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相似文献
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1.
目的:探讨真核表达载体介导外源性胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染肌腱细胞的可能性。方法:组织块法培养原代肌腱细胞,体外重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1,并以脂多胺DOGS为介导转染培养的肌腱细胞,反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测IGF-1mRNA的表达,ELISA法检测IGF-1活性蛋白表达。结果:成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1;RT-PCR检测显示转染后的肌腱细胞成功表达IGF-1mRNA;ELISA结果显示转染组IGF-1蛋白表达较对照组明显增高(t=-2.873,P&;lt;0.05)。结论:重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1能够将IGF-1cDNA成功导入肌腱细胞并表达。  相似文献   

2.
目的构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-血管内皮生长因子(VEGF)165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的表达,对目的蛋白进行鉴定和生物学活性分析。方法分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至哺乳动物细胞NIH 3T3并进行抗生素压力筛选,采用双抗夹心ELISA、SDS-PAGE和免疫印迹方法对目的蛋白在转染细胞中的特异表达进行鉴定,在血管内皮细胞ECV304上对表达产物的细胞结合活性和促增殖活性进行分析。结果构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165成功转染NIH3T3,获得加压筛选的重组细胞,目的基因得到稳定表达,目的蛋白能与血管内皮细胞ECV304特异结合,并具有促内皮细胞增殖活性。结论应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH 3T3细胞可稳定表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白。  相似文献   

3.
背景:大量文献表明,向肝脏细胞引入一个多个胰岛发育的关键因子(如Pdx1、MafA及Ngn3)可以使肝细胞向胰岛细胞的方向进行转化。目的:构建以pcDNA3.1(+)为骨架的质粒载体并共同转染胰十二指肠同源框蛋白(Pdx1)、神经源素3(Ngn3)及V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(MafA)至小鼠胎肝细胞并检测其表达情况。方法:以基因组或小鼠胰腺cDNA为模板扩增Pdx1、MafA及Ngn3三个目的基因,应用分子生物学技术,将3个目的片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点中,构建小鼠系列真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafAORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3ORF通过Lipofectamine2000介导的脂质体转染小鼠胎肝细胞系BNLCL.2,用反转录PCR以及间接免疫荧光法检测3个目的基因的表达情况。结果与结论:目的基因克隆正确,反转录PCR,间接免疫荧光法证实了脂质体转染后小鼠胎肝细胞中有Pdx1、Ngn3以及MafA的表达。结果表明,真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafAORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3ORF可成功构建,并能够将Pdx1、Ngn3以及MafA三个基因转至小鼠胎肝细胞进行表达。  相似文献   

4.
[目的]在CHO-K1细胞中表达重组MBL并进行检测。[方法]构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-mbl,用阳离子转染试剂Transfast转染CHO-K1细胞,G418筛选稳定转染的细胞。应用RT-PCR、ELISA及免疫荧光检测重组MBL的表达。[结果]RT-PCR从稳定转染pcDNA3.1(+)-mbl的CHO-K1细胞中检测到mbl基因的表达,夹心ELISA并未从转染细胞上清中检测到重组MBL,免疫荧光表明稳定转染pcDNA3.1(+)-mbl的CHO-K1细胞能够在胞浆中表达重组人MBL。[结论]成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-mbl并转染CHO-K1细胞,转染的细胞能够表达重组人MBL。  相似文献   

5.
黄娜  张宇  王鑫  李春明 《实用医学杂志》2007,23(19):2979-2982
目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs)后的表达情况,并进一步研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法:提取国人脑胶质瘤细胞BT325总RNA,RT-PCR法扩增bFGF cDNA片段,构建重组载体pcDNA3.1-bFGF,重组载体经脂质体介导转染犬BMSCs,半定量RT-PCR及Western blot检测表达。结果:重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。bFGF在犬BMSCs中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-bFGF,此重组载体在犬BMSCs中能够表达。  相似文献   

6.
目的构建人上皮细胞黏附分子(EpCAM)全基因的真核表达质粒,研究其在HepG2细胞中的表达。方法将EpCAM基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-EpCAM,转染人肝癌HepG2细胞。通过免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测对转染后细胞内EpCAM蛋白的表达进行鉴定。结果双酶切鉴定结果表明重组质粒构建成功。免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测结果一致表明,转染后EpCAM基因在HepG2细胞中表达成功。结论成功构建了人EpCAM的真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,为研究高表达人EpCAM的肝癌细胞的功能打下基础。  相似文献   

