TGF-β1和bFGF对骨髓基质干细胞增殖、分化的影响

目的探索体外培养条件下转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维生长因子(bFGF)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖与分化的影响。方法用DMEM冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬液,接种、体外培养、扩增并分别加入不同浓度TGF-β和bFGF,通过MTT法检测不同生长因子对MSCs增殖的影响,通过RT-PCR技术测定碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)的表达了解生长因子对MSCs分化的影响。结果低浓度TGF-β和bFGF促进MSCs增殖,而高浓度TGF-β和bFGF抑制MSCs增殖;TGF-β和bFGF促进MSCs的ALP、OCN和OPN表达。结论低浓度TGF-β和bFGF可以作为大鼠MSCs较理想的诱导因子,可促进其增殖和分化,为体外培养组织工程化骨提供较好的种子细胞。     

矮壮素对小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1骨骼发育相关基因及蛋白的影响及其机制

目的：探讨矮壮素（chlorocholine chloride,CCC）对小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞骨骼发育相关基因及蛋白表达情况的影响,评价矮壮素对骨骼发育的影响,并探究其可能的作用机制。方法：选取处于对数生长期的MC3T3-E1细胞接种于96孔板中,以8、40、200、1 000 μg/mL矮壮素进行染毒。MTT法检测矮壮素染毒后不同时间（24、48、72 h）MC3T3-E1细胞的相对存活率。实时荧光定量PCR法检测矮壮素染毒48 h后MC3T3-E1细胞中骨骼发育相关基因mRNA的表达情况,包括成骨相关基因碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、生长激素受体（GHR）;破骨相关基因核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。使用Western blot测定矮壮素染毒48 h后MC3T3-E1细胞中骨骼发育相关功能蛋白及MAPK信号通路蛋白的表达情况,包括碱性磷酸酶（ALP）、生长激素受体（GHR）、骨形成蛋白2（BMP2）、转录因子Runt相关蛋白2（Runx2）。结果：不同浓度矮壮素对MC3T3-E1细胞染毒不同时间均无明显细胞毒性;矮壮素染毒24 h,1 000 μg/mL矮壮素染毒组细胞中ALP、OCN、RANKL mRNA表达明显增高（P < 0.05）,且细胞中RANKL与OPG的mRNA表达量比值明显上升（P < 0.05）,GHR、IGF-1、OPG、M-CSF mRNA的表达无明显变化（P > 0.05）。1 000 μg/mL组MC3T3-E1细胞GHR和BMP2蛋白表达明显降低,磷酸化ERK蛋白表达量降低和磷酸化JNK蛋白表达量升高。结论：矮壮素对MC3T3-E1细胞无明显细胞毒性,但可能会抑制MC3T3-E1细胞向成熟成骨细胞的分化,且有可能促进破骨细胞分化;其作用机制可能与MAPK通路有关,磷酸化ERK降低和磷酸化JNK升高可能会抑制小鼠前成骨细胞骨骼发育相关蛋白的表达。     

不同浓度锶对MC3T3-E1细胞增殖、ALP活性及成骨分化的影响

目的观察不同浓度锶(Sr)对MC3T3-E1细胞增殖、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及成骨分化的影响规律。方法体外培养MC3T3-E1细胞,将浓度不同的Sr作用于成骨细胞系MC3T3-E1细胞,利用MTT法检测细胞增殖活性,PNPP法检测细胞ALP活性,RT-PCR法检测几种成骨标志分子m RNA的表达情况。结果 Sr离子浓度500μg/ml时,成骨细胞增殖明显降低,生长受到抑制;浓度在3.91~250.00μg/ml时,促进作用达到最高水平;之后随着浓度降低,促进作用逐渐减弱。在观察范围内,Sr对成骨细胞ALP活性的影响呈明显的浓度依赖性,Sr能显著的增加MC3T3-E1的ALP活性,浓度在3.91~125μg/ml范围时,成骨细胞ALP活性显著提高。RUNX2、ALP、Col1等m RNA的表达量随Sr的浓度在一定范围内逐渐升高,Sr浓度为31.25μg/ml左右时,其m RNA表达量达到峰值。结论 Sr促进成骨细胞的增殖和分化具有显著的剂量依赖关系,超过最优浓度范围其促进作用下降,在一定阈值后甚至会出现毒性抑制作用。     

