牛卵母细胞体外成熟的研究

为了给牛细胞核移植提供卵母细胞 ,1 997年 3月至 2 0 0 1年 3月共进行了 86次卵母细胞体外成熟的实验研究 ,核成熟率 (以出现第一极体为成熟标志 )为 6 5.1 2 %( 2 332 /372 1 )。其中 ,基础培养液为TCM1 99+ 0 .1 2mg/ml丙酮酸钠 + 1 0mMHepes+ 8%NCS + 1 0 μg/mlFSH + 1 0 μg/mlLH + 1 μg/mlE2 (培养液 1 )组进行 6 8批次实验 ,核成熟率为 57.97% ( 1 6 80 /2 898)。基础培养液为TCM 1 99+ 0 .1 2mg/ml丙酮酸+ 8%的发情牛血清 (为 4头发情牛的混合血清 ,培养液 2 )组进行 1 8次实验 ,核成熟率为 79.2 2 % ( 6 52 /82 3)。培养液 1组与培养液 2组之间卵母细胞成熟率差异显著(P <0 .0 5)。培养液 2的组中有 9次添加了 40IU/ml的庆大霉素 ,其核成熟率为72 .1 5% ( 342 /4 74) ;另 9次未添加庆大霉素 ,其核成熟率为 88.83% ( 31 0 /349) ,两者之间无明显差异 (P >0 .0 5)。此外本研究对以去核卵母细胞激活后分裂率作为卵母细胞质成熟的标准作了初步的探讨     

蛋白激酶C激活剂对牛卵母细胞体外成熟的影响

近年来的研究证实,除cAMP依赖性蛋白激酶A外,另一在细胞信息传递过程中起重要作用的是磷脂/Ca~(++)依赖性激酶C(PKC)。在大鼠有报道表明,PKC在GnRH诱发卵泡内卵母细胞的成熟过程中起中介作用,因PKC的激活剂OAG、PMA及A23187可在卵母细胞成熟过程中模拟GnRH的作用。然而,在小鼠PKC的激活剂则证明对卵母细胞的成熟具抑制作用,PKC在牛卵母细胞体外成熟中的作用亦未见有报道。因此,本研究将通过测定牛卵母细胞成熟后的受精及早期胚胎发育能力来探讨PKC激活剂在牛卵母细胞体外成熟中的作     

发情牛血清和绵羊卵泡液对绵羊卵母细胞体外成熟和受精的影响

本试验研究了绵羊卵泡卵母细胞在体外成熟时,以M-199为基础液,加入FBS,OCS,以及不同直径(小于8mm或大于10mm)卵泡的卵泡液对体外成熟率和体外受精率的影响。在添加同等浓度促性腺激素(FSH,0.4μg/ml;LH,2iu/ml)时,添加5%FBS或5%OCS的成熟率分别为10.00%和69.30%(P<0.05);体外受精分裂率分别为0和60.84%(P<0.05)。在添加以上浓度促性腺激素和5%OCS的基础上添加3%大卵泡液或小卵泡液时,卵母细胞成熟率分别为53.10%和78.20%(P<0.05);体外受精分裂率分别为50.00%和71.67%(P<0.05)。结果表明,发情牛血清配合大卵泡液可以充分满足绵羊卵母细胞体外成熟的需要。     

异种卵泡液对牛卵母细胞体外成熟率的影响

本研究探讨了异种卵泡液对牛卵母细胞体外成熟率的影响。结果表明,在培养基中添加适当浓度的山羊、绵羊、骆驼卵泡液代替血清,牛卵母细胞的成熟率(67．9％、68．5％、65．3％)与血清对照组(72．0％)无显著差异(P＞0．05);在添加山羊、绵羊、骆驼卵泡液的基础上补充激素,卵母细胞的成熟率(70．8％、72．9％、69．7％)也未见明显提高(P＞0．05)。     

黄牛体外受精的研究

本实验主要探讨黄牛卵母细胞体外成熟、受精及其受精后胚胎的体外培养。结果表明,卵母细胞在体外培养22小时后:80％以上的卵母细胞发育至中期Ⅱ(MⅡ)阶段。当培养液中添加促卵泡素(FSH,10国际单位/毫升)和雌二醇(E_2 1微克/毫升)时,其培养成熟的卵母细胞不仅受精率提高(83%),而且受精后卵裂率显著提高(67％,P<0.01)。 输卵管细胞单层和细胞上清液不仅能有效地克服牛胚胎的8-细胞阻断,而且对胚胎的发育具有显著的促进作用,二者在培养效果上差异不显著。2—8-细胞阶段胚胎,在输卵管细胞单层、输卵管细胞上清液和对照组(TCM199+10%小牛血清)中培养5天后,分别有77％、74％和27％的早期胚胎发育到桑椹或囊胚。     

