抗CD19 CAR-T对K562~(CD19+)肿瘤细胞特异性杀伤作用的研究

目的构建表达抗CD19分子的嵌合抗原受体,制备抗CD19 CAR-T细胞,研究其对CD19表型细胞的特异性识别和杀伤效果。方法通过分子克隆方法,构建能够自剪切EGFP荧光报告的抗CD19 CAR分子,将其重组到慢病毒载体中并包装获得慢病毒。通过慢病毒递送的方式,将抗CD19 CAR过表达于primary-T细胞,流式细胞术分析确认表达后,通过ELISA检测CAR-T细胞IL-2分泌情况,最后用LDH释放法评价靶向杀伤作用。结果成功获得抗CD19 CAR的慢病毒递送载体;流式细胞术表明CAR分子在T细胞表面高效稳定表达;ELISA结果显示CAR-T细胞在靶细胞刺激下IL-2分泌水平显著升高(P0.01);LDH结果显示CAR-T细胞特异性杀伤CD19表型细胞,且杀伤效果在E:T=10:1时达到50%以上,显著高于对照组(P0.05)。结论成功获取了具有靶向CD19表型细胞的CAR-T细胞,能高效特异性杀伤肿瘤细胞。     

靶向HER2的通用型CAR-T细胞来源的细胞外囊泡的制备及功能鉴定

目的 利用可持续传代的T淋巴细胞系,制备携带靶向人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外囊泡(EV),并检测其对HER2⁺肿瘤细胞的杀伤能力。方法 采用分子克隆技术构建重组慢病毒质粒。利用成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术和慢病毒感染的方法构建底盘Jurkat细胞。流式细胞术检测底盘Jurkat细胞、嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞和CAR-Jurkat细胞的构建。通过聚乙二醇6000(PEG6000)浓缩方法和细胞挤压方法制备EV;微粒子追踪分析(NTA)和Western blot法鉴定EV。萤光素酶报告基因系统检测细胞和EV对肿瘤细胞的杀伤作用。荧光显微镜观察免疫细胞对EV的吞噬作用。结果 酶切鉴定和基因测序结果表明重组质粒构建成功。流式细胞术结果显示底盘Jurkat细胞、 CAR-T细胞和CAR-Jurkat细胞顺利制备。NTA结果显示制备的EV大小正确。萤光素酶报告基因系统证明CAR-T细胞、 CAR-Jurkat细胞、 CAR-T EV和CAR-Jurkat EV对HER2<...     

高浓度钾离子对嵌合抗原受体CAR-T细胞扩增及功能的影响

目的探索高浓度钾离子条件对嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的体外培养及杀伤能力的影响。方法体外使用间皮素特异靶向的嵌合抗原受体Meso-CAR改造T细胞,在激活或扩增阶段使用高浓度钾离子培养基,通过细胞计数、流式细胞术分析CD4+和CD8+T细胞扩增及PD-1细胞表面表达等情况,并通过荧光素酶检测细胞杀伤能力。结果高浓度钾离子不影响Meso-CAR CD4+和CD8+T细胞体外扩增,但可显著提升CAR-T细胞激活后表面PD-1的表达,并显著提高T细胞体外的杀伤能力。结论高浓度钾离子可以优化CAR-T细胞的体外改造并提高其杀伤能力。     

