PEI连接的基因探针在免疫—PCR中应用

通过聚乙烯亚胺(PEI),将抗体与DNA共价结合构建成特异性抗体-DNA和通用型SPA-DNA两种免疫-PCR基因探针,建立了免疫-PCR方法。检测相应的抗原或抗体,灵敏度比ELISA高约100万倍。两种基因探针对蛋白质的免疫活性和DNA模板的扩增活性均无显著影响,稳定性好,重复性高。     

免疫PCR——一种高灵敏的抗原检测方法

作者利用抗体—DNA特异性结合来检测抗原的原理,把抗原检测反应和PCR联合应用,建立了一种抗原检测系统,称之为免疫PCR。在免疫PCR反应中,一个中介分子同时具有与DNA、抗体分子特异结合的能力。其一端连接DNA(标记物),另一端连接抗原-抗体复合物,形成一个特殊的抗原-抗体-DNA连接物。作为标记物的     

免疫PCR:通过特异性抗体-DNA缀合物高敏感性检测抗原

多聚酶链反应(PCR)技术已成为一种分子生物学和基因工程的有力工具,将PCR技术应用于抗原检测,建立了一种称为免疫PCR的抗原检测系统,该系统采用一种特异性抗体-DNA缀合物来检测抗原.免疫PCR方法的原理是通过应用一个对DNA和抗体具有双重结合活性的连接分     

胃癌相关抗原MG7-Ag免疫PCR检测系统有关影响因素的分析

目的：应用免疫PCR技术检测胃癌相关抗原MG7－Ag时,对影响该系统的相关因素进行分析比较。方法 以ELISA法与免疫PCR同时检测胃癌抗原MGAg,以比较这两种方法检出抗原的敏感性和特异性。同时检测抗体浓度、反应时间、链亲和素的浓度,以及DNA拷贝数对免疫PCR系统的影响。结果 免疫PCR法检出抗原的敏感性远远高于ELISA法,显著提高了胃癌患者外周血中MGAg抗原的检出率。与ELISA法相比较,相应的抗体浓度、反应时间、链亲和素的浓度不会导致非特异性条带的出现。同时确定DNA的最适拷贝数为10^-3ng,即对系统非特异性常规ELISA法,特异性较好,可成为检测患者外周血中肿瘤抗原的有效手段。     

夹心免疫PCR方法检测蓖麻毒素

目的：建立了双抗夹心免疫PCR的检测技术，检测极微量的抗原，方法：以亲和素作为连接分子连接生物素化抗体和生物素化DNA，应用于免疫PCR中，检测极微量的抗原。结果：建立了双抗夹心免疫PCR的检测技术，检测蓖麻毒素的灵敏度达0．1pg/ml，与夹心ELISA方法比较灵敏度高10^3倍。结论：建立的免疫PCR系统灵敏度高，可用于各种微量抗原的检测。     

免疫PCR:通过特异性抗体-DNA缀合物高敏感性检测抗原

免疫PCR方法的原理是通过应用一个对DNA和抗体具有双重结合活性的连接分子,使作为标志物的DNA分子特异性地结合到抗原-抗体复合物上,形成一种特异性抗原-抗体-DNA缀合物,附着的DNA标志物可用适宜的引物进行PCR扩增,特异性PCR产物的存在证明DNA标志物分子特异性地附着于抗原-抗体复合物上,进而证明有抗原存在。在此方法中,链霉亲和素-蛋白A(SPA)嵌合蛋白被用作连接分子,链霉亲和素-SPA具有两种不同的特异结合能力,即链霉亲和素对生物素的结合力和SPA对坛IgG Fc段的结合力。这种对生物素和抗     

