转基因动物在药理学研究中的应用

转基因动物(transgene animal)或称遗传修饰生物(genetic modified organism,GMO)是指用实验方法将外源基因导入染色体基因组内进行稳定整合,并能遗传给后代的一类动物。具体地说,转基因动物技术的实质是通过遗传工程的手段对动物的基因组的结构或组成进行人为的修饰或改造,并通过相应的动物育种技术使得这些经修饰改造后的基因组在整体动物发育各阶段以及世代间得以表现、传递。1974年Jaenisch等将猿猴空泡病毒(Simian vacnolatingvirus 40,SV40)的DNA注入小鼠的胚泡,发现40％子代鼠的器官中整合有外源基因,从而首次成功地培育了转基因动物。1982年,Palmiter等用显微注射法,将小鼠金属硫蛋白启动子和大鼠生长激素基因     

神经特异性过表达Omi转基因鼠的建立

目的建立神经特异性过表达Omi的小鼠模型。方法将神经元特异性烯醇化酶启动子(neu-ron-specific enolase,NSE)连接到Omi cDNA上游获得了pSPORT6.0-NSE-Omi重组质粒,并转染神经细胞验证过表达情况。利用EcoRV和PvuI双酶切获得4.3Kb的转基因片段,利用显微注射技术将基因片段注射到800枚受精卵中,其中挑选500枚移植至假孕鼠的输卵管中发育。获得的子代小鼠利用特异性引物PCR验证基因整合情况。结果显微注射后共获得子代小鼠114只,基因型鉴定有11只小鼠基因上有转基因整合基因,整合率为10%。结论通过重组质粒及显微注射技术可以获得神经特异性过表达Omi转基因鼠模型。     

携带xylE的转基因小鼠的制备

建立了一种新的转基因小鼠致突变检测模型.选用xylE基因作为诱变的靶基因,以pESnx穿梭质粒作为载体,通过显微注射法将线状pESnx导入ICR小鼠制备G₀小鼠. 将显微注射后存活的352/549枚受精卵分别移入24只受体雌鼠的输卵管中,共产生41只仔鼠,存活30只(G₀),经过整合检测,检测出转基因小鼠17只,阳性率为57％. 从中筛选出2只完整整合了pESnx的转基因小鼠作为首建鼠(founder mouse)进行繁育,目前已繁殖到第三代(G₃). 经过逐代整合检测,证明转入的基因可稳定地遗传. 上述结果表明已成功地制备了在基因组中整合了pESnx质粒携带xylE的转基因小鼠.     

c—Ha—ras转基因小鼠的构建与鉴定

采用PCR和定点突变的方法获得c-Ha-ras突变基因,将其克隆到pcDNA3载体上,得到含有c-Ha-ras61密码子突变和核苷酸2713突变的质粒pcDNA3-ras2。对重组质粒进行瞬时表达,Western Blot检测到强阳性条带。酶切重组质粒,回收含有CMV启动子-目的基因-下游调控序列的4.3kb片段,然后将其显微注射到ICR小鼠受精卵中,将注射后的受精卵移入假孕母鼠的输管进行母体孕育,小鼠出生3周后,PCR和South-ernBlot检测证实有4只小鼠基因组中整合了外源c-Ha-ras突变基因,上述结果表明已成功构建了4只c-ha-ras转基因小鼠。     

携带xylE的转基因小鼠的制备

建立了一种新的转基因小鼠致突变检测模型．选用ｘｙｌＥ基因作为诱变的靶基因,以ｐＥＳｎｘ穿梭质粒作为载体,通过显微注射法将线状ｐＥＳｎｘ导入ＩＣＲ小鼠制备Ｇ０小鼠．将显微注射后存活的３５２／５４９枚受精卵分别移入２４只受体雌鼠的输卵管中,共产生４１只仔鼠,存活３０只（Ｇ０）,经过整合检测,检测出转基因小鼠１７只,阳性率为５７％．从中筛选出２只完整整合了ｐＥＳｎｘ的转基因小鼠作为首建鼠（ｆｏｕｎｄｅｒｍｏｕｓｅ）进行繁育,目前已繁殖到第三代（Ｇ３）．经过逐代整合检测,证明转入的基因可稳定地遗传．上述结果表明已成功地制备了在基因组中整合了ｐＥＳｎｘ质粒携带ｘｙｌＥ的转基因小鼠．     