多发性骨髓瘤患者间充质干细胞TAZ和Wnt/β-catenin基因表达及其骨潜能的研究

 目的　研究多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓间充质干细胞（MSC）成骨诱导后成骨转录共刺激因子（TAZ）和Wnt／β-catenin mRNA的表达,探讨多发性骨髓瘤骨病（MBD）潜在的治疗靶点。方法　体外分离培养10例初治MM患者及10名健康对照者骨髓MSC,体外诱导分化为成骨细胞,茜素红实验检测矿化物沉积、荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测骨桥蛋白（OPN）、骨钙素（OC）、碱性磷酸酶（ALP）、核心结合因子α1（Cbfα1）mRNA的表达,分析成骨细胞分化指标变化;荧光定量RT-PCR方法检测成骨细胞的TAZ、Wnt／β-catenin mRNA,分析两组间TAZ和Wnt／β-catenin mRNA表达差异。结果　骨髓MSC 体外成骨诱导后,茜素红染色阳性,呈现明显红色钙化结节;实验组MSC 诱导后与诱导前相比,成骨细胞分化指标OC、ALP、Cbfα1 mRNA表达增高[（2.0958±0.5665、2.6670±0.3847、0.8463±0.3473）比（1.3487±0.9291、1.1452±0.6054、0.4439±0.2945）]（t值分别为2.171、6.709、2.795;均P＜0.05）;对照组MSC 诱导后与诱导前相比,成骨细胞分化指标OPN、OC、ALP、 Cbfα1 mRNA表达增高[（2.1096±0.8267、2.8991±0.3531、4.3045±0.2844、1.3273±0.4075）比（1.2200±0.9091、0.8780±0.3927、1.9161±0.2684、0.6736±0.2513）]（t值分别为2.289、12.103、25.134、4.411;均P＜0.05）。MSC 体外诱导成骨细胞,实验组与对照组相比,成骨指标OPN、OC、ALP、Cbfα1 mRNA表达降低[（1.2710±0.5636、2.0958±0.5665、2.6670±0.3847、0.8463±0.3473）比（2.1096±0.8267、2.8991±0.3531、4.3045±0.2844、1.3273±0.4075）]（t值分别为-2.650、-3.805、-10.822、-2.841;均P＜0.05）。实验组骨髓MSC体外成骨诱导后TAZ、β-catenin mRNA（2.2315±1.0723、0.5801±0.2159）比对照组（4.4140±0.8325、0.9516±0.292）表达降低（t值分别为-5.085、-3.235;均P＜0.05）。结论　骨髓MSC 体外诱导细胞OPN、OC、ALP、Cbfα1 mRNA表达增高,成功诱导分化为成骨细胞;MM患者MSC 向成骨细胞分化潜能比健康人降低,TAZ和Wnt／β-catenin 基因可作为MBD的潜在治疗靶点。     

骨松康含药血清对成骨细胞生物学活性的影响

目的 观察骨松康对体外培养成骨细胞增殖和分化的影响。方法 分离培养乳鼠颅骨成骨细胞，加入中药骨松康吸收后血清，流式细胞仪和碱性磷酸酶活性检测、骨钙素免疫组化染色、矿化结节计数分析其对成骨细胞增殖和分化的影响。结果以含药血清培养的成骨细胞，S期细胞比例增多，说明细胞DNA的合成增加；碱性磷酸酶活性及骨钙素表达增强；形成矿化结节数及分泌胰岛素样生长因子1（IGF-1）的含量均明显高于对照血清组（P〈0．01）。结论 骨松康含药血清能直接促进体外培养的大鼠成骨细胞的增殖、分泌和矿化，提高了成骨细胞骨形成功能。     

