miR-26a在血小板源性生长因子B诱导小鼠主动脉平滑肌细胞表型转换的作用

目的探讨miR-26a在血小板源性生长因子B(PDGF-BB)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转换中的调控作用。方法培养原代小鼠主动脉VSMCs,将细胞分空白对照组、anti-miR-26a、PDGF-BB+anti-miR-control组和PDGF-BB+anti-miR-26a组共4组。分别加入荧光蛋白(Ad-GFP)、anti-miR-26a、PDGF-BB+anti-miR-control和PDGFBB+anti-miR-26a,观察VSMCs的表型改变;用RT-qPCR及Western blot分别检测VSMCs中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)、钙调节蛋白(calponin)基因的mRNA和蛋白表达水平以及VSMCs中miR-26a表达。结果与对照组相比,PDGF-BB以浓度和时间依赖方式抑制VSMCs分化标志基因α-SMC、calponin、SM-MHC的mRNA和蛋白的表达(P0. 05),诱导VSMC表型转换为合成表型; PDGF-BB处理的VSMCs中miR-26a表达显著升高(P0. 05);抑制miR-26a后,PDGF-BB对VSMCs的α-SMC、calponin、SM-MHC的mRNA和蛋白的抑制作用被部分抵消(P0. 05)。结论 PDGF-BB使VSMCs中miR-26a表达显著升高,miR-26a促进VSMCs增殖和迁移,miR-26a在PDGF-BB诱导VSMCs表型转换中可能起关键作用。     

磷酯酰肌醇3激酶抑制剂对碱性成纤维细胞生长因子诱导的平滑肌细胞增殖及迁移的影响

目的:研究磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂Wortmannin (WT)对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移及磷酸化Akt蛋白表达的影响,为探讨bFGF诱导平滑肌细胞增殖和迁移的信号通路提供实验依据.方法:采用细胞计数、划痕损伤实验和免疫印迹法,观察Wortmannin对bFGF诱导的VSMCs增殖、迁移及磷酸化Akt表达的影响.结果:干预后24h, bFGF组VSMCs增殖、迁移较对照组明显增强,同时磷酸化Akt的表达平行增高.加用Wortmannin后,明显抑制了VSMCs的增殖、迁移和磷酸化Akt的表达.结论:bFGF诱导的VSMCs增殖和迁移可能是通过PI3K/Akt信号通路发挥作用.     

27nt-miRNA对血管平滑肌细胞SM22α表达的调节及其对细胞活力、迁移和表型改变的影响

目的:探讨27nt-微小RNA(27nt-miRNA)对血管平滑肌细胞(VSMCs)中平滑肌22α蛋白(SM22α表达的调节及其对细胞活力、迁移和表型改变的影响。方法:构建27nt-miRNA高表达、反义序列(anti-27nt-miRNA)以及阴性对照的表达质粒,经慢病毒包装后分别转染大鼠原代VSMCs,加入血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导VSMCs表型转换。MTT实验检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法检测细胞中SM22α的mRNA和蛋白表达情况。结果:与正常组相比,PDGF-BB组的细胞活力上升(P 0.05)、迁移能力上升(P 0.05),SM22α的mRNA及蛋白表达量下降(P 0.05);与阴性对照慢病毒组相比,27nt-miRNA高表达组的细胞活力下降(P 0.05),迁移能力下降(P 0.05),SM22α的mRNA及蛋白表达量明显升高(P 0.05);而anti-27nt-miRNA组细胞的细胞活力上升(P 0.05),迁移能力上升(P 0.05),SM22α的mRNA及蛋白表达量下降(P 0.05)。结论:27nt-miRNA促进SM22α表达,同时抑制VSMCs的活力及迁移,并有可能抑制VSMCs从收缩型转变为合成型。     