7.
目的 克隆人肺表面活性物质相关蛋白C(SP-C)基因,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/SP-C,并检测其在体外的表达,为SP-C的批量生产提供可靠的方法.方法 提取肺癌手术患者病灶周围正常肺组织总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术获得SP-C cDNA序列.用NotI和XhoI内切酶双酶切SP-C cDNA序列和质粒pcDNA3.1(+),胶回收后体外连接.酶切和测序后,用脂质体包裹转染人乳腺癌细胞株MCF-7,采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测SP-C的表达.结果 能够正确克隆人SP-C基因并插入至质粒pcDNA3.1(+)中;重组质粒体外转染MCF-7细胞后可以表达SP-C蛋白.结论 采用体外重组技术,成功构建了人SP-C真核表达载体 pcDNA3.1(+)/SP-C,并能在体外表达SP-C,为下一步构建人SP-C乳腺特异表达载体,利用乳腺生物反应器大量生产SP-C奠定了基础.  相似文献   

8.
目的 克隆S100A4 cDNA,构建pcDNA3.1-S100A4重组表达载体,转染胃癌细胞系MKN1,观察S100A4在胃癌细胞中的表达情况。方法 Trizol法提取人胃上皮细胞GES-1的总RNA,逆转录反应获得含S100A4基因的cDNA。聚合酶链反应GenBank获得S100A4基因序列,并设计引物,利用聚合酶链反应(PCR)扩增出分子量为327 bp的产物。构建pMD18-T simple-S100A4重组质粒,转化JM109菌。菌液测序成功后,提取质粒,进行BamHⅠ/HindⅢ双酶切,酶切产物回收纯化,连接表达载体pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-S100A4真核表达载体。利用脂质体介导转染方法将纯化的表达载体转染到胃癌细胞系MKN1中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后MKN1细胞中S100A4 mRNA表达水平。结果 PCR产物连接克隆载体的测序结果与GenBank公布的无突变序列一致,HindⅢ/BamHⅠ双酶切可以成功构建真核表达载体pcDNA3.1-S100A4;在胃癌细胞系MKN1中转染pcDNA3.1-S100A4表达载体,以转染pcD...  相似文献   

9.
目的:克隆大鼠背根神经节膜联蛋白A2(annexin Ⅱ)的基因,构建真核表达载体并检测其表达。方法:以RT-PCR法扩增大鼠背根神经节(DRG)细胞中膜联蛋白A2(annexin Ⅱ)的基因,构建pGMT-Anxa2克隆载体,以此为模板插入flag标签扩增Anxa2-flag序列,将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+),获得表达载体pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag。以PCR、双酶切及序列测定法鉴定该质粒。以脂质体法将表达载体转染到HEK293细胞中,Western印迹和细胞免疫荧光检测annexin Ⅱ蛋白表达及细胞内定位。结果:PCR扩增Anxa2-flag片段大小与预期相同。通过PCR、HindⅢ和NotⅠ双酶切及测序鉴定,证明构建出了含大鼠annexin Ⅱ基因的真核表达载体。Western印迹和细胞免疫荧光的检测表明大鼠annexin Ⅱ基因稳定表达,并可在胞膜和胞质中广泛表达。结论:成功构建pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag真核表达载体,并稳定表达蛋白,为研究annexin Ⅱ调控DRG伤害性感受传导的分子机制奠定基础。  相似文献   

10.
背景:最近有数据表明,Notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受.推测Notch/Notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用.目的:构建大鼠Deltal基因(Notch配体)真核表达载体,并观察其在树突状细胞中的表达.方法:应用RT-PCR方法从大鼠骨髓细胞中获得全长Delta1基因片段,并将此基因片段构建在pcDNA3.1(+)真核表达载体上.利用脂质体基因转染技术将含大鼠Delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1转染入树突状细胞中,观察Delta1基因在树突状细胞中的表达.结果与结论:双酶切鉴定结果显示,Delta1已成功构建在pcDNA3.1的Hindlll和Xbal双酶切位点之间,任选一个酶切阳性克隆pcDNA3.1/Deltal送上海生工生物公司进行序列测定,测序结果与Genebank中Delta1基因序列完全一致,阅读框正确.转染Delta1基因的树突状细胞形态与其亲本细胞类似,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Deltal的表达显著增高.实验成功利用基因转染方法将Delta1基因导入树突状细胞,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1,并使之高效表达并分泌Delta1蛋白.  相似文献   