牛卵母细胞体外成熟减数分裂进程及核型变化的研究

为了更加深入了解牛卵母细胞体外成熟减数分裂及其伴随该进程中核型的变化,实验采用常规的牛卵母细胞体外成熟方法及核型染色方法对成熟过程中减数分裂恢复情况及其对应的核型进行了研究。结果表明:牛卵母细胞体外成熟8 h减数分裂抑制恢复率达45.26%,成熟12 h时绝大部分卵母细胞(81.63%)已经恢复了减数分裂抑制状态,正常成熟24 h后GVBD率达91.67%。说明在对牛卵母细胞进行体外成熟过程中卵母细胞可以按照正常的减数分裂进程发育至受精前阶段,经染色后可以较为清楚识别减数分裂各时期细胞核核型形态及其变化规律,为研究牛卵母细胞体外成熟减数分裂抑制恢复的分子机制探讨及体外成熟效率的提高提供了参考价值。     

三种不同激活方法对牛卵母细胞孤雌激活效果的研究

本试验以体外成熟培养 (IVM ) 2 2～ 2 4h的牛卵母细胞为对象 ,采用以下 3种激活方法 :①电激活 ( 2次直流脉冲 ,时间 30us,强度 1 .8KV/cm ,时间间隔 70us) +环己酰胺 +细胞松弛素B法 ;②电激活 (同上 ) +离子霉素 + 6 -DMAP(二甲基 -氨基嘌呤 )法 ;③ 7%乙醇 +环己酰胺直接激活的方法对体外成熟牛卵母细胞进行孤雌激活实验 ,观察激活后 48h卵母细胞的早期分裂情况。结果表明 ,方法①的卵母细胞分裂率为 31 .32 % ( 2 6 /83) ;方法②的分裂率为 2 7.5% ( 32 /1 1 6 ) ;方法③的分裂率为44.1 1 % ( 45/1 0 2 ) ,与前两种方法相比差异显著 ( p <0 .0 5)。     

TNF-α对体外培养人牙囊细胞表达RANKL、OPG的影响

目的研究不同浓度的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对体外培养人牙囊细胞中核因子-κB受体活化子配体(RANKL)、骨保护素(OPG)mRNA表达的影响,探讨牙齿萌出过程中TNF-α对破骨细胞形成的作用。方法原代培养人牙囊细胞,取生长状态良好的第5代人牙囊细胞分别与浓度为0(对照)、5、10、25、50、100ng/ml的TNF-α共同孵育6h,提取细胞RNA,RT-PCR检测RANKL、OPG的mRNA表达。以β-actin作内参物,比较各组PCR产物的光密度比值。结果与对照组(TNF-α 0ng/ml)比较,5ng/ml TNF-α可降低人牙囊细胞中OPG的表达(P<0.05),其他不同浓度TNF-α作用后OPG的表达与对照组比较无显著性差异。TNF-α浓度为25、50、100ng/ml时RANKL的表达增强,与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。结论TNF-α可增强人牙囊细胞RANKL的表达,降低OPG的表达,提高RANKL/OPG的比值,提示TNF-α在牙齿萌出过程中对破骨细胞的形成有重要作用。     

水牛与黄牛卵母细胞的回收及体外成熟、体外受精比较

本试验平均从每头水牛的卵巢上获得 4.58个卵母细胞 ,其中可用卵为 2 .97个 ,占 6 5% ,卵母细胞在数量和质量上都低于黄牛 ,差异极显著 (P <0 .0 1 )。黄牛卵母细胞体外成熟、受精率显著高于水牛 (P <0 .0 5)     