TGF-β1 shRNA对人涎腺粘液表皮样癌Ms细胞增殖的影响

目的：用TGF—-β1shRNA稳定转染涎腺粘液表皮样癌Ms细胞，观察shRNA的基因沉默效应及其对细胞增殖的影响．方法：用Liperfetamine2000将TGF—β1shRNA转染Ms细胞．以G418（600mg／L）筛选21d，挑出单克隆获得稳定转染细胞系．RT—PCR法和免疫组化方法检测细胞中TGF—B1mRNA和蛋白的表达利用MTT、软琼脂克隆形成实验、流式细胞仪、透射电镜等检测转染前后Ms细胞的增殖和形态特点，以空载体转染和未转染细胞为对照：结果：获得稳定转染TGF—β1shRNA的细胞系：TGF—β1shRNA阻断了Ms细胞中TGF—β1mRNA和蛋白的表达，未转染组，转染空载体组和转染shRNA组．细胞倍增时间分别为393h，40．1h和45．3h，G1期细胞所占比例分别为54．2％，56．8％和61．7％，增殖指数P1分别为0．46，0．43和0，38；软琼脂克隆形成率分别为34．7％，33，3％和15．8％：超微结构观察见转染细胞细胞器扩张和肿胀，核浆比例变小，核仁减小，数目减少，核分裂像减少。结论：应用shRNA沉默TGF—β1基因可抑制Ms细胞的增殖。     

转化生长因子-β、碱性成纤维生长因子和血小板衍生生长因子在骨折愈合中的表达

目的观察转化生长因子-β（TGV-β）、碱性成纤维生长因子（bFGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）在骨折愈合中的表达和分布情况,进而探讨其作用机制。方法选用SD大鼠制作胫骨骨折愈合模型,伤后不同时期处死取材,分别进行组织学和TGF-β、bFGF和PDGF免疫组化染色观察。结果伤后3天开始形成原始骨痂。1周时肉芽组织中的间质细胞开始分化为软骨细胞,软骨形成后再进行软骨内化骨。4周时形成连接骨折端的桥接骨痂。伤后早期血肿中炎性细胞表达bFGF、PDGF。伤后1周骨膜增殖细胞、肉芽组织中的成纤维细胞、内皮细胞、骨端骨细胞以及原始骨痂成骨细胞表达TGF、bFGF和PDGF。伤后2周软骨细胞表达TGF-β、bFGF和PDGF。结论TGF、bFGF和PDGF有着各自的表达和分布特点,并共同调节骨原细胞的增殖和成骨细胞、软骨细胞的分化,最终完成骨折愈合。     

转染IL－18基因的大鼠胶质瘤细胞疫苗9L／IL－18对胶质瘤大鼠中TGF－β和Fgf2水平的影响

目的：观察转染 IL －18基因的大鼠胶质瘤细胞疫苗9L／IL －18对胶质瘤大鼠血清 TGF －β和肿瘤组织中 Fgf2水平的影响。方法：将 F344大鼠随机分为3组,分别接种9L／IL －18、9L／LXSN 和9L 细胞。ELISA 法检测大鼠血清中 TGF －β水平,RT －PCR 方法检测肿瘤组织中 Fgf2 mRNA 的表达。结果：接种9L／IL －18细胞大鼠的外周血中 TGF －β的水平低于其他两组,差异有统计学意义（P ＜0．05）,肿瘤组织中Fgf2 mRNA 的表达均低于其他两组（P ＜0．05）。结论：IL －18通过降低 TGF －β和Fgf2的水平,起到抗肿瘤的作用。     

成骨细胞与骨愈合

骨形成是一个生理调节过程,详细了解控制骨形成的分子通路并进行调控,不仅可促进骨折愈合并且可使骨愈合不良达到愈合。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞,负责骨基质的合成、分泌和矿化。成骨细胞是特殊的间充质细胞,其基因如核心结合因子（Cbfal）和Osterix（Osx）扮演非常重要的角色。近年来发现在成骨细胞分化和增殖上Wnt／β—catenin信号通路扮演重要角色。     