鸡源性高迁移率族蛋白B1多克隆抗体的制备及应用

目的制备针对鸡的高迁移率族蛋白B1(chHMGB1)特异性抗原亲和层析多克隆抗体,并进行初步应用。方法反转录PCR扩增chHMGB1的全长编码基因,通过序列比对分析筛选一段特异性的多肽序列,偶联载体后作为抗原免疫新西兰兔,采集血清,通过蛋白A柱及多肽偶联的Seprose4B柱得到亲和层析纯化的多克隆抗体;并利用Western blot法、间接免疫荧光染色、免疫组化方法进行鉴定。结果成功制备了抗chHMGB1特异性的多克隆抗体。各项实验结果表明该抗体能特异性的识别重组蛋白以及天然的chHMGB1蛋白。结论成功制备了鸡源性高迁移率族蛋白B1亲和层析多克隆抗体。     

HCV多表位抗原融合肽的表达与抗原性的研究

目的观察HCV复合多表位抗原融合肽的抗原性,探讨利用这种抗原融合肽制备的抗体在丙型肝炎抗原检测方面的潜在可行性。方法将人工合成的HCV复合多表位抗原基因B2克隆到表达载体pThioHis A中,并在大肠杆菌中表达融合蛋白(Trx-B2),纯化该蛋白后免疫小鼠及家兔,分析表达产物的免疫特异性及抗原性。结果融合蛋白(Trx-B2)能在原核表达系统中高效表达,并可诱发小鼠及家兔产生高滴度的特异性HCV抗体。结论偶联了融合蛋白的HCV复合多表位抗原具有良好的抗原性,其免疫实验动物后产生的抗体有望用于HCV的抗原检测。     

基于量子点及免疫磁珠技术快速检测弓形虫抗体的实验研究

目的 应用量子点及免疫磁珠技术,建立一种简便、快速的弓形虫IgG抗体检测方法.方法 采用碳二亚胺交联法,将弓形虫抗原包被住磁性微球表面作为固相载体,量子点标记二抗作为检测抗体.检测待检血清中的弓形虫特异性抗体,并对检测条件进行优化.结果 量子点与二抗的最佳偶联条件:pH6.0、反应时间为2 h、二抗浓度为20 μg/mL.确立检测的最佳反应条件:抗原包被浓度50μg/mL,量子点标记二抗工作浓度为1:200.用本方法检测弓形虫抗体阳件血清的最大稀释度为1:1 000,而EHSA为1:500.结论 成功建立了弓形虫IgG抗体快速检测方法,该方法具有较好的特异性和灵敏度,且操作简便快速.     

胸腺素α1抗体的制备和鉴定

目的：制备用于检测转胸腺素基因蓝藻表达产物的特异性抗体。方法：用提纯的小肽（２８个氨基酸）胸腺素α１与牛血清白蛋白偶联后作为抗原,采用皮下多点注射免疫的方法免疫大鼠。经过３个月的免疫,获得抗Ｔα的多克隆抗体。结果：用间接酶联免疫吸附（ＥＬＩＳＡ）方法,测得抗体效价超过４０９６。蛋白印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）检测结果显示,该抗体能特异性地与胸腺素α１抗原产生明显免疫亲和反应。结论：所制备的抗体具有很好的灵敏性和特异性。     