氟伐他汀抑制大鼠血管平滑肌细胞迁移的机制

目的:研究氟伐他汀抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移的可能机制。方法:采用体外培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞;用特异性单克隆磷酸化热休克蛋白27(phospho-HSP27)抗体的Western blotting检测HSP27的活性;用FITC-鬼笔环肽标记F-actin并在激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架的形态变化;采用改良的Boyden微孔膜双槽法进行细胞迁移实验。结果:AngⅡ和PDGF-BB呈浓度依赖性诱导VSMCs的HSP27磷酸化,使VSMCs内F-actin数量明显增加,纵向平行排列,形成应力纤维丝,并促进细胞迁移。100μmol/L HSP27阻断剂槲皮素可阻抑AngⅡ、PDGF-BB刺激VSMCs后产生的应力纤维丝形成,对AngⅡ、PDGF-BB诱导的VSMCs迁移的抑制率分别为55.3%和53.6%,P0.01。氟伐他汀抑制AngⅡ和PDGF-BB诱导的HSP27磷酸化,并有量效关系,抑制作用在10-5mol/L时最显著,最大抑制率分别为42.1%和58.5%,P0.01。结论:氟伐他汀可能通过抑制HSP27磷酸化影响VSMCs的迁移。     

受体相互作用蛋白激酶1在血管平滑肌细胞表型转换中的作用研究

血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转换在多种血管疾病中起着重要作用,因此本研究旨在探索受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)在血管平滑肌细胞表型转换中的表达变化及其可能起到的作用。通过血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激建立VSMCs表型转换模型,分别采用定量PCR、Western blot检测VSMCs表型转换及分泌标志物、RIPK1的表达和核因子-κB(NF-κB)的P65亚基磷酸化水平的变化,5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)掺入法检测细胞增殖变化,并用划痕实验检测细胞迁移情况。同时,应用RIPK1特异性小分子抑制剂Necrostatin-1(Nec-1),以及特异性RIPK1-siRNA抑制RIPK1的表达,观察RIPK1在VSMCs表型转换中的作用。结果显示,AngⅡ诱导VSMCs发生表型转换后,RIPK1表达及P65磷酸化的水平明显增加。给予Nec-1预处理或是利用RIPK1-siRNA沉默RIPK1基因后,P65的磷酸化水平呈现下调,同时能部分逆转VSMCs的表型转换并抑制其分泌、增殖和迁移能力。实验表明,AngⅡ能诱导RIPK1表达上调,同时RIPK1可能通过促进NF-κB的P65亚基磷酸化参与了VSMCs的表型转换过程。     

长链非编码RNA ZFAS1/miR-150/ROCK1调控血管平滑肌细胞增殖和迁移

目的:探讨长链非编码RNA ZFAS1是否通过调控微小RNA-150(miR-150)/ROCK1促进血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移,及其参与动脉粥样硬化发生发展的机制。方法:用血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导VSMCs增殖和迁移。用real-time PCR法检测VSMCs中ZFAS1的表达水平。进一步用小干扰RNA(siRNA)下调ZFAS1表达后,采用MTT和EdU法检测VSMCs的活力和增殖能力,采用Transwell法检测VSMCs的迁移能力,采用real-time PCR检测miR-150和ROCK1的表达水平,Western blot检测ROCK1蛋白的表达水平。萤光素酶报告基因实验验证RCOK1为miR-150的靶基因。最后,抑制miR-150表达,检测下调ZFAS1表达后VSMCs的增殖、迁移及ROCK1表达。结果:PDGF-BB上调VSMCs中ZFAS1的表达。下调ZFAS1表达后,VSMCs的增殖和迁移受到抑制(P0.05),miR-150表达水平上升(P0.05),ROCK1表达水平下降(P0.05)。萤光素酶报告基因实验结果显示miR-150能直接靶向调控ROCK1。抑制miR-150表达后,能减弱下调ZFAS1表达导致的VSMCs增殖和迁移的抑制作用(P0.05),上调ROCK1的表达水平(P0.05)。结论:ZFAS1通过调控miR-150/ROCK1促进PDGF-BB诱导的VSMCs增殖和迁移。     