红景天苷对胃癌细胞NU-GC-3凋亡及TGFβ1蛋白表达的影响

[目的]研究红景天苷对胃癌细胞NU-GC-3增殖的影响。[方法]细胞计数法、MTT法、流式细胞术检测分析不同浓度红景天苷对胃癌细胞NU-GC-3增殖的抑制作用,相差显微镜下观察形态学改变。RT-PCR、WesternBlot法分别检测加药组(20μg/ml红景天苷)和不加药组TGFβ1mRNA以及蛋白的表达水平。[结果]加药组细胞S期、G2/M期细胞数、增殖指数PI显著低于对照组,而细胞凋亡百分比、G0/G1期细胞数则显著高于不加药组。加药组TGFβ1mRNA以及TGFβ1蛋白的表达水平均高于不加药组。[结论]红景天苷对胃癌细胞NU-GC-3具有抑制其增殖并诱导其凋亡的作用。红景天苷作用于NU-GC-3细胞后明显促进了TGFβ1mRNA以及TGFβ1蛋白的表达。     

β-榄香烯对肝癌细胞SK—hep-1的迁移和侵袭力的影响

目的：观察β-榄香烯对肝癌SK—hep-1细胞的侵袭、转移等生物学行为的影响,探讨其对MMP2基因的调节。方法：将SK—hep-1细胞分为3组：control组、β-榄香烯（80μg／m1）组、TGF-β1（transforming growth factorβ1,TGF—β1）（10μg／m1）组,RT—PCR检测各组细胞的MMP2（matrix metalloproteinase-2,MMP2）mRNA表达;通过划痕试验及transwell细胞侵袭试验进一步对β-榄香烯作用的肝癌细胞迁移和侵袭能力进行分析。结果：β-榄香烯作用肝癌细胞中MMP2mRNA表达低于control组和TGF—β1组（P〈0．05）。β-榄香烯组穿膜细胞数（50±10）少于control组（150±16）及TGF—β1组（300±13）,（P〈0．05）。β-榄香烯组细胞的迁移数（92±8）明显低于control组（180±14）及TGF—β组（300±20）,差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论：β-榄香烯能下调肝癌细胞SK—hep-1的MMP2mRNA表达,降低肝癌细胞的侵袭、迁移能力。     

抗ATPase F1α抗体MAb3D5AB1对荷A549肺腺癌小鼠的抑制作用

目的: 以乳腺癌细胞与成骨细胞共培养模拟乳腺癌骨转移微环境,观察在此微环境中降钙素基因相关肽( calcitonin generelated peptide,CGRP)对成骨细胞护骨素 （osteoprotegerin,OPG）及细胞核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factorkappa B ligand, RANKL;又称破骨细胞分化因子）表达的影响。方法：将转移性乳腺癌细胞MDAMB231或MDAMB435与成骨细胞MG63共培养,建立模拟乳腺癌骨转移微环境。行CGRP(1×108 mol/L)干预,应用RTPCR和Western Blotting技术检测干预后OPG和RANKL在mRNA和蛋白水平表达的变化。结果：MG63与MDAMB231或MDAMB435共培养环境中,RANKL mRNA及蛋白水平升高,而OPG mRNA和蛋白水平表达下降;CGRP处理后,共培养环境中RANKL mRNA及蛋白水平降低,OPG mRNA和蛋白水平升高 (均P<0.05)。结论：乳腺癌细胞能调节成骨细胞OPG/RANKL轴的表达,进而可能促进破骨细胞的活性,造成溶骨性破坏;CGRP 干预可逆转此调节作用,在乳腺癌骨转移的治疗中有潜在应用价值。     

胃癌组织中PTEN和TGF-β1的表达及其临床意义

[目的]探讨PTEN和TGF-β1在胃癌中的表达及意义。[方法]应用免疫组织化学方法检测62例胃癌中PTEN和TGF—β1的表达，分析其与胃癌生物学行为之间的关系。[结果]在62例胃癌组织中PTEN表达阳性率为46．8％，其在癌旁正常胃组织中表达阳性率为100％。PTEN表达与胃癌分化程度、分期、分型及淋巴结转移有关。TGF—β1表达阳性率为80．6％。TGF—β1表达与胃癌分化程度、分期、淋巴结转移及分型有关。随着胃癌恶性程度的增强，PTEN表达逐渐减弱，TGF—β表达有不同程度的增强。PTEN和TGF—β的表达呈负相关。[结论]PTEN的低表达和TGF—β的高表达可能与胃癌的恶性转化和增殖有关，可作为反映胃癌生物学行为的指标之一。     