牛卵母细胞体外成熟培养时间对体外受精及早期胚胎体外发育的影响

本文报道了牛卵母细胞经不同时间体外成熟培养对其后体外受精及早期胚胎体外发育能力的影响。 实验用的母牛卵巢从附近的屠宰场收集。卵母细胞采用穿刺抽取法采集。将外观形态正常的卵母细胞随机分成6组,在含10％发情牛血清的TCM-199培养液中分别经12(G1)、16(G2)、20(G3)、24(G4、对照组)、28(G5)和32小时(G6)的体外成熟培养(IVM)后进行体外受精(IVF),早期胚胎(2-8细胞阶段)在采用卵泡颗粒细胞作为支持细胞的单层上皮细胞液滴中进行 复合培养至囊胚及孵化囊胚阶段。结果表明,经过12—32小时IVM的牛卵母细胞,在IVF后48小时检查,卵裂率均可达到81％以上(80.9％—91.9％);但IVM时间短至12小时(G1)及超过24小时(G5、G6)的卵裂率(分别为80.9％,83.5%和83.4％)显著地低于24小时的对照组(G4,91.9%,P>0.05)。     

不同成熟时间对牛卵母细胞发育及去核效率的影响

本文研究了不同成熟时间对牛卵母细胞的体外成熟、体外受精及后期的体外培养的影响和不同成熟时间的极体出现率。结果表明,牛卵母细胞在成熟16h时极体出现率达69.3%、分裂率为54.7％、囊胚率仅为6.25%;而成熟24h时极体出现率达76.9%、分裂率为70.0%、囊胚率为27.7%,差异均显著（P＜0.05）。成熟16h的卵母细胞刚刚排出第一极体,细胞核与极体非常近,此时去核率较高;而成熟24h的卵母细胞核已远离第一极体。     

水牛卵母细胞去核方法的摸索

本研究对水牛卵母细胞的去核方法进行了摸索。首先通过盲吸法去核,摸索水牛卵母细胞在体外成熟不同时间的成熟率和去核率;其次采用spindle-View系统去核,摸索用这种系统去核的最佳时间。水牛卵母细胞IVM16-18h与IVM 19-21h的成熟率之间有显著差别(43.0％vs58.2％,P<0.05),与22-24h组的成熟率之间有极显著差别(43.0％vs 68.8％,P<0.01).而去核率的情况刚好相反。随着卵母细胞成熟时间的延长,卵细胞的核与PB1的相对距离增大。在体外成熟18h,20h,22h,有较大比例(分别为72.6％、67.9％、64.0％)的卵母细胞中的核与PB1的位置较近,但当成熟时间增加到24h时,这一比例下降到57.6％(72.6％vs 57.6％,P<0.05),如采用Spindle-View系统去核则可消除成熟时间对去核率的影响,这些结果表明:1.水牛卵母细胞的成熟时间的延长不断提高,而去核率呈下降趋势;2.水牛卵母细胞成熟时间的延长会增加核与PB1的相对距离;利用Spindle-View系统可提高成熟时间较长的卵母细胞的去核率。     

HA1077对骨髓间质干细胞促愈作用的影响

目的 探讨HA1077对骨髓间质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)促愈作用的影响及其机制. 方法 (1)体外实验:体外分离培养大鼠BMSCs,随机分为正常对照组、诱导组和HA1077组.对照组加入DMEIM完全培养液;诱导组:70%DMEM完全培养液+30%大鼠成纤维细胞上清液+含8 μg/L表皮细胞生长因子(EGF)的培养液;HA1077组:在诱导组培养液基础上加入终浓度为10 μmol/L的HA1077.取培养7 d的细胞,流式细胞检测CK19表达,细胞周期和核增殖抗原(PCNA)表达.(2)在体实验:按前述方法 制备兔BMSCs.取新西兰大耳白兔8只,在背部制备6个直径为3 cm的圆形皮肤缺损(每侧各3个),深至皮下.创面随机分为空白对照组(A组):创面应用等渗盐水;EGF对照组(B组):创面外用EGF,50 U/cm2;BMSCs治疗组(C组):除用EGF外,创面注射BMSCs细胞悬液1 ml,2×106/ml;BMSCs+HA1077治疗组(D组):除应用C组措施外,创面注射0.5 ml HA1077,浓度为20 μmol/L.伤后3,7,14 d计算愈合指数(WCI). 结果 (1)体外实验:诱导组CK19的阳性率为(11.13±2.14)%,HA1077组为(40.31±0.81)%,明显高于诱导组(P<0.01).HA1077组PCNA阳性率明显高于诱导组,细胞周期分析显示S期细胞数量最多.(2)在体实验:D组伤后14 d的创面愈合指数为86.20±1.92,效果明显好于B组、C组和对照组. 结论 HA1077可以促进BMSCs细胞表达PCNA进入S期,进而分化表达CK19;在体表联合应用HA1077和BMSCs,可以明显促进创面愈合.     