叶酸通过下调ERK1/2信号通路抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移

目的:探讨叶酸(folic acid,FA)对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移的影响及其机制。方法:取SD大鼠的主动脉,采用组织贴块法培养VSMCs,随机分组进行实验。采用CCK-8和Ed U法检测叶酸对VSMCs活力和增殖能力的影响。采用划痕实验和Transwell法检测叶酸对VSMCs迁移和侵袭的影响。采用Western blot法检测细胞增殖核抗原(PCNA)蛋白表达以及血小板源性生长因子受体(PDGFR)和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白的磷酸化水平。结果:叶酸抑制血小板源性生长因子(PDGF)诱导的VSMCs的活力,并呈浓度依赖性(P0.05)。叶酸抑制PDGF诱导的VSMCs的迁移,并呈浓度依赖性(P0.05)。叶酸降低PCNA表达和PDGFR磷酸化水平,并抑制PDGF激活的ERK1/2信号通路。结论:叶酸降低PDGF诱导的VSMCs PCNA和p-PDGFR蛋白水平,下调ERK1/2信号通路,从而抑制VSMCs的增殖和迁移。     

KLF4过表达抑制人白血病K562细胞系的增殖及迁移

目的探索人锌指转录因子Krüppel样因子4(KLF4)过表达对人慢性髓系白血病细胞K562增殖及迁移能力的影响。方法设稳定过表达KLF4的白血病K562细胞系作为实验组(命名为K562-KLF4细胞),空白K562细胞及空质粒转染的K562细胞(命名为K562-C1细胞)作为对照组。实时荧光定量PCR检测各组细胞KLF4mRNA的表达含量;Western blot检测各组细胞KLF4的蛋白相对表达含量;MTS法检测各组细胞的增殖水平;Transwell检测各组细胞的迁移能力。结果 K562-KLF4细胞KLF4 mRNA的相对表达量比2个对照组明显增高(P0.05);与对照组相比,K562-KLF4细胞KLF4蛋白相对表达含量明显增加(P0.05),其过表达率为77.78%;K562-KLF4细胞增殖和迁移能力明显被抑制(P0.05)。结论 KLF4过表达能抑制K562细胞的增殖及迁移能力。     

STAT3介导了血小板源性生长因子BB诱导的大鼠血管平滑肌细胞Pim-1表达

 目的： 观察血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)是否可以诱导大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）表达Pim-1及Pim-1对VSMCs增殖的影响,探讨STAT3信号分子在这一过程中的作用,为血管重建性疾病（VRD）的研究提供实验依据。方法： 不同浓度PDGF-BB作用不同时间刺激体外培养的VSMCs,用细胞计数法检测增殖;用real-time RT-PCR 检测Pim-1 mRNA表达水平;Western blotting 检测STAT3 的活性变化;用放线菌素D（actinomycin D）、AG490（JAK特异性抑制剂）及siRNA沉默Pim-1和STAT3进行干预。结果： PDGF-BB（20 μg/L）作用VSMCs 24 h,可以诱导细胞增殖,Pim-1沉默抑制了这一过程;正常未经处理的VSMCs Pim-1 mRNA表达量较低,不同浓度PDGF-BB（10 μg/L~50 μg/L ）作用VSMCs 1 h,Pim-1 mRNA表达明显增加,其中以20 μg/L最显著;用PDGF-BB（20 μg/L）作用VSMCs 不同时间（0.5 h~4 h）,可显著上调Pim-1 mRNA表达,以0.5 h最显著。用actinomycin D及AG490预处理后Pim-1 mRNA表达随之降低。PDGF-BB可激活VSMCs中磷酸化STAT3水平,AG490和转染STAT3-siRNA可抑制 STAT3的磷酸化以及相应的Pim-1 mRNA表达。结论： PDGF-BB可通过Pim-1调节VSMCs增殖;STAT3可能参与了PDGF-BB诱导的VSMCs Pim-1表达。     

Src/Stat3通路在高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖及迁移中的作用

目的:探讨Src酪氨酸激酶(Src)/信号转导子和转录激活子3(Stat3)在高糖(HG)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移中的作用。方法:首先将VSMC细胞株A7R5与HG(10~40 mmol/L)共同孵育24h,MTT法及EdU染色检测VSMCs增殖,Transwell小室检测VSMCs迁移,Western blot检测p-Src、Src、p-Stat3和Stat3的蛋白水平。q PCR检测Stat3靶基因细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、Myc、基质金属蛋白酶2(MMP2)及基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达。为了进一步证实Src在高糖诱导VSMCs增殖和迁移中的作用,将HG与Src抑制剂saracatinib(100 nmol/L)共同孵育24 h,观察Src对HG诱导VSMCs增殖、迁移及Stat3激活的影响。结果:HG能浓度依赖性地促进VSMCs的增殖及迁移并激活Src和Stat3,上调Stat3靶基因cyclin D1、Myc、MMP2及MMP9的表达。抑制Src激活可抑制HG诱导的VSMCs增殖及Stat3的激活,同时下调cyclin D1及Myc的表达。结论:Src/Stat3通路可能在HG诱导的VSMCs增殖及迁移中发挥重要作用。     

