大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖与多向分化的能力

背景：生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能。 目的：进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能。 方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定。取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定。 结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性。第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性。表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化。     

建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞作为种子细胞在组织工程等领域应用广泛,建立稳定的分离培养体系和统一鉴定标准尤为重要。 目的：以不同方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2005-08/12在暨南大学完成。 材料：SPF级3月龄SD雌性大鼠5只,由中山大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,培养14 d。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的生长状态,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,采用碱性磷酸酶染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力,以甲苯胺蓝染色鉴定成软骨能力。 结果：与密度梯度离心法相比,全骨髓贴壁法分离获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化。第3代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,不表达造血前体细胞标志抗原CD34和白细胞标志抗原CD45,表达整合素家族成员CD29和黏附分子CD44,经诱导后碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性。 结论：采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓间充质干细胞,效果优于密度梯度离心法。经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为大鼠骨髓间充质干细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。 目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。 方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。 结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性。扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化

背景：骨髓中的间充质干细胞含量极少,每1×104~1×105个单核细胞中约有1个骨髓间充质干细胞,需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求。 目的：观察体外分离培养的骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成。 材料：清洁级雄性近交系SD大鼠30只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞融合至80%~90%胰蛋白酶消化传代。取传至第3代细胞,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标记,茜素红染色检测其成骨能力,油红O染色检测其成脂能力。 结果：原代及传代的骨髓间充质干细胞均呈长梭形成纤维细胞样,连续传代10代以上,细胞始终保持旺盛的生长及扩增能力。第3代骨髓间充质干细胞CD90,CD44,CD106均呈阳性表达,而CD34,CD45,CD11b呈阴性。成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成。成脂诱导2周后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。 结论：全骨髓贴壁培养法可大量分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及多向诱导分化

髓间充质干细胞的分离获取及培养鉴定一直以来仍无统一标准和定论。 目的：体外获取兔骨髓间充质干细胞、纯化、扩增,同时研究其生物学特性及多向分化潜能。 方法：采用贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线;倒置相差显微镜、苏木精-伊红染色及碱性磷酸酶染色观察细胞形态;并向成骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞多向诱导分化,分别采用钙结节茜素红染色、甲苯胺蓝染色和荆豆凝集素染色鉴定。 结果与结论：经贴壁筛选法得到的骨髓间充质干细胞性状稳定,为纺锤状,呈克隆样生长,碱性磷酸酶染色弱阳性;经成骨、成软骨、成血管内皮细胞诱导培养的骨髓间充质干细胞,表现出相应细胞的形态特征和生物学特征。提示,全骨髓培养法取材方便,骨髓间充质干细胞增殖能力强,在适宜条件下能够多向分化。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性*

背景：培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提。 目的：寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。 方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记。 结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统。第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性。提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验。     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞：与密度梯度离心法的比较*☆

背景：目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法：密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想。 目的：在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法。 方法：全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度。 结果与结论：全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高。     

BrdU体外示踪大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景：目前还未找到一个理想的标记性分子用来鉴定骨髓间充质干细胞,因此也就不能保证骨髓间充质干细胞的同质性。 目的：以BrdU体外示踪标记验证大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后的分化潜能。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-01/10在山西医科大学完成。 材料：4周龄Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供。 方法：密度梯度离心+贴壁培养法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,达80%融合时胰蛋白酶消化传代扩增。取5×1010 L-1个骨髓间充质干细胞接种于25 mm培养皿,加入含地塞米松、β-磷酸甘油、维生素C和体积分数为10%胎牛血清的L-DMDM培养基进行成骨诱导。取第3代骨髓间充质干细胞,加入终浓度为10 μmol/L BrdU进行体外示踪,200倍荧光显微镜下随机选取10个视野,通过计数阳性细胞与非阳性细胞数得到BrdU标记率。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面抗原,观察诱导后成骨分化潜能,体外BrdU标记率。 结果：分离纯化的骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主,传至第3代呈明显的同向性改变,漩涡状盘旋排列,细胞存活率均大于95%,至第7代仍未见细胞生长减缓现象;CD44,CD71,CD105均呈阳性表达,CD45呈阴性表达;成骨诱导后Von kossa染色可见骨髓间充质干细胞中有黑色颗粒沉积;BrdU标记率>90%。 结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,可在体外长期培养,并具有成骨分化潜能;BrdU可成功标记骨髓间充质干细胞,是安全、有效、便捷的体外示踪方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞的分离培养及鉴定

背景：骨髓间充质干细胞的分离和培养扩增至今缺乏统一的方法。内皮祖细胞可以由外周血或骨髓中的单个核细胞诱导分化而成,但因获取骨髓单个核细胞的方法各异,分离效果亦有较大差异。 目的：拟在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞,并对其进行鉴定。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-10/2009-02在安徽医科大学第一附属医院中心实验室完成。 材料：清洁级健康雄性SD大鼠2只,由安徽省动物中心提供。 方法：抽取大鼠骨髓,通过密度梯度离心法提取单个核细胞,采用差速贴壁法分离骨髓间充质干细胞。原代骨髓间充质干细胞培养48 h后,收集未贴壁细胞,加入含胎牛血清、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、重组人上皮生长因子的EGM-2完全培养液诱导骨髓间充质干细胞向内皮祖细胞分化。设立3组：分别为早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞、2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞、大鼠成熟主动脉内皮细胞,采用硝酸还原酶法间接测量细胞培养液中一氧化氮的含量。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与内皮祖细胞体外培养情况,细胞培养液中一氧化氮的含量。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,24 h内大部分细胞贴壁,9~10 d可达90%融合,纯化扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭性,传代周期为8 d左右,流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞CD34,CD45呈阴性,CD105呈阳性。2次贴壁的内皮祖细胞培养3 d内贴壁,6 d形成集落,8~10 d出现条索状结构,呈微血管样生长,2周时大部分细胞呈多角形,细胞集落相互连接,呈典型的“铺路石”样,7~10 d细胞DiI-acLDL、FITC-UEA-1双染呈阳性,流式细胞仪检测Flk-1,CD133阳性。2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞培养液中一氧化氮含量明显高于早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞(P < 0.05),但低于大鼠成熟主动脉内皮细胞(P < 0.05)。 结论：差速贴壁法能有效地分离、纯化、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,加入多种细胞生长因子诱导后具有较强地向内皮细胞方向分化的能力,且2次贴壁细胞已具有部分内皮细胞的功能。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞***

背景：目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少。 目的：观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响。 方法：采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化。 结果与结论：诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P < 0.01),诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性。结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。