神经肽P物质对肉芽组织成纤维细胞增殖及表皮生长因子基因表达的作用

目的：探讨感觉神经肽P物质（SP）对离体培养的肉芽组织成纤维细胞的促增殖作用及其对表皮生长因子（EGF）基因表达的调控作用。方法：采用MTT法测定SP对肉芽组织成纤维细胞的促增殖作用；采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）方法检测SP对成纤维细胞EGF基因表达的调控作用，观察时间及剂量－效应关系。结果：10^-9～10^-5mol/L的SP在体外对肉芽组织成纤维细胞均具有明显的促增殖作用（P＜0．01），且具有明显的剂量依赖性（γ=0.594,P＜0．01），EGF抗体只能部分抑制这一作用（与对照组比较，P＜0．01；与10^-7mol/L SP组比较，P＜0．05）。10^-7mol/L SP可诱导成纤维细胞EGF mRNA的表达，在作用后6h与对照组比较，差异有非常显著性意义（P＜0．01）；SP在10^-8～10^-6mol/L范围内可以显著促进成纤维细胞EGF mRNA表达，在10^-7mol/L达到峰值，当浓度＞10^-7mol/L时，其促EGF mRNA表达的效应强度随浓度升高而有所降低，至10^-5mol/L时与对照组比较，差异无显著性意义。结论：SP对肉芽组织成纤维细胞具有明显的促增殖作用，这种作用与其诱导成纤维细胞EGF表达有关。     

水牛体外受精胚胎的玻璃化冷冻

本文以ES35为玻璃化冷冻液 ,ES2 0和 30 %乙二醇为前处理液 ,进行不同时间的前处理 ,初步探讨了水牛体外受精胚胎的玻璃化冷冻保存方法。结果 4个处理组中以ES2 0前处理 2min组冷冻效果最好 ,其冻胚解冻后孵化率达 6 4 .4 1% ,30 %乙二醇前处理 5min组孵化率为 5 7.4 1% ,两组与对照组差异不显著 ,其余两组与对照组差异极显著 ;ES2 0前处理中 2min组与 5min组差异极显著 (6 4 .4 1%vs2 1.15 % ,P <0 .0 1) ;30 %乙二醇前处理中 5min组极显著高于 2min组 (5 7.4 1%vs2 3.6 4 % ,P <0 .0 1) ;取ES2 0前处理 2min组的冻胚移植了 5头本地母水牛 ,结果有一头妊娠。于 2 0 0 2年 12月 6日产下全国首例冻胚移植的试管水牛     

外源性机械生长因子对大鼠骨骼肌卫星细胞生物学特性的影响

目的:研究机械生长因子(MGF)促离体培养的骨骼肌卫星细胞增殖的最佳浓度,并观察该浓度对细胞生长曲线、总蛋白及凋亡情况的影响。方法:选用雄性SD大鼠1只,无菌条件下取后肢肌肉,采用改进的两步酶消化法结合差速贴壁技术,分离及纯化骨骼肌卫星细胞。取第3代骨骼肌卫星细胞,分别采用终浓度为15、25、50、100、200 ng/ml的MGF进行干预,作为实验组;另以单纯加入100μl生长培养基作为对照组,以加入100μl DMEM作为阴性对照组。同步化后,于培养24 h后加入CCK-8溶液。采用CCK-8比色法检测不同浓度MGF下细胞的增殖情况并筛选出最佳浓度后,绘制生长曲线,同时运用BCA法及Hoechst 33342、PI双染法测定最佳增殖浓度的MGF对卫星细胞蛋白合成及细胞凋亡的影响。免疫细胞化学法鉴定骨骼肌卫星细胞。结果:①终浓度为15、25、50、100 ng/ml的MGF均有促进骨骼肌卫星细胞增殖的作用(P<0.01),其中25 ng/ml MGF促增殖作用最佳。②与对照组相比,MGF组细胞生长曲线左移,倍增时间、平台期均缩短。③与对照组相比,25 ng/ml MGF作用48 h即对骨骼肌卫星细胞有明显的增殖效果(P<0.05);与对照组相比,25 ng/ml MGF作用骨骼肌卫星细胞48 h和72 h时,其总蛋白含量显著增加(P<0.05);与对照组相比,25 ng/ml MGF作用72h、96h,骨骼肌卫星细胞的平均凋亡指数显著减小(P<0.05)。结论:①机械生长因子可促进体外培养的大鼠骨骼肌卫星细胞增殖,最佳浓度为25 ng/ml;②25 ng/ml MGF可以使骨骼肌卫星细胞提前进入平台期,缩短生长周期;③25 ng/ml MGF可以抑制骨骼肌卫星细胞的凋亡。     