氟伐他汀对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响及其机制

目的：探讨氟伐他汀(Flu)对血小板源生长因子(PDGF-BB)和内皮素-1(ET-1)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移的影响及其机制。 方法： VSMCs源于8周龄自发性高血压大鼠(SHR)的胸主动脉，组织块外生法体外培养VSMCs，采用改良的Boyden微孔膜双槽法测定细胞迁移，荧光染料Fura-2/AM法测定细胞内游离钙离子浓度(［Ca2+］i)。 结果： (1) PDGF-BB和ET-1可诱导VSMCs迁移，作用峰值浓度分别为10 μg/L和10-7 mol/L。Flu(10-9-10-5mol/L)呈浓度依赖性抑制上述物质诱导的细胞迁移，10-5mol/L Flu对PDGF-BB和ET-1诱导的细胞迁移的抑制率达86.67％以上。 (2)PDGF-BB和ET-1促进［Ca2+］i升高(P<0.05)，峰值浓度分别为PDGF-BB 10 μg/L和ET-1 10-8mol/L。 (3) Flu明显抑制PDGF-BB和ET-1诱发的［Ca2+］i升高，峰抑制率分别为86.76％和65.32％。 结论： Flu可抑制PDGF-BB和ET-1诱导的VSMCs迁移，Flu抑制［Ca2+］i的升高可能是它抑制VSMCs迁移的机制之一。     

IQGAP1 promotes the phenotypic switch of vascular smooth muscle by myocardin pathway: a potential target for varicose vein

Recently, the architectural remodeling of venous vessel wall ranks as the basis of varicose veins development based on the phenotypic state of vascular smooth muscle cells (VSMCs). In this study, we firstly demonstrated an obvious up-regulation of IQ-domain GTPase-activating protein 1 (IQGAP1) in patients with varicose veins. Importantly, following stimulation with PDGF-BB for 4 h, a common inducer of phenotypic switch in VSMCs, a dramatically time-dependent increase in IQGAP1 expression was observed in human venous smooth muscle cells (HUVSMCs), concomitant with the down-regulation of SMC markers [including α-smooth muscle actin (SMA), smooth muscle calponin (CNN), SM22α (SM22)], suggesting a critical function of IQGAP1 during the switch of synthetic VSMC phenotype. Further analysis ascertained that IQGAP1 overexpression significantly inhibited the expression of SMA, SM and CNN, while its silencing dramatically promoted their expression levels. Moreover, the elevated IQGAP1 enhanced cell proliferation, migration and rearrangement. Mechanism assay confirmed that IQGAP1 overexpression notably blocked myocardin levels. Importantly, after transfection with myocardin siRNA, IQGAP1 down-regulation-induced decrease in cell proliferation, migration and cell rearrangement was remarkably attenuated. Together, these results demonstrated that IQGAP1 may regulate the phenotypic switch of VSMCs by myocardin pathway, which is critical for the pathological progression of varicose vein. Therefore, this study supports a prominent insight into how IQGAP1 possesses its benefit function in varicose veins development by regulating vascular remodeling.     

阿魏酸钠对血管平滑肌细胞热休克蛋白27磷酸化的影响

目的： 研究阿魏酸钠对血管紧张素II（angiotensinⅡ,AngII）与血小板源性生长因子-BB（platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB）诱导的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）中热休克蛋白27（heat shock protein 27,HSP27）磷酸化的影响。方法：采用体外培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞；用特异性的单克隆phospho-HSP27抗体的蛋白印迹法（Western blotting）检测HSP27的活性。结果：阿魏酸钠以剂量依赖性方式抑制AngII和PDGF-BB诱导的HSP27磷酸化，在10-4 mol/L〖JP2〗时抑制作用最明显，最大抑制率分别为39.0%（P<0.05）和56.8%（P<0.01）。结论：阿魏酸钠具有明显抑制由AngII和PDGF-BB诱导的VSMCs HSP27磷酸化的作用。     