CD19-CAR-T和CD19-CAR-CIK细胞对表达CD19+K562细胞株杀伤作用的比较

目的 CAR-CD19-CIK和CAR-CD19-T效应细胞在体外对表达CD19的K562稳定细胞株杀伤能力和杀伤特异性的比较。方法效应细胞的构建是以通过基因合成和分子克隆手段构建CAR-CD19片段,以酶切的方法将CAR-CD19片段插入到慢病毒载体上;分离获得同一个健康志愿者外周血单核细胞,一部分加IFN-γ、重组人IL-1α、CD3单克隆抗体、重组人IL-2等细胞因子诱导CIK细胞产生;另一部分体外分选CD3阳性T细胞,CAR-19慢病毒同时感染CIK细胞和T细胞,采用流式细胞术检测转导效率和细胞分型;CD19+的靶细胞是由装载CD19基因表达的慢病毒载体转导K562细胞系,通过抗菌素的压力选择而构建;乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测CAR-CIK细胞和CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效率,炎性因子检测(CBA)法检测由CAR-CIK细胞和CAR-T细胞的细胞因子的分泌水平。结果同一CD19-CAR慢病毒载体在相同转导条件下,对原代CIK细胞的转导效率是60.5%,对原代T细胞的转导效率是36.2%;当效靶比5:1、10:1和20:1在这三种比例时,CAR-19-CIK细胞对CD19-K562细胞的杀伤效率分别为14.65%、33.08%和42.5%,对K562细胞的杀伤效率分别为8.3%、10.1%和24.9%;而CAR-19-T细胞对CD19-K562细胞的杀伤效率分别为17.22%、26.52%和32.49%,对k562细胞的杀伤效率分别为0.1%、3.6%和10.3%。结论 CAR-19-CIK细胞的杀伤作用明显强于CIK细胞;CAR-19-T细胞杀伤特异性比CAR-19-CIK细胞强。本研究对CAR-T和CAR-CIK免疫细胞治疗血液肿瘤的新策略和新临床方案设计提供了有意义的实验数据。     

scFv 亲和力对CAR-T 细胞抗肿瘤能力的影响

目的:比较抗原亲和力不同的scFv片段对CAR-T细胞增殖、分化和抗肿瘤能力的影响。方法:分别构建靶向ErbB2的FRP5(K_D=30 nmol/L)和chA21(K_D=11 nmol/L)CAR慢病毒表达载体,包装病毒后制备CD8~+CAR-T细胞;在CAR-T细胞扩增过程中,通过计数细胞来检测细胞增殖;利用流式细胞术检测CAR-T细胞分化情况;利用荧光素酶活性法检测杀伤活性;用ELISA检测CAR-T细胞在肿瘤识别过程中IL-2和IFN-γ的分泌情况;利用成像流式细胞仪检测scFv亲和力对CAR-T细胞形成免疫突触能力的影响。结果:成功构建了CD8~+ CAR-T细胞,FRP5和chA21 CAR阳性率均达50%左右;CAR-T细胞的增殖和分化状态没有差异;荧光素酶活性法显示chA21-CAR-T细胞裂解肿瘤细胞的能力较强;ELISA检测结果显示chA21-CAR-T细胞分泌细胞因子能力更强;chA21-CAR-T细胞形成免疫突触的能力更强。结论:包含高亲和力scFv的chA21-CAR-T细胞具有较强的抗原依赖性杀伤活性。     

共表达细胞因子IL-7和趋化因子CCL19/CCL21的第4代anti-CD19CAR-T细胞的开发与应用

目的 初步探讨共表达细胞因子IL-7和趋化因子CCL19或CCL21的anti-CD19 CAR-T细胞的功能特性及其在体外对人CD19+急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的杀伤效果,旨在优化CAR-T果。方法 通过亚克隆技术获得重组慢病毒质粒,慢病毒包装,转导原代T细胞获得2种第4代anti-CD19CAR-T细胞,分别命名为7×19 CAR-T细胞、7×21 CAR-T细胞。借助流式细胞仪和相关试剂盒检测了细胞CAR分子的转导效率、CAR-T细胞的趋化能力、增殖及凋亡情况等;钙黄绿素释放法检测CAR-T细胞的杀伤作用;共培养法检测CAR-T细胞因子的释放情况;2种第4代anti-CD19 CAR-T细胞组皆于原代T细胞、常规anti-CD19 CAR-T细胞作比较。结果 7×19 CAR-T、7×21 CAR-T细胞的功能特性皆有显著提高,主要表现在细胞增殖速度加快、细胞凋亡速率明显变慢、炎症因子IFN-γ、肿瘤坏死因子TNF-α的分泌量皆有所增加;且体外杀伤实验表明阳性率约40%的7×19 CAR-T、7×21 CAR-T细胞对CD19+肿瘤细胞Raji的杀伤效率高于阳性率约50%anti-CD19 CAR-T细胞(P0.01);结论 实验数据显示共表达细胞因子IL-7和趋化因子CCL19或CCL21的第4代anti-CD19 CAR-T细胞即7×19 CAR-T和7×21 CAR-T细胞相比第3代anti-CD19 CAR-T细胞和T细胞在趋化能力、细胞增殖、细胞凋亡、体外杀瘤效果以及细胞炎症因子的释放能力等方面皆有显著改善,初步证明了7×19 CAR-T细胞和7×21 CAR-T细胞的各项功能有所优化,对CD19+人急性淋巴细胞白血病治疗效果得到改善,为开发靶向CD19的新型CAR-T细胞提供了新思路,这种模式也为其它类型CAR-T细胞的开发开创了典范。     

