Epstein—Barr病毒载体介导的白细胞介素12在肝癌 …

目的 研究白细胞介素－１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２，ＩＬ－１２）在肝癌细胞靶向性表达，探索肝癌基因治疗新方法，方法 将白介素－１２分别克隆到带有人甲胎蛋白启动子和增强子的Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ（ＥＢ）病毒载体中，得到重组表达载体ｐＥＢＡＦ／Ｐ３５和ｐＥＢＡＦ／Ｐ４０，分别在４种细胞系中作共转染，用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测     

IL—12表达的诱导与调节

ＩＬ－１２是一种ｐ３５与ｐ４０结合成的异二聚体分子，在Ｂ细胞，单核细胞，角质细胞以及ＤＣ中都有表达活性。ＩＬ－１２ｐ４０的基因转录，受到ｅｔｓ－２、ＮＦｋＢ的调节，ＩＬ－１２ｐ３５则为持续表达，但其表达的水平却为ＩＬ－１２表达的限速因子。前列腺素Ｅ２、ＩＬ－４、细胞脂多糖、ＣＤ４０分子以及一氧化氮等对ＩＬ－１２的表达都有重要的调节作用。     

IL-12表达的诱导与调节

ＩＬ－１２ 是一种ｐ３５ 与ｐ４０ 结合成的异二聚体分子,在Ｂ细胞、单核细胞、角质细胞以及ＤＣ 中都有表达活性。ＩＬ－１２ｐ４０ 的基因转录,受到ｅｔｓ－ ２、ＮＦｋＢ 的调节,ＩＬ－１２ｐ３５ 则为持续表达,但其表达的水平却为ＩＬ－１２ 表达的限速因子。前列腺素Ｅ２、ＩＬ－４、细菌脂多糖、ＣＤ４０ 分子以及一氧化氮等对ＩＬ－１２ 的表达都有重要的调节作用     

重组人甲胎蛋白基因顺式调控元件功能的研究

将６种含有人甲胎蛋白（ＡＦＰ）基因启动子、增强了和／或沉寂子不同组合的荧光素酶报告基因真核表达载体分别转染３种人肝癌细胞系及１种肺腺癌细胞系，测定瞬时表达的荧光素酶活性。结果显示６种重组人ＡＦＰ基因顺式作用元件在ＡＦＰ阳性肝癌细胞均具有特异启动活性，而在ＡＦＰ阴性的肝癌细胞和非肝癌细胞无启动活性。在这６种重组人ＡＦＰ顺式元件中，以２．２ｋｂ的调控元件（去除了ＡＦＰ基因沉寂子。保留其启动子和增强子序列）启动活性最高，从而为下一步的靶向性肝癌基因治疗提供了较理想的肝癌细胞特异性启动元件。     

应用重组PCR技术克建人单链白细胞介素12融合基因

目的 构建人单链白细胞介素１２（ｈｓｃＩＬ－１２）融合基因并在真核细胞中进行表达,为进一步研究ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法 应用重组ＰＣＲ技术将ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位两段编码序列的ｃＤＮＡ通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３碱基序列进行前后拼拼（ＩＬ－１２ｐ４０－多肽接头－ｐ３５）,构建ｈｓｃＩＬ－１２融合基因,并进行核苷酸序列测定,进一步将ｈｓｃＩＬ－１２融合基因插入ｐｃＤＮＡ３．１真核表达载体中,转染ＣＯＳ－７细胞表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白,并行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 该融合基因经ＤＮＡ序列分析表明：ｐ４０、ｐ３５、ｌｉｎｋｅｒ的连接顺序、方向及序列完全正确,融合基因可在ＣＯＳ－７细胞中表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示该融合蛋白分子     