携带人α1,2-岩藻苷转移酶基因转基因小鼠的建立

目的：建立携带人α1，2-岩藻苷转移酶[alpha（1，2）-fucosyltransferase，HT]基因的转基因小鼠模型。方法：采用受精卯显微注射法，将人HT转基因构件导入昆明白小鼠受精卵的雄原核内，然后将注射后仍健康的受精卵植入假孕母管内，等其自然分娩。对G0代小鼠，应用聚合酶链反应（PCR）和Southern杂交检测人HT基因的整合情况、应用逆转录PCR（RT—PCR）检测人HT基因mRNA水平的表达，应用流式细胞计数（FCM）检测H抗原及α—Gal抗原在小鼠外周血单核细胞（PBMCs）表面的表达。结果：注射后卵的存活率和幼鼠出生率分别为84．9％（968／1140）和10．8％（105／968），外源基因的整合率为7．6％（8／105），基因整合阳性小鼠中有7只的心、肝、肾及骨骼肌组织均有人HT mRNA表达，并且PBMCs表面H抗原表达阳性，表达强度为人PBMCs的95％-150％，同时α—Gal抗原表达减少，为正常小鼠的5％-10％。转基因小鼠已经稳定传3代。结论：携带人α1，2-岩藻糖苷转移酶基因的转基因小鼠模型已制备成功。     

人类p93基因转基因小鼠模型的建立及功能初探

目的 探讨心肌特异性表达的新激酶基因p93对心脏发育的影响.方法 构建携带人心肌特异启动子的α-MHC-p93转基因质粒,以显微注射法获得p93转基因首建鼠.对转基因小鼠进行形态学观察及血清水平检测.结果 成功构建了携带有人p93基因的真核表达载体α-MHC-p93,获得首建鼠7只.经繁育共获得F1、F2代转基因鼠234只,筛选出转基因阳性鼠4只,其中F1代3只,F2代1只.小鼠心脏大体形态学检测未见房室间隔缺损现象.血清学检测结果显示:p93转基因阳性鼠血Ca2+水平明显高于正常对照组[ (28±1)mg/L比(26±1)mg/L,P＜0.05],差异有统计学意义(P＜0.05);血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平低于正常对照组[(624.7±268.1)U/L比(1229.8±532.4)U/L,P＜0.05];血清乳酸脱氢酶(LDH)水平及心脏质量指数(HMI)与正常对照组相比,差异无统计学意义.结论 成功建立了人p93基因的转基因小鼠模型.单一转入p93基因没有造成实验动物的房室间隔缺损及心肌肥大.     

知情转基因食品

转基因食品是人类在上个世纪末认识的，所谓转基因，就是利用转基因技术，将人们所需要的目的基因插入(植入)动物的受精卵或植物的细胞里。使之与物种本身的基因结合在一起。这时外源基因就随着细胞的分裂而增殖，在体内得到表达，并能稳定地遗传给后代。实际上就是把一     

注射HBsAg-SCT质粒的HBV转基因小鼠血清转氨酶的检测分析

目的研究注射HBsAg-SCT质粒的HBV转基因小鼠血清中转氨酶水平的变化。方法选取遗传背景相同的HBsAg阴性正常鼠30只作为正常对照组,HBV转基因鼠30只为实验1组,注射HBsAg-SCT质粒的HBV转基因小鼠30只为实验2组。采集各组小鼠在8周龄时的血液,用全自动的生化分析仪检测小鼠血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平。结果实验1组(HBV转基因小鼠未注射HBsAg-SCT质粒组)和实验2组(HBV转基因小鼠注射HBsAg-SCT质粒组)小鼠的血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶与正常对照组比较,均显著升高(P<0.01);实验1组小鼠的血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶与实验2组比较,无明显差异(P>0.05)。结论注射HBsAg-SCT质粒的HBV转基因小鼠血清转氨酶水平明显高于正常小鼠;但与未注射HBsAg-SCT质粒HBV转基因小鼠无明显差异。     

反义LeETR1转基因番茄的生殖发育毒性及外源基因转移试验

目的 评价反义LeETR1转基因番茄(ETR1)向动物肠道菌群和子代动物转移外源基因的能力及对小鼠生殖发育的影响.方法 SD大鼠和ICR小鼠连续饲喂ETR1、非转基因番茄(B1)和蒸馏水30 d后,分别进行大鼠盲肠菌群培养物的抗生素耐药性试验及小鼠生殖毒性试验,提取耐药阳性菌、亲代和子代小鼠的基因组进行外源基因特异性聚合酶链式反应法(PCR).结果 肠道菌的耐药性和小鼠生殖发育情况无明显改变,在耐药菌和两代小鼠体内均未发现由受试物引入的外源基因.结论 ETR1对小鼠无生殖毒性,其携带的外源基因不能向动物体细胞、肠道菌及子代动物转移.