嵌合抗原受体修饰T细胞研究进展及肿瘤靶抗原的选择

嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)是目前恶性肿瘤免疫治疗的一种新方法。CAR-T细胞对肿瘤的杀伤不依赖主要组织相容性复合体(MHC),并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和突破宿主免疫耐受状态,因此,CAR-T细胞在治疗肿瘤方面具有独特的优势。CAR-T细胞的构建和选择合适的靶分子是CAR-T细胞免疫治疗的两个关键的问题,我们在文中将围绕这两个问题做一综述。     

肿瘤过继性细胞免疫治疗的研究进展

过继性免疫细胞能调节并增加肿瘤患者的免疫功能,有效克服肿瘤免疫逃逸机制。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、自然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、树突状细胞(DC)、T细胞受体修饰的T细胞(TCR-T)和嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)分别以不同的机制直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞,达到治疗肿瘤的目的。     

嵌合抗原受体基因修饰的 NK 细胞治疗实体瘤的研究进展

随着嵌合抗原受体基因修饰的T(CAR-T)细胞疗法在血液肿瘤领域的成功应用,CAR 技术引起了广泛的关注。自然杀伤(NK)细胞作为先天免疫系统的重要效应细胞,用CAR 修饰NK 细胞(CAR-NK)同样有治疗恶性肿瘤的潜力,特别是在实体瘤方面。CAR-NK 细胞疗法在治疗胶质母细胞瘤、卵巢癌和乳腺癌等实体恶性肿瘤方面的研究已经开展且展现出一定的治疗效果。     

嵌合抗原受体基因修饰的T 细胞治疗实体瘤研究进展

靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)基因修饰的T细胞(CAR-T)在血液肿瘤治疗中取得了巨大成功。然而,迄今为止,由于特异性肿瘤抗原的缺乏、CAR-T细胞难浸润到肿瘤组织内部以及抑制性的肿瘤微环境等因素限制了CAR-T细胞对实体肿瘤的疗效。本文讨论与总结了在CAR-T细胞研究中针对实体瘤的靶点选择、增强免疫细胞向肿瘤迁移、克服肿瘤抑制微环境及联用免疫检查点阻断等新方法、新策略以增加CAR-T细胞对实体肿瘤的疗效,希望对临床前与临床CAR-T细胞治疗实体瘤研究提供新的思路与方向。     

过继T细胞免疫治疗的临床应用研究进展

过继T细胞免疫治疗是一种新的肿瘤治疗方法,其中细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞技术是目前临床开展应用最多的一种过继免疫细胞治疗;而基因修饰的T细胞,即T细胞受体修饰的T细胞和嵌合抗原受体修饰的T细胞技术则是目前过继免疫细胞治疗的热点,已从基础研究开始转变为临床应用,尤其是嵌合抗原受体修饰的T细胞,由于其汇集单克隆抗体技术、疫苗技术、细胞免疫技术的优势于一体,在血液病的临床应用中显示出其显著的治疗效果,并且已被逐步扩展到实体瘤临床应用方面,本文简要综述了三种过继免疫细胞治疗的原理及临床应用。     

CAR-T细胞免疫疗法的现状及展望

肿瘤细胞免疫治疗被公认为是继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗方法,免疫疗法嵌合型抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞疗法(CAR-T),属于过继性细胞免疫治疗,不仅在肿瘤治疗中取得突破性进展,在感染性疾病和自身免疫性疾病等治疗中也有良好的应用前景.现就CAR-T细胞免疫疗法的发展历史、临床应用、目前存在的问题以及最新研究成果作一综述.     