人可溶性IL-6R基因在COS7细胞中的表达及活性分析

目的在ＣＯＳ７细胞中表达具有生物学功能的人可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｓＩＬ－６Ｒ），作为研究ｓＩＬ－６Ｒ结构与功能关系的基础。方法首先利用ＰＣＲ技术扩增出人可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｈｓＩＬ－６Ｒ）编码基因片段，并重组入克隆载体ｐＡＬＴＥＲ－１。通过基因序列分析确定了目的基因的核苷酸序列，并进一步构建了由ＳＶ４０晚期启动子和ＨＣＭＶ早期启动子控制的表达质粒ｐＳＶＬ６Ｒ和ｐＣＭＶ６Ｒ。用脂质体介导的方法将表达质粒转染ＣＯＳ７细胞，并分别在ｍＲＮＡ水平（斑点杂交）和蛋白水平（ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）检测ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的表达。在７ＴＤ１，ＬＴ１２两种ＩＬ－６反应细胞系上检测转染细胞上清（含ｓＩＬ－６Ｒ）的生物学活性。结果在ｍＲＮＡ水平和蛋白水平分别检测到ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的表达，表达产物分子量约为５００００。表达产物在７ＴＤ１，ＬＴ１２细胞系上检测到明显的生物学活性。结论天然ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的成功表达为进一步制备ｓＩＬ－６Ｒ突变体及其结构与功能关系的研究奠定了基础     

腺病毒介导入B7—1基因对肝癌细胞免疫原性的影响

目的 研究同时含人ｐ５３、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１、ＩＬ－２基因的重组腺病毒载体Ａｄ－ｍｕｌｔｉｇｅｎｅｓ,对肝癌细胞免疫原性的影响。方法 应用人外周血淋巴细胞和肿瘤细胞的混合培养、外周血Ｔ淋巴细胞杀伤活性试验,分析导入目的基因的人肝癌细胞免疫原性的变化。结果 导入Ａｄ－ｍｕｌｔｉｇｅｎｅｓ的肝癌细胞系ＨｅｐＧ２、ＢＥＬ－７４０２,体外能刺激正常人外周血Ｔ淋巴细胞的增殖,并能增强Ｔ淋巴细胞的杀瘤细胞活性,加入ＩＬ－１２有协同增强作用。结论 肝癌细胞导入含Ｂ７－１基因的Ａｄ－ｍｕｌｔｉｇｅｎｅｓ后,其免疫原性得到增强。     

复制缺陷型人IL-2重组腺病毒的制备与鉴定

目的将人ＩＬ－２的重组腺病毒载体与Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ末端肽复合物同源重组，高效制备人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒，并进行体外表达和活性检测。方法将含全部编码序列的人ＩＬ－２ｃＤＮＡ置于真核表达载体ｐＣＩｃｃ的ＣＭＶ启动子下游，切出含ＣＭＶ启动子、人ＩＬ－２ｃＤＮＡ和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号肽序列的ＣｌａＩ片段，插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘｌｏｗ，选择左向转录的人ＩＬ－２重组腺病毒载体ｐＡｘｌｃｗ．ＣＩｈＩＬ－２与经ＥｃｏＴ２２Ⅰ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞；通过同源重组获得人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒；体外转染人宫颈癌ＨｅＬａ细胞、人Ｔ细胞淋巴瘤Ｈｕｔ７８细胞和原代人皮肤成纤维细胞。结果扩增到的病毒滴度达２．１×１０９ＰＦＵ／ｍｌ；体外转染的人肿瘤细胞均检测到ＩＬ－２的表达（４００～２６００Ｕ／１０６细胞／２４小时）。结论所制备的复制缺陷型重组腺病毒能有效介导人ＩＬ－２的基因转移，可望用于肿瘤基因治疗的临床研究。     

人FKBP12基因可溶性表达及活性研究

目的 获得具有生物学活性的ｈＦＫＢＰ１２,以筛选新型的促神经再生药物。方法 构建原核表达载休ｐＥｘＳ３－ｅＩ／ｈＦＫＰ１２,并在ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＥ菌株中进行可溶性高效表达。表达上清经ＧＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ一层析。结果 获得电泳纯的ｈＦＫＢＰ１２。活性测定结果表明,纯化后的ｈＦＫＢＰ１２显示具有较强的肽基脯基顺反异构酶活性。结论 原核表达的ｈＦＫＢＰ１２具有天然生物学     