表皮生长因子对肝星状细胞c-fos基因表达的影响

目的了解表皮生长因子（EGF）对肝星状细胞c-fos基因表达的影响。方法在培养的肝星状细胞系中加入不同浓度的EGF（终浓度20ng/ml、100ng/ml、500ng/ml）,于8h、24h、48h、72h四个时间点分别收集细胞,提取肝星状细胞总RNA;用逆转录定量PCR方法测定c-fos基因的表达水平。结果EGF三组HSC-T6细胞c-fos基因表达水平在8h、24h、48h、72h四个时间点均显著高于对照组;随剂量加大,HSC-T6细胞c-fos基因表达水平逐渐升高,三组间也有显著差异。结论表皮生长因子对肝星状细胞c-fos基因表达有明显的上调作用。     

富氢液对脓毒血症大鼠肠黏膜屏障保护作用及机制研究

目的探讨富氢液对脓毒血症大鼠肠黏膜屏障的影响及其可能机制。方法清洁级SD大鼠30只,随机分为假手术组(sham组)、脓毒血症组(SEP组)及富氢液处理组(C组),每组10只。sham组仅开腹,显露盲肠;C组和SEP组行盲肠结扎穿孔术,再分别静脉给予富氢液和等量生理盐水。3组大鼠均于模型建立4 h后处死,观察小肠组织病理学结果;酶联免疫吸附法(ELISA)检测肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、D-乳酸、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)浓度;蛋白质印迹(Western-blot)法检测B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bax、Caspase-3蛋白表达水平。结果光镜下sham组未出现病理损伤,SEP组损伤较重,C组损伤较轻。与sham组比较,SEP组I-FABP、D-乳酸升高[(817.12±50.39)ng/ml比(378.54±40.50)ng/ml;(513.84±42.91)ng/ml比(329.98±38.11)ng/ml,P<0.05]。与SEP组比较,C组I-FABP、D-乳酸降低[(548.92±42.19)ng/ml比(817.12±50.39)ng/ml;(437.89±36.12)ng/ml比(513.84±42.91)ng/ml,P<0.05]。与sham组比较,SEP组TNF-α、IL-6、IL-10升高[(196.51±30.31)ng/ml比(75.54±10.21)ng/ml;(68.69±3.39)ng/ml比(20.97±2.38)ng/ml;(149.61±20.21)ng/ml比(80.69±13.51)ng/ml,P<0.05];与SEP组比较,C组TNF-α、IL-6降低,IL-10升高[(118.47±10.14)ng/ml比(196.51±30.31)ng/ml;(45.36±5.14)ng/ml比(68.69±3.39)ng/ml;(178.52±26.31)ng/ml比(149.61±20.21)ng/ml,P<0.05]。与sham组比较,SEP组Bcl-2蛋白表达升高,Bax与Caspase-3降低(P<0.05);与SEP组比较,C组Bcl-2蛋白表达降低,Bax与Caspase-3升高(P<0.05)。结论富氢液对脓毒血症大鼠肠黏膜屏障有保护作用,其机制与抑制凋亡相关因子有关。     

激活素A及卵泡抑素对大鼠肾间质成纤维细胞Ⅰ型胶原的影响

目的探讨激活素A(ACT-A)及卵泡抑素(FS)对体外培养的大鼠肾间质成纤维细胞合成I型胶原(ColI)的影响。方法无菌条件下取SD大鼠肾脏髓质,胶原酶消化法进行培养,鉴定为肾间质成纤维细胞后分为3组:不同ACT-A浓度组(A组),不同FS浓度组(F组),30ng/mlACT-A 不同浓度FS组(A F组),应用免疫组化及RT-PCR法检测培养细胞ColI蛋白及ColImR-NA的表达。结果成功培养了大鼠肾间质成纤维细胞,在本研究浓度范围内,ACT-A促进了大鼠肾间质成纤维细胞ColI蛋白(P<0·01)及ColI mRNA表达(P<0·01),FS能抑制30ng/mlACT-A的上述效应(P<0·01),而单纯FS对大鼠肾间质成纤维细胞ColI蛋白和mRNA的表达无影响(P>0·05)。结论ACT-A可能在肾间质损害的发生发展中起重要作用,补充外源性的FS有可能为治疗肾间质纤维化提供新的思路。