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞体外培养体系及慢病毒侵染条件的优化

目的优化嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞的体外培养体系及慢病毒侵染条件。方法 CD3磁珠分离纯化健康人外周血单个核细胞(PBMC)及健康孕妇脐带血单个核细胞(UCBMC),于8种不同培养体系进行扩增培养,培养体系包括以下成分的不同组合:重组人白细胞介素2(rhIL-2)、rhIL-12、rhIL-18、rhIL-7、 rhIL-21、 TWS119。分别于第0、 3、 5、 7、 10、 18天进行细胞计数检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)的表达, ELISA检测γ干扰素(IFN-γ)释放,优化T细胞体外培养体系。采用(0、 20、 50)μg/mL重组人纤连蛋白(RetroNectin~?),(250、 500、 1000)ng/mL抗人CD3/CD28抗体包被培养板,以感染复数(MOI)=3、 5的阴性对照慢病毒侵染T细胞72 h,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,初步判断病毒侵染效率;流式细胞术检测CD3/GFP阳性率,以获得慢病毒侵染条件。包装CD19 CAR慢病毒,实时荧光定量PCR、 Western blot法检测是否成功构建CD19 CAR慢病毒载体,采用以上优化的病毒侵染条件及T细胞培养体系,包括建立rhIL-2、 rhIL-12联合rhIL-18培养体系,使用1μg/mL抗人CD3/CD28, 20μg/mLRetroNectin~?包被培养板,制备CD19 CAR-T细胞。结果细胞增殖能力较佳体系为rhIL-2联合rhIL-18, IFN-γ释放最强体系为rhIL-2、 rhIL-12联合rhIL-18。抗CD3/CD28抗体剂量为1μg/mL, RetroNectin~?20μg/mL, MOI为3时病毒侵染效率最优。该优化条件下CAR-T细胞阳性率达34%。结论获得优化的CD19 CAR-T细胞体外培养体系及慢病毒侵染原代T细胞条件。     

嵌合抗原受体修饰T细胞在肿瘤免疫治疗中的策略

正手术、化疗和放疗是治疗肿瘤的传统方法,但大部分情况下患者都不能获得理想的疗效。近年来,嵌合抗原受体修饰T细胞通过基因工程,赋予T细胞肿瘤靶向性、更强的杀伤活性和持久的生命力,并取得较好的临床疗效。然而,脱靶效应、细胞因子风暴等毒性效应却极大地限制了CAR-T细胞技术的应用。本文就提高CAR-T细胞在治疗恶性肿瘤临床疗效方面进行如下综述。1 CAR-T细胞的基本结构和发展历程     

CAR-T细胞在肿瘤临床试验中的研究进展

以嵌合型抗原受体(CAR)为基础的细胞治疗近年成为肿瘤生物治疗领域最亮丽的明星。尤其是靶向CD19分子的CAR-T细胞在B淋巴细胞恶性肿瘤的临床治疗中取得了良好的疗效。本文通过总结国内外CAR-T细胞的临床试验数据,对其临床疗效和潜在的不良反应进行统计分析,并就CAR-T细胞的发生、临床应用及存在的问题进行阐述。     

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞在肿瘤治疗中的研究进展

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞疗法是肿瘤免疫疗法中的一种。该疗法主要原理是将癌症患者的T细胞经基因工程转化为体内表达嵌合肿瘤细胞表面抗原受体的CAR-T细胞,再将其回输到患者体内,使之特异性识别并杀伤肿瘤细胞,从而达到治疗的目的。通过不断且有效的临床试验, CAR-T细胞疗法现已被应用于临床治疗,且在淋巴造血系统恶性肿瘤的治疗中已有显著的成效,但其在实体瘤中的治疗效果并不理想。目前该疗法的难点主要在于如何减少甚至避免治疗过程中出现的包括细胞因子释放综合征和靶位缺失效应等在内的不良反应。对此,近几年业内对该疗法的改进主要集中于改善CAR-T细胞结构、寻找合适的靶点,与具有凋亡调节作用的检查点抑制剂结合使用等方法来提高该疗法的疗效及其安全性。     