人甲胎蛋白基因顺式作用元件的重新组合

本研究采用ＤＮＡ重组技术及ＰＣＲ方法对人甲胎蛋白（ＡＦＰ）基因顺式调控元件＋２９ｂｐ至－５．１ｋｂ区进行改造，将改建的ＤＮＡ片段分别克隆到荧光素酶报告基因载体ｐＧＬ２－Ｂａｓｉｃ中，构建了６种含有ＡＦＰ基因增强子和／或沉寂子不同组合的载体。以期筛选出对人肝癌细胞特异的，具有强启动活民生的ＡＦＰ顺序调控元件组合，为进一步实行肝癌基因治疗提供依据。     

利用乳糖化羧甲基壳聚糖构建小鼠OX40转基因细胞株

目的利用乳糖化羧甲基壳聚糖（Lac-CMCS）构建小鼠OX40转基因细胞株，探讨Lac-CMCS在HepG2细胞定向转染中的可行性。方法从ConA活化的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA，应用RT-PCR方法，扩增获得编码小鼠OX40分子的cDNA，并将其克隆到pUCm-T载体，测序证实后构建pIRLS2-EGFP-OX40重组真核表达载体，利用Lac-CMCS与载体偶联靶向性转染HepG2细胞，G418筛选，RT-PCR法鉴定获得表达OX40分子的阳性细胞株。结果pUCm-T-OX40和pIRFE2-EGFP-OX40经PCR、酶切和测序分析，证实插入的目的片段与GenBank记载的小鼠OX40 cDNA序列完全一致。利用Lac-CMCS能将小鼠OX40靶向转染HepG2细胞并获得表达；经G418筛选后获得稳定表达小鼠OX40的细胞株。结论利用Lac-CMCS能够成功将OX40靶向转染入HepG2细胞中。     

食管癌低表达cDNA片段C6-2A的克隆及表达分析

目的　克隆人食管癌发生相关的基因。方法　用ｍ Ｒ Ｎ Ａ 差异显示技术分离、克隆食管癌组织中不表达或低表达的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段,再通过 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 、ｄｏｔ ｂｌｏｔ 和 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 证实。结果　获得２８０ｂｐ 的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段,命名为 Ｃ６２ Ａ。与 Ｇｅｎ Ｂａｎｋ 基因数据库比较,未发现 Ｃ６２ Ａ 与任何已知基因有同源性。查询 Ｅ Ｓ Ｔ 数据库,发现 Ｃ６２ Ａ 与ｎｅ２７ｂ０３ ,ｓ１ Ｎ Ｃ Ｉ Ｃ Ｇ Ａ Ｐ Ｃ０３ 人ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆８９８５４１ 及人卵巢肿瘤ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆７５５１９６ 等高度同源。 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 结果显示６／６ 例食管癌组织表达丧失或低表达,ｄｏｔ ｂｌｏｔ 分析表明７／８例食管癌组织低表达, Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 显示食管癌细胞系 Ｅ Ｃ１０９ 、 Ｅ Ｃ８７１２ 、 Ｅ Ｃ９７０６ 和肺腺癌细胞系 Ｇ Ｌ Ｃ８２ 极弱表达,１７／２０ 例食管癌组织表达丧失或低表达,胎儿食管、皮肤、大脑、胎盘较高表达,胎儿胃、肝较弱表达,胎儿心、小肠、肾不表达。结论　在食管癌细胞系和食管癌组织高频率的不表达或低表达提示, Ｃ６２ Ａ 很可能与食管癌的发生、发展有关。     

病毒介导的P53低表达HepG2细胞株的建立

目的构建干扰P53的逆转录病毒载体,建立稳定低表达P53的HepG2细胞株。方法合成干扰P53基因的寡核苷酸序列插入pMSCV-hyg-U6质粒,转化受体菌DH5α,经酶切测序鉴定后瞬时转染HepG2细胞,通过半定量RT-PCR方法检测P53 mRNA表达水平评估干扰效果;选择干扰效果最好的重组质粒转染PT67细胞进行病毒包装,获得逆转录病毒颗粒感染HepG2细胞,通过Hygromycin筛选获得多个细胞克隆,Western blot检测P53蛋白的表达情况;选择P53表达水平最低的细胞克隆。通过5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导凋亡实验,检测P53低表达的HepG2细胞p53通路介导的细胞凋亡情况。结果经酶切和测序验证成功构建重组病毒载体;瞬时转染HepG2细胞后P53 mRNA表达下调;病毒颗粒感染HepG2细胞后P53的mRNA、蛋白表达下调;用5-FU处理后P53低表达HepG2细胞凋亡水平明显低于对照。结论成功构建了干扰P53的逆转录病毒载体,建立了P53低表达HepG2细胞株,明显阻断了P53通路依赖的细胞凋亡。     