粪便具核梭杆菌的免疫磁珠捕获联合实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价

目的建立定量检测粪便中具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F. nucleatum)的免疫磁珠捕获联合实时荧光定量PCR(IMBs-qPCR)技术方法。方法 5×10~8CFU F. nucleatum(0.4%甲醛灭活)免疫新西兰兔制备多克隆抗体,饱和硫酸铵沉淀法和Hi Trap Protein G HP亲和层析法纯化抗体;优化MS 300免疫磁珠偶联多克隆抗体和捕获F. nucleatum的反应条件。根据F. nucleatum特异性基因NusG设计引物和构建含目的基因的载体质粒,建立qPCR反应体系并绘制qPCR标准曲线。最后,在不同浓度(50 CFU/200 mg～10~5CFU/200 mg)F. nucleatum的人粪便标本中,评价该方法的检测效能。结果成功制备F. nucleatum多克隆抗体,抗体ELISA效价320 000,盐析和亲和层析纯化抗体纯度分别为60%和85%;多克隆抗体偶联免疫磁珠时偶联缓冲液最佳pH值为5.0,最佳温度为25℃,最佳偶联时间为2.5 h,加入抗体最适量为10μg/mg,免疫磁珠最佳捕获温度为37℃,时间为40 min;成功建立qPCR反应体系;IMBs-qPCR和粪便全基因组DNA提取法直接检测模拟粪便标本最低检测限分别为100 CFU/200 mg和400 CFU/200 mg,ROC曲线中AUC分别为0.948和0.878。结论成功建立了IMBs-qPCR检测粪便中F.nucleatum的方法,该方法具有简便快速、灵敏度高、特异性好等特点。     

循环免疫复合物检测的影响因素——特异性与敏感性

如所周知,循环免疫复合物(CIC)的检测方法一般可分为抗原特异性法和抗原非特异性法两大类。前者适用于检测一种已知抗原及其相应抗体组成的CIO,如DNA-抗DNA、HBsAg-抗HBs、甲状腺球蛋白     

人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答

探索人β防御素2 (h BD- 2 )和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗针对前列腺癌的免疫治疗。研究以pc DNA3.1为载体,构建重组质粒pc DNA3.1/PSMA和pc DNA3.1/h BD- 2 - PSMA,通过RT- PCR和免疫组化检测其表达。免疫小鼠后,进行血清中抗体检测,CD4 、CD8 T淋巴细胞数目测定及CTL 特异性杀伤作用检测。结果显示构建的质粒转染COS- 7细胞后能表达目的基因,免疫小鼠后能在体内持久表达,可以诱导产生特异性抗体,能有效的刺激T细胞增生,诱导特异性CTL 反应。当以h BD- 2作为免疫佐剂时,CTL 活性更强。本研究成功的构建了含PSMA的表达质粒,免疫小鼠可以诱导出有效的体液和细胞免疫,为前列腺癌的免疫治疗奠定了一定的实验基础     

多菌灵人工抗原的合成及其鼠源性多克隆抗体的制备

目的 合成多菌灵人工抗原,制备多菌灵多克隆抗体并鉴定其特性。方法 利用混合酸酐法引入羧基制备多菌灵半抗原。将小分子半抗原与大分子载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成多菌灵人工抗原和包被抗原,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对人工抗原进行鉴定。用制备的人工抗原免疫小鼠获得抗多菌灵多克隆抗体,利用间接ELISA对抗体效价以及特异性进行测定。结果 成功制备多菌灵人工抗原。免疫小鼠后获得的抗体效价可达1∶12 800。抗体对多菌灵的半数抑制剂量(IC₅₀)为0.107μg/mL,且与苯菌灵、噻菌灵的交叉反应率均<1%。结论 成功获得高敏感性、高特异性的多克隆抗体,为多菌灵残留快速检测方法的建立奠定了基础。     

HIV-1 gp41重组抗原的表达及其免疫反应性检测

为了在大肠杆菌中表达具有良好免疫反应性的HIV-1gp41重组抗原,本实验运用基因工程技术,经PCR扩增gp41的主要抗原表位序列,BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后与E3质粒连接,转化克隆宿主菌DH5α,再提取重组质粒进一步转化表达宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白,纯化后标记HRP,通过双抗原夹心酶联免疫方法检测其免疫反应性和特异性。结果表明,获得的HIV-1gp41重组抗原能够与相应抗体特异性结合,与多种无关抗体间无交叉反应,对825份HIV阴性标本检测无错检。检测结果说明该重组抗原具有良好的免疫反应性,在HIV-1抗体诊断试剂中具有潜在的应用价值,为进一步研究gp41抗原奠定了基础。     