11.
目的:了解鸡趾屈肌腱鞘内损伤修复后碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达及其与肌腱愈合的关系。方法:将36只来亨鸡的右足第3趾趾屈长肌腱切断后缝合并重新覆以腱鞘,于术后不同时间点切取标本(每个时间点6只),另取6只未行手术处理鸡的肌腱标本作为对照。将标本行组织学检查,并用RT—PCR和免疫组化方法测定肌腱bFGF的表达。结果:肌腱修复后断端先出现炎细胞浸润。接着成纤维细胞聚集并分泌胶原,最后胶原纤维重新塑形。这些细胞活动在腱实质比腱鞘、腱外膜出现迟且弱。bFGF在对照组肌腱仅出现低水平表达.而在实验组肌腱各个时间点均明显上调;腱鞘、腱外膜的表达明显高于腱实质。结论:bFGF参与了鸡趾屈肌腱损伤修复的愈合过程。  相似文献   

12.
目的:总结评价构建组织工程化肌腱生物支架材料的性能及作用,以寻找合理的肌腱替代物.方法:以"组织工程;肌腱修复;生物材料支架;运动性肌腱损伤"为中文关键词,"tissue engineering,tendon repairing,biological material scaffold,sport injury of terndon"为英文关键词,采用计算机检索1994-01/2009-12相关文章.纳入与有关运动性肌腱损伤与组织工程肌腱相关的文章;排除重复研究或Meta分析类文章.以16篇文献为主,重点对一下5个问题进行了讨论:①肌腱的组织学特征?②肌腱移植材料种类及组织工程肌腱种子细胞的来源?③如何解决同种异体肌腱细胞的免疫学反应?④如何制备与筛选特殊力学强度的支架材料?⑤伦理学问题.结果:与传统肌腱修复比较,组织工程化肌腱具有许多优点:解决了供体肌腱来源问题;组织工程化肌腱具有活力和功能,植入后可与受体肌腱愈合,永久性替换缺损肌腱;可根据缺损肌腱任意塑型,在重建功能的同时达到形态修复的目的.但是构建组织工程化肌腱,还有许多问题有待研究和解决.如何提高支架材料应用性,研制具有与正常人体肌腱组织相接近的力学性能的支架材料是其中的关键性问题.结论:模拟体内环境,解决组织工程肌腱构建的牛物材料、种子细胞,以及在体外成功构建肌腱组织是未来组织工程肌腱构建过程中的研究的重点.  相似文献   

13.
背景:近年来,生长因子在肌腱愈合与粘连形成中的作用受到关注,其中转化生长因子与组织粘连与瘢痕形成的关系更倍受重视.目的:观察兔屈趾肌腱Ⅱ区伤口愈合过程中转化生长因子β1基因表达的变化.设计:随机对照动物实验.单位:青岛大学医学院附属医院骨科.材料:选用清洁级成年新西兰大白兔60只,体质量4.0~4.5 kg,雌雄不拘,由青岛市实验动物中心提供.所有动物的左前肢作为实验侧,同一动物右前肢作为对照侧.按术后1,7,14,21,28和56 d 6个时间点进行观察,每个时间点10只.其中6只进行原位杂交实验,4只进行免疫组织化学染色.实验过程中对动物的处置均符合动物伦理学标准.方法:实验于2005-09/2006-07在青岛大学医学院附属医院动物实验中心完成.麻醉后将所有动物左前中趾Ⅱ区屈趾深肌腱切断并用使用标准Kessler缝合法修复,对照侧不进行干预.分别于术后1,7,14,21,28和56 d麻醉后处死动物,实验侧沿原切口切开皮肤,切取肌腱与腱鞘.对照侧采取相同措施.主要观察指标:将肌腱与腱鞘组织进行原位杂交和免疫组织化学染色,观察转化生长因子β1的表达情况.结果:纳入的60只动物全部进入结果分析.①原位杂交结果:实验侧肌腱损伤后1 d,转化生长因子β1 Mrna的表达明显升高,在肌腱损伤后的14~21 d,转化生长因子β1 Mrna的表达持续升高达到最高峰,28 d开始下降,56d时仍保持较高水平.修复部位周围的腱鞘组织转化生长因子β1 Mrna的表达水平更高,在相同时间点,腱鞘细胞内的转化生长因子β1 Mrna的表达均高于肌腱组织.对照侧肌腱组织和腱鞘内均存在着转化生长因子β1 Mrna的表达,但是水平较低.实验侧各时间点腱鞘与肌腱细胞转化生长因子β1 Mrna的表达明显高于对照组,差异有显著性意义(P < 0.05).②免疫组织化学染色结果:实验侧动物转化生长因子β1蛋白信号的表达术后第1 天开始增加,14~21 d达到高峰,56 d仍保持较高的水平.对照侧动物存在转化生长因子β1蛋白信号的表达,但表达水平较低.结论:正常无损伤的肌腱和腱鞘细胞能产生转化生长因子β1,当肌腱损伤后,细胞因子被激活,增加的细胞因子主要由肌腱细胞与腱鞘细胞产生,与肌腱的内、外源性愈合机制是一致的.  相似文献   