乙型肝炎病毒在体内外抑制补体C3和C4表达的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)对补体C3和C4表达的影响,并探讨其调节机制.方法 采用基因芯片筛选HepG2和HepG2.2.15细胞的差异表达基因,免疫比浊法检测HBV患者和健康对照者补体C3和C4血清学水平,将HBV感染性克隆pHBV1.3转染HepG2细胞,RT-PCR和Western blot法检测C3和C4表达水平的变化.结果 补体C3和C4 mRNA在HepG2.2.15细胞中水平降低;C3和C4在慢性乙型肝炎患者和肝癌患者的血清学水平明显低于健康对照者(P＜0.05);HBV能够在mRNA和蛋白水平下调C3和C4的表达.结论 HBV能够在体内外抑制补体C3和C4的表达.     

逆转录病毒介导DNA修复蛋白在人骨髓细胞中的表达和抗性研究

目的增强造血细胞对化疗药物的耐药表型,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率及耐药基因的特性和在造血细胞保护性基因治疗中的作用和意义.方法应用RT-PCR从人肝组织中获得编码六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)cDNA,将其克隆于pGEM-T质粒载体并构建了逆转录病毒载体G1Na-MGMT,应用脂质体LipofectAMINE基因转移法将后者导入GP+E86和PA317病毒包装细胞,以BCNU加压筛选后的阳性克隆上清经乒乓效应后继而感染K562细胞和人造血细胞.应用PCR,Southernblot,RT-PCR,Westernblot及MTT法检测人MGMT基因在细胞中的转移和表达.结果酶切鉴定及DNA测序证实其MGMTcDNA克隆的正确性,脂质体介导方法成功将其导入病毒包装细胞,BCNU加压筛选和乒乓感染法使病毒效价达8.6×106CFU/ml,逆转录病毒载体介导的MGMT基因在K562细胞及人造血细胞中获得有效转移和表达.结论MGMT耐药基因的成功克隆并导入骨髓造血细胞且获高效表达对开展肿瘤基因治疗的临床研究奠定了实验基础.     

PTEN基因的克隆及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人抑癌基因PTEN全长cDNA,构建其真核表达载体并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法采用RT-PCR法从人正常肝组织中扩增PTEN全长cDNA,将之与pMD18-T Simple Vector连接、测序,获得PTEN基因。将该基因与pcDNA3·1( )载体连接,构建pcDNA3.1-PTEN真核表达载体。用该载体转染HepG2细胞,RT-PCR检测PTEN的表达。结果酶切和测序证实PTEN基因克隆和真核表达载体构建成功。HepG2-PTEN细胞中PTEN mRNA的表达显著高于未转染的HepG2细胞。结论人抑癌基因PTEN在人肝癌细胞系HepG2细胞中能够高效、稳定地表达,为其在肝癌基因治疗研究中的应用奠定了基础。     

人IL-12的克隆、表达及生物活性的鉴定

目的：克隆中国人ＩＬ－２ｐ４０基因,构建ＩＬ－１２的真核基因表达载体。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ从北京地区人脐血树突状细胞（ＤＣ）中克隆ＩＬ－１２ｐ４０ｃＤＮＡ基因,并进行序列分析。利用ｐｃＤＮＡ３．１和ｐＬＸＰＸＳＮ构建ＩＬ－１２表达载体,转染人肝癌细胞后对其进行生物学和免疫学分析。结果：北京地区人ＤＣ中ＩＬ－１２ｐ４０ｃＤＮＡ基因２１０位密码子有独特的结构,为ＧＣＣ（Ａｌａ）。并且２３９和２９１位     