双磷酸改性血管支架作为基因载体的研究

目的 将基因通过化学偶联和特异性免疫结合在双磷酸氨基酯改性的316L不锈钢冠状动脉支架上,评价支架改性和负载质粒DNA的效果.方法 金属支架首先利用双磷酸氨基酯改性引入氨基活性基团,化学偶联抗DNA抗体,然后免疫偶联质粒DNA,得到血管支架上负载抗体和基因的模型.结果 利用X射线光电子能谱(XPS)和原子力显微镜(AFM)等分析确定了支架表面磷酸氨基的存在,同位素标记验证了改性后支架表面结合的抗体具有很好的稳定性和结合容量.结论 双磷酸氨基改性的血管支架表层富含可反应氨基,可以作为新型反应界面,与生物活性分子进行偶联反应.     

果蝇再生蛋白(rgn)多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备具有高度特异性的抗果蝇再生蛋白(rgn)的多克隆抗体。方法利用PCR技术从果蝇W1118c DNA中获得rgn基因片段,构建重组质粒;将其转入JM109(DE3)菌株中诱导rgn融合蛋白表达,再利用Ni-NTA superflow层析柱法将其纯化;经Western blot法检测后,利用制备的抗原免疫SD大鼠,从血清中获得高纯度的抗rgn多克隆抗体,利用Western blot法和免疫组织化学染色法对抗体特异性进行鉴定。结果构建的pRSETA-rgn表达载体成功表达6×His-rgn蛋白,融合蛋白在大肠杆菌中大量表达并纯化后,作为抗原免疫SD大鼠,获得了抗rgn的多克隆抗体;免疫组织化学染色技术证实rgn定位在果蝇三龄幼虫血细胞的细胞质。结论成功获得了特异性较高的大鼠抗rgn多克隆抗体。     

用ELISA检测流行性出血热特异性免疫复合物的初步研究

为检测流行性出血热特异性循环免疫复合物,建立了抗原特异性双抗体夹心ELISA技术。以兔抗EHF IgG包被反应板,使待检标本内循环免疫复合物通过暴露的EHF病毒抗原位点而被结合到固相上,再以辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG进行示踪,从而检出EHF’特异性循环免疫复合物。在228份EHF患者血清中,用胶因素ELISA检出非特异性循环免疫复合物183份,抗原特异性ELISA检出特异性循环免疫复合物188份。本方法特异性强,重复性及稳定性较好,可应用于临床检测。     

免疫-PCR:一种新的抗原检测系统

免疫-PCR是1992年建立的抗原检测系统。其基本过程和ELISA相似,免疫-PCR用一段可扩增的DNA分子代替ELISA中的酶来放大检出信号,因而大大提高了灵敏度。尽管此法尚处于探索阶段,但应用前景是诱人的。     

重组汉坦病毒核衣壳蛋白抗原用于胶体金标记免疫层析法检测肾综合征出血热抗体

目的制备高表达量、高活性的HV NP重组抗原,以此为基础建立一个可同时检测HFRs患者血清中IgM和lgG抗体的快速胶体金标记诊断试剂盒。方法从TA-A537中扩增出截短的HV S基因片段P6-119,定向克隆至原核表达载体pET-30a中进行原核表达,采用亲和层析法纯化重组蛋白。以胶体金标记重组抗原,应用金标快速免疫层析法同时检测HFRS患者血清中IgM和IgG抗体。结果金标快速免疫层析法可同时检测HFRS患者血清中IgM和IgG抗体,与IFA比较,IgG抗体检测的敏感性和特异性分别为94.9%、100%。与ELISA比较,IgM抗体检测的敏感性和特异性均为100%。结论截短的重组汉坦病毒NP蛋白表达量高且具有良好的抗原性。以此为基础建立的金标快速免疫层析法显示出很高的敏感性和特异性,且具有简便、快速等优点,非常适用于各种层次尤其是缺乏实验条件和专业人员的基层医疗单位对HFRS疑似患者作出早期诊断。