14.
背景:近年来,生长因子在肌腱愈合与粘连形成中的作用受到关注,其中转化生长因子与组织粘连与瘢痕形成的关系更倍受重视。 目的:观察兔屈趾肌腱Ⅱ区伤口愈合过程中转化生长因子β1基因表达的变化。 设计:随机对照动物实验。 单位:青岛大学医学院附属医院骨科。 材料:选用清洁级成年新西兰大白兔60只,体质量4.0~4.5kg,雌雄不拘,由青岛市实验动物中心提供。所有动物的左前肢作为实验侧,同一动物右前肢作为对照侧。按术后1,7,14,21,28和56d6个时间点进行观察,每个时间点10只。其中6只进行原位杂交实验,4只进行免疫组织化学染色。实验过程中对动物的处置均符合动物伦理学标准。 方法:实验于2005—09/2006—07在青岛大学医学院附属医院动物实验中心完成。麻醉后将所有动物左前中趾Ⅱ区屈趾深肌腱切断并用使用标准Kessler缝合法修复,对照侧不进行干预。分别于术后1,7,14,21,28和56d麻醉后处死动物,实验侧沿原切口切开皮肤,切取肌腱与腱鞘。对照侧采取相同措施。 主要观察指标:将肌腱与腱鞘组织进行原位杂交和免疫组织化学染色,观察转化生长因子β1的表达情况。 结果:纳入的60只动物全部进入结果分析。①原位杂交结果:实验侧肌腱损伤后1d,转化生长因子β1 mRNA的表达明显升高,在肌腱损伤后的14~21d,转化生长因子β1 mRNA的表达持续升高达到最高峰,28d开始下降,56d时仍保持较高水平。修复部位周围的腱鞘组织转化生长因子β1 mRNA的表达水平更高,在相同时间点,腱鞘细胞内的转化生长因子β1 mRNA的表达均高于肌腱组织。对照侧肌腱组织和腱鞘内均存在着转化生长因子β1 mRNA的表达,但是水平较低。实验侧各时间点腱鞘与肌腱细胞转化生长因子β1 mRNA的表达明显高于对照组,差异有显?  相似文献   

15.
背景:异体移植的免疫排斥问题是移植能否成功的首要问题。目的:总结异体肌腱移植治疗跟腱缺损或异体跟腱移植治疗交叉韧带的免疫学特点。方法:应用计算机检索1990-01/2012-01PubMed数据库及万方数据库有关异体跟腱移植或跟腱重建的相关文献。英文检索词"allograft,tendon,immunity,transplatation",中文检索词"异体,跟腱,移植,免疫"。检索文献量总计83篇。结果与结论:腱组织的异体移植重建免疫排斥问题给手术增加了失败的危险性,但从目前研究来看经深低温冷冻处理的异体肌腱,是人体肌腱缺损修复的理想替代材料。它不以牺牲正常组织结构为代价,不受个体条件的限制。保证了肌腱移植的成功性,为跟腱再断裂缺损修复提供了可靠保证。而且具有操作简单,切口小,损伤小,效果可靠的优点。  相似文献   

16.
背景:异体移植的免疫排斥问题是移植能否成功的首要问题。目的:总结异体肌腱移植治疗跟腱缺损或异体跟腱移植治疗交叉韧带的免疫学特点。方法:应用计算机检索1990-01/2012-01PubMed数据库及万方数据库有关异体跟腱移植或跟腱重建的相关文献。英文检索词"allograft,tendon,immunity,transplatation",中文检索词"异体,跟腱,移植,免疫"。检索文献量总计83篇。结果与结论:腱组织的异体移植重建免疫排斥问题给手术增加了失败的危险性,但从目前研究来看经深低温冷冻处理的异体肌腱,是人体肌腱缺损修复的理想替代材料。它不以牺牲正常组织结构为代价,不受个体条件的限制。保证了肌腱移植的成功性,为跟腱再断裂缺损修复提供了可靠保证。而且具有操作简单,切口小,损伤小,效果可靠的优点。  相似文献   