辛伐他汀抑制胎牛血清及PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖及对抑癌基因PTEN表达的影响

目的:观察辛伐他汀(simvastatin)对血清及血小板源生长因子(PDGF-BB)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的抑制作用及simvastatin对细胞周期和G₁/S周期转换重要调节基因PTEN蛋白表达的影响。方法:[³H]-胸腺嘧啶核苷酸掺入测定VSMCsDNA合成,流式细胞仪检测细胞周期情况,Western印迹杂交法检测PTEN蛋白表达。结果:Simvastatin以剂量依赖关系抑制血清及PDGF-BB诱导的VSMCs[³H]-胸腺嘧啶核苷酸掺入,使G₀/G₁期细胞比例明显增多,S期细胞比例显著减少,并上调PTEN蛋白表达,而3羟3甲戊二酰辅酶A代谢产物甲羟戊酸能抑制simvastatin上调PTEN的表达。结论:Simvastatin抑制血清及PDGF-BB诱导的VSMCs增殖阻滞细胞周期可能与上调PTEN表达有关,且simvastatin调节PTEN的表达可能通过抑制甲羟戊酸的合成而实现。     

胚胎血管发育早期PDGF-BB对血管平滑肌细胞趋化的影响

目的：建立胚胎血管发育早期血管平滑肌细胞（VSMCs）趋化模型，并观察胚胎血管发育早期血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）对VSMCs趋化的影响。方法：采用转染平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下表达增强型绿色荧光蛋白（GFP）报告基因载体的胚胎干细胞制备拟胚体，然后接种于under-agarose凝胶作为平滑肌细胞趋化模型。用慢速视频显微摄像技术观察拟胚体分化后表达GFP的VSMCs，分析比较不同浓度PDGF-BB对VSMCs分化和移行的影响。结果：在under-agarose凝胶中，拟胚体在无外源性生长因子存在的条件下可自发向心肌细胞、内皮细胞和VSMCs分化。拟胚体贴壁分化20 d时，对照组及4 种浓度PDGF-BB（5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L）组VSMCs的平均迁移速率分别为（94.07±23.80）μm/h、（118.08±31.63）μm/h、（173.53±24.58）μm/h、（380.74±39.56）μm/h和（335.62±32.16）μm/h，峰值浓度为20 μg/L。经浓度大于10 μg/L PDGF-BB处理后，VSMCs向PDGF-BB孔方向移行，对照组、低浓度PDGF-BB组VSMCs呈不规则性迁移。结论：该模型能够模拟胚胎血管发育早期全过程，可用于研究不同生长因子对VSMCs趋化的影响。外源性PDGF-BB能定向诱导胚胎血管发育早期VSMCs迁移，其定向趋化作用在一定浓度范围内呈量效关系。     

TNF-α通过调控KLF4抑制口腔鳞癌细胞CAL27增殖

目的：探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）通过上调口腔鳞癌细胞CAL27中Krüppel样因子4（KLF4）表达对细胞增殖的影响。方法：用不同浓度的TNF-α（0、25、5、10、20 ng/ml）处理CAL27细胞24 h,免疫印迹试验（Western blot）检测KLF4表达变化;用20 ng/ml TNF-α处理细胞,分别于24 h、48 h、72 h用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖变化;构建过表达KLF4的CAL27细胞,MTT检测其对细胞增殖的影响;MTT检测沉默KLF4（siKLF4）及siKLF4联合TNF-α 处理对细胞增殖能力的影响。结果：MTT检测发现TNF-α可抑制细胞增殖;TNF-α可呈剂量依赖性地诱导CAL27细胞中KLF4表达;Western blot和qPCR检测显示成功构建过表达KLF4的CAL27细胞;过表达KLF4可抑制细胞增殖;沉默KLF4可部分恢复TNF-α对CAL27细胞增殖的抑制作用。结论：TNF-α可诱导口腔鳞癌细胞CAL27中KLF4表达增加,KLF4可能参与了TNF-α对CAL27细胞增殖的抑制作用。