靶向着丝粒蛋白A的小RNA干扰对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响

目的 研究靶向着丝粒蛋白A(CENP-A)的siRNA对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响.方法 设计并合成三对CENP-A编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体pSilencerTM 2.1-U6 neo,构建siRNA真核表达质粒,经稳定转染HepG2细胞后检测肝癌细胞中CENP-A基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况;通过观察HepG2细胞生长、凋亡、细胞周期和平板克隆形成能力评价CENP-A基因干扰对细胞生物学行为的影响;通过检测bcl-2、Bax、p21waf1、mdm2、p53蛋白表达水平初步探讨CENP-A生物学作用的可能机制.结果 三对靶向CENP-A的siRNA干扰片段中有二对抑制效果明显.与未转染组及空载体组相比,转染CENP-A干扰片段的细胞生长减慢,平板克隆形成率下降.细胞周期检测显示,G1期阻滞(P＜0.01),S期细胞比例减少(P＜0.001).细胞凋亡比例增加(P=0.003),并伴随bcl-2蛋白表达明显下降(P=0.000),Bax蛋白表达明显增高(P=0.001).还可致p21waf1表达增高,mdm2表达下降,但对野生型p53表达未显示明显影响.结论 CENP-A通过参与细胞周期调控而密切相关于细胞恶性增殖和凋亡抑制,其机制可能涉及野生型p53非依赖性通路和凋亡相关基因bcl-2Bax的表达异常.     

Differential expression of mRNA encoding interleukin-12 p35 and p40 subunits in situ

Interleukin-12 (IL-12) is a heterodimeric cytokine that plays an important role in the regulation of the immune response. For biological activity the expression of both subunits of IL-12, p35 and p40, is required. Moreover, in the mouse the p40 chain of IL-12 specifically inhibits the effects of the IL-12 heterodimer. In the present study we have analyzed by in situ hybridization the expression of the p35 and p40 mRNA in the spleens of BALB/c and mutant (SCID, nude, beige) mice, unstimulated and after in vivo stimulation with lipopolysaccharide (LPS) and with staphylococcal enterotoxin B (SEB). In unstimulated spleens of BALB/c mice, p35 and p40 mRNA were only detectable in a few strongly stained single cells, p35 mRNA was expressed in addition weakly in the B cell areas. After injection of LPS or SEB, p40 mRNA was strongly induced in the T cell areas all over the spleen, whereas expression of p35 mRNA and its distribution pattern did not change. Surprisingly, most of the mRNA for p35 and p40 was localized in different areas of the spleen and was apparently produced by different cells. In macrophage-depleted spleens the increased expression of p40 mRNA in response to LPS was reduced but still detectable, demonstrating that other cells besides macrophages can up-regulate IL-12 p40 mRNA. Nude mice showed a stronger expression of p35 mRNA, SCID mice lacked the weak p35 staining of the B cell areas but showed a strong basal expression of both p35 and p40 mRNA and a focal response to LPS. The pattern of IL-12 mRNA expression in beige mice was the same as in normal mice. These data demonstrate a spatial dissociation of expression of the two chains of IL-12 and are compatible with a regulatory role of the isolated IL-12 p40 chain in vivo. In addition, they indicate that the demonstration of mRNA for both chains of IL-12 in whole tissues or cell mixtures is not necessarily indicative of functional IL-12.     

Construction of Sirtl shRNA interfering vector and its effects on cell proliferation and apoptosis

This study was aimed to construct Sirt1 shRNA interfering vector and to analyze the effects of Sirtl on cell proliferation and apoptosis in HepG2, A549 and 293T cell lines. To design and synthisize Sirtl shRNA sequence then recombinate it to pGenesil-1.0 plasmid, the positive pGenesil-1.0-Sirtl vector clone was screened by effective detections and sequencing. The vectors were transfected into HepG2, A549, 293T cell lines, and Sirtl expression levels in these clones were detected by RT-PCR and Western-blot. These clone cell proliferation activities were detected by MTT, and these cells apoptosis incidences were detected by MTT experiment after treated with DOX. The results showed that Sirt1 shRNA interfering vectors were successfully screened. The levels of Sirtl expression in HepG2-sh, A549-sh and 293T-sh cells were significantly reduced compared with their control cells. It was indicated that the proliferation activities of these cells were impaired and anti-apoptosis capabilities of HepG2-sh, A549-sh and 293T-sh were also impaired notably. Sirt1 took an important role in maintaining cell proliferation and resisting cell apoptosis caused by DNA damage, and this result also provided theoretical information for the further research.