Cu^2＋对MC3T3-E1细胞增殖分化影响及对OPG、MEPE表达的影响

目的观察Cu^2＋对小鼠成骨细胞（MC3T3-E1）增殖、分化以及OPG与MEPE表达。方法采用不同浓度1×10（-4～-6）mol/L Cu2＋作用于MC3T3-E1细胞,分别在24、48、72、96 h后采用MTT法检测Cu^2＋对细胞增殖的影响;ALP（碱性磷酸酶）试剂盒检测细胞培养液中ALP活性;RT-PCR方法检测1×10（-4～-6）mol/L Cu2＋作用下细胞中OPG和MEPE的mRNA表达水平,探讨MC3T3-E1细胞增殖分化的分子机制。结果作用48 h和96 h时,1×10-6mol/L Cu^2＋明显促进MC3T3-E1细胞增殖;作用24 h时,此浓度对细胞增殖无影响;作用72 h时,1×10-6mol/L Cu^2＋明显抑制细胞增殖;1×10-4mol/L、1×10-5mol/L的Cu2＋对MC3T3-E1细胞增殖无影响或抑制其增殖。ALP试剂盒检测1×10-6mol/LCu2＋在作用24 h时,对细胞分化无影响,其他时间均可促进细胞分化;1×10-4mol/L的Cu2＋抑制细胞分化,1×10-5mol/LCu2＋在作用96 h时,可显著促进MC3T3-E1细胞分化,其他时间对细胞分化无影响。琼脂糖凝胶电泳图片可见1×10（-4～-6）mol/LCu2＋作用于MC3T3-E1细胞48 h时,OPG和MEPEmRNA均有表达。实时荧光定量PCR结果表明,在Cu2＋浓度为1×10-6mol/L作用48 h时OPG与MEPEmRNA明显增加。结论作用48 h时,1×10-6mol/L Cu2＋可以促进MC3T3-E1细胞增殖和分化,其机制与OPG、MEPEmRNA相关。     

生长激素对胆管癌细胞体外增殖的影响

目的：探讨生长激素在体外对胆管癌QBC939细胞增殖的影响。方法：将胆管癌细胞随机分为实验组（GH组）和对照组（NS组），GH组按剂量和培养时间分为50μg／L2h（GH50—2h），50μg／L24h（GH50—24h）．100μg／L2h（GH100—2h），100μg／L24h（GH100—24h）4个亚组，NS组按培养时间也分为NS-2h、NS-24h两个亚组，2h和24h后吸取上清用ELISA法检测类胰岛素生长因子1（IGF1）并细胞计数；胆管癌细胞用不同浓度GH（50μg／L，100μg／L）培养24h后固定，以流式细胞仪测定细胞周期；同时在不同浓度GH（50μg／L，100μg／L）干预的培养液中行细胞爬片后固定，用原位杂交的方法检测类胰岛素生长因子1受体mRNA（IGF1RmRNA）。结果：培养液中加入GH2h后QBC939细胞无明显增多（P〉0．05），但24h后细胞数目明显增多并有统计学意义（P〈0．05），24h流式细胞仪检测显示S期细胞百分（S％）比和细胞增殖指数（PI）也明显增加（P〈0．05）。IGF1RmRNA在胆管癌中呈阳性表达，且GH可诱导细胞IGF1RmRNA表达增强。结论：GH在体外能促进胆管癌QBC939细胞的增殖和分化。     

转化生长因子β1及层粘连蛋白反义RNA对大肠癌细胞E-钙粘着蛋白表达的影响

目的：探讨转化生长因子β1（transforming growth factorβ1, TGFβ1）及层粘连蛋白（laminin, LN）反义RNA对大肠癌细胞E-钙粘着蛋白表达的影响.方法：采用免疫印迹技术检测大肠癌细胞E-钙粘着蛋白的表达水平,采用增强的化学发光技术显示结果.结果：TGFβ1可促进E-钙粘着蛋白表达;LN反义RNA既可抑制E-钙粘着蛋白表达,又能抑制TGFβ1对该蛋白的调节.结论：TGFβ1对肿瘤细胞恶性行为的影响可能与E-钙粘着蛋白表达增加有关.     