17.
目的:就近年来国内外肌腱移植材料的研究进展,对组织工程化肌腱移植技术取得的成果进行总结。资料来源:应用计算机检索Medline1980-01/2005-01相关肌腱移植材料与组织工程化肌腱移植技术的文献,检索词“tendon transplant,tissue engineer,progress”,并限定文献语言种类为English。同时计算机检索CBM1990-01/2005-01相关肌腱移植材料与组织工程化肌腱移植技术方面的文献,检索词为“肌腱移植,组织工程,综述文献”,并限定语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,选取包括肌腱移植材料与组织工程化肌腱移植技术的文献,开始查找全文。纳入标准:①肌腱移植材料。②组织工程化肌腱移植技术。排除标准:综述文献,重复研究,Meta分析类文章。资料提炼:共收集到45篇关于肌腱移植材料与组织工程化肌腱移植技术的文献,纳入30篇符合标准的文献。资料综合:用于肌腱移植的材料主要有以下几类:自体肌腱、同种异体肌腱、人工肌腱和组织工程化肌腱。近年来在异体肌腱移植方面取得了较成熟的经验。20世纪80年代后期组织工程技术的建立和发展,为肌腱组织缺损的修复又提供了一条新的思路和途径。组织工程化肌腱的研究目的是将体外预制的肌腱回植入体内的肌腱缺损处以恢复关节的功能。目前,研究者正致力于研究同时集两类生物材料优点的细胞支架,与肌腱细胞联合体外培养,使之可以成为一种永久性的有生命活性的组织工程化肌腱。结论:肌腱移植的材料主要有自体肌腱、同种异体肌腱、人工肌腱和组织工程化肌腱等。种子细胞、细胞外基质材料应用的深入研究必将推动组织工程化肌腱移植技术的进一步发展。  相似文献   

18.
背景:临床上超声被用于软组织急慢性损伤的治疗,但是关于超声波治疗肌腱挛缩的实验研究较少.目的:观察超声对应力屏蔽后大鼠跟腱的作用和白细胞介素1β水平的影响.方法:将24只SD大鼠随机分为正常组,造模组和超声治疗组,后2组大鼠左后肢用跟腱环扎联合坐骨神经切断的方法造模,治疗组术后3周开始进行超声治疗,强度为1W/cm2,频率为1MHz,通胀比为20%,每周治疗5 d,1次/d,10 min/次,治疗共3周.术后6周取其左后肢部分跟腱组织,进行透射电镜检测,并采用ELISA法检测白细胞介素1β水平.结果与结论:超声治疗3周后胶原纤维排列较造模组整齐,细小纤维减少,接近于正常对照组.造模组白细胞介素1β水平显著高于正常组,超声治疗后白细胞介素1β水平显著降低.结果提示超声治疗可以对挛缩跟腱有治疗作用,可能与降低挛缩跟腱中白细胞介素1β水平有关.  相似文献   

19.
目的:总结和分析肌腱组织工程应用于肌腱运动损伤修复的研究现状.方法:以"tissue engineering,artificial biocompatlble tendon",为英文检索词,以"组织工程,肌腱"为中文检索词,计算机检索PubMed和万方数据库1994-01/2009-12的相关文献.纳入具有原创性,论点论据可靠的实验文章,排除重复性的研究,选择符合标准的33篇文献做进一步分析.结果:肌腱运动损伤后若未予以及时修复常会导致肢体功能障碍,组织工程化人工肌腱修复缺损肌腱可对肌腱缺损进行形态修复和功能重建,并达到永久性替代.目前,组织工程学研究进展迅速,但要真正应用于临床仍存在一些问题.文章就以下问题进行了讨论:①种子细胞的来源.②对材料选取及如何合理改进,从而塑造理想的器官形状三维支架材料.③如何模拟体内环境,在体外构建肌腱组织.④如何使制造出来的组织工程肌腱有更好的生物力学性能.结论:如何在体外利用生物反应器模拟体内环境,进行组织工程化肌腱的构建,将是未来的研究方向.  相似文献   

20.
目的:综述肌腱组织工程在肌腱修复过程中的应用进展。方法:应用计算机检索1993-01/2009-10PubMed数据库及维普数据库有关肌腱组织工程研究进展、肌腱支架材料生物力学分析、生物材料在肌腱组织工程中应用及组织工程技术在修复肌腱缺损临床应用方面的相关文献,英文检索词为"tendontransplantation,tissue engineering,biologicalmaterial,cellstent",中文检索词为"肌腱移植,组织工程,生物材料,细胞支架"。检索文献量总计132篇。结果:目前组织工程化肌腱的研究已经取得了显著的成果,但要真正应用于临床,大批量生产,仍存在一些问题。诸如最适的种子细胞来源、理想的支架材料、最佳的培养条件以及植入体内的检测方法等,在组织工程真正成为一种治疗肌腱缺损和功能重建的选择之前,这些问题都是有待进一步研究和解决的。结论:要真正实现体外预制有生命的种植体完全替代人体组织、器官功能,尚面临着许多挑战。  相似文献   

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