymatic product was performed. Similar to Amplex red assay, H5N1 virus showed abundant preference on α2,3-linked sialic acid.CONCLUSION: H5N1 virus maintains the avian specific NA and NA changes may be needed to accompany changes in HA receptor preference for the viral adaptation to humans.