青蒿琥酯抗人食管癌作用与调控CDC25A、TGFβ有关

目的:观察青蒿琥酯(Art)对人食管癌Eca109细胞株及裸鼠移植瘤的抑瘤作用,探讨Art诱导肿瘤细胞周期阻滞与CDC25A、TGFβ表达的关系。方法:利用MTT法测定不同浓度Art对Eca109细胞及正常人外周血单个核细胞(hPBMC)增殖的影响;流式细胞术(FCM)测定肿瘤细胞的细胞周期变化;观察Art对裸鼠人食管癌移植瘤的抑制情况;RT-PCR方法检测CDC25A mRNA表达情况,Western blot方法检测CDC25A和TGFβ蛋白表达情况。结果:Art能显著抑制Eca109细胞的增殖,IC50为(68.80±0.76)μmol/L,而对hPBMC的增殖则没有明显抑制作用。低浓度Art可将细胞阻滞于G0/G1期,S期细胞显著减少,当浓度达到100μmol/L时,Art可将细胞阻滞于G2/M期。Art各用药组肿瘤的体积及质量均明显小于模型组,体积抑瘤率最高可达76.4%,质量抑瘤率可达63.2%。Art可显著抑制Eca109细胞CDC25A mRNA及蛋白表达,同时显著上调TGFβ的蛋白表达水平。结论:Art可抑制肿瘤细胞生长,其机制可能为通过上调TGFβ的表达来抑制CDC25A的表达,进而调控细胞周期。     

PMP22和TGF-β1在胃癌中的表达及意义

目的 探讨PMP22和TGF－β1在胃癌中的表达及意义。方法 应用免疫组织化学方法检测58例胃癌中TGF－β1和PMP22的表达。结果 在58例胃癌组织中PMP22表达阳性27例（46．6％），其在正常胃组织中亦有表达。PMP22表达与分化程度，分期，分型及淋巴结转移有关。46例TGF－β1表达阳性率为79．3％，TGF－β1表达与分化程度，分期及分型有关，而与淋巴结转移无关。随着胃癌恶性程度的增强PMP22表达逐渐减弱，TGF－β1表达有不同程度的增强。PMP22和TGF－β1的表达呈负相关。结论 PMP22的低表达和TGF－β1的高表达可能与胃癌的恶性转化和增殖有关，可作为反映胃癌生物学行为的指标之一。     

β-榄香烯乳联合照射对DNA—PKcs基因表达及凋亡的影响

目的探讨β-榄香烯乳影响肺腺癌A549细胞凋亡及DNA—PKcs基因表达的放射增敏机制。方法实验分为对照组、单纯照射组（4Gy照射）、单纯药物组（10μg/ml、20μg／mlβ-榄香烯乳）、药物＋照射组（10μg/ml、20μg/mlβ-榄香烯乳＋4Gy照射）。采用四氮唑蓝比色分析法（MTF法）检测β-榄香烯乳对肺腺癌A549细胞的半数抑制浓度（IC50）;克隆形成实验计算细胞存活率;采用流式细胞仪检测细胞周期与凋亡率;逆转录实时荧光定量PCR技术（RT—PCR）检测细胞DNA—PKcs基因mRNA表达量。结果MTF法测得β-榄香烯乳对A549细胞的IC50值为120μg/ml;克隆形成实验证明β-榄香烯乳对A549细胞有放射增敏作用;药物＋照射组细胞G2／M期比率及凋亡率明显高于单纯照射组及单纯用药组（P〈0．05）;药物＋照射组DNA—PKcs基因mRNA表达量与单纯照射及单纯用药组相比明显下降（P〈0．05）。结论β-榄香烯乳可通过促进A549细胞凋亡及抑制DNA—PKcs基因mRNA表达实现对A549细胞放射增敏作用。