表达anti-CD19-CAR协同沉默PD-1的慢病毒载体重构

本研究通过PCR方法扩增含EF1a启动子的DNA片段,利用同源重组酶将该DNA片段整合到pGreenPuro-shRNA慢病毒载体CMV启动子下游,获得新的多启动子慢病毒载体pGreenPuro-Dual。同时,在改造的慢病毒载体的CMV启动子下游插入鼠源anti-CD19-CAR片段,并在H1启动子下游EcoRI和BamHI酶切位点之间插入PD-1shRNA片段,重组获得pGreenPuro-Dual/anti-CD19-CAR/shRNA PD-1慢病毒载体,重组质粒与2个辅助质粒共转染HEK293FT细胞包装重组慢病毒颗粒。利用包装病毒感染HEK293T细胞后,荧光观察病毒感染效率,并提取细胞总蛋白Western blotting检测antiCD19-CAR以及PD-1的表达。结果显示表达anti-CD19-CAR以及shRNA PD-1的重组慢病毒成功感染了HEK293T细胞,鼠源anti-CD19-CAR成功表达,同时PD-1蛋白被有效沉默。     

靶向B7-H3的CAR-T细胞在实体瘤免疫治疗的研究进展北大核心CSCD

近年,以嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)为代表的过继细胞免疫疗法在血液系统肿瘤中的治疗取得了突破性进展。然而对于实体瘤的治疗,CAR-T疗法仍面临着一系列挑战。肿瘤异质性、T细胞归巢效率低下、肿瘤免疫抑制性微环境和特异性抗原的缺乏是限制CAR-T在实体瘤中发挥作用的重要因素。B7-H3是B7免疫球蛋白超家族成员,在多种实体瘤中高表达,作为肿瘤免疫治疗的分子靶点受到广泛关注。本文总结了B7-H3的分子特点及其在肿瘤中的功能,并对以B7-H3为靶点的CAR-T疗法在实体瘤中的研究进展做一综述。     

以糖蛋白类肿瘤标志物为靶向的嵌合抗原受体修饰T细胞研究进展

嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,CAR)修饰T细胞是目前肿瘤治疗中新的靶向疗法,通过单链抗体(singlechainfragmentvariable,scFv)-共刺激分子-T细胞信号转导区构成的嵌合模式修饰T细胞,赋予T细胞非MHC依赖性靶向杀伤肿瘤细胞的能力,在动物模型及临床试验中取得了良好的效果.糖蛋白类肿瘤标志物由于其良好的靶向性成为了CAR修饰T细胞新的靶点,针对糖蛋白类肿瘤标志物的靶向研究显示出良好的临床前景,但是也考虑到脱靶效应,转染方式等问题对该治疗在临床运用的限制.相信随着研究的逐渐深入,基于CAR修饰T细胞的糖蛋白类肿瘤标志物靶向治疗会取得更大的突破.     

嵌合抗原受体T细胞技术的介绍及研究进展

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)是一种过继性细胞免疫治疗(ACI),并在近年来得到迅猛发展.通过导入外源基因使T细胞表达嵌合抗原受体(CAR),在肿瘤免疫效应上表现高特异性、靶向性、MHC非限制性等特点.目前,CAR-T技术已经发展至第三代,即表达于T细胞表面的CAR分子由胞外抗原识别区和胞内双信号产生区构成,该结构保障了CAR-T细胞与靶细胞接触时收到双信号的激活以发挥最大的抗肿瘤效应.但同时CAR-T细胞在临床应用中也存在如脱靶效应、细胞因子风暴等风险,需要急待解决.