PIG-A基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的建立

目的 构建含磷脂酰肌醇聚糖A类基因(PIG-A)的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系.方法 采用PCR方法从质粒pEBPIG-A中扩增PIG-A基因片断,Bam HⅠ及XhoⅠ双酶切后连接至逆转录病毒载体pLEGFP-C1,用限制性内切酶和DNA序列测定的方法对重组质粒进行鉴定.脂质体法转染PA317包装细胞,荧光显微镜下观察EGFP瞬时表达,G418筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果 酶切证实PIG-A基因克隆至逆转录病毒载体,测序结果和原始序列相同.重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞,24～48h后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达.经G418筛选得到6个稳定抗性克隆,病毒滴度最高达1.6×105CFU/ml.结论 构建了含PIG-A基因的逆转录病毒载体,获得了稳定的产毒细胞系.     

真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2的构建及其在U251细胞中的表达

目的 构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,并探索其在U251神经胶质瘤细胞中的表达.方法 以正常人脑组织总RNA为模板,采用RT-PCR法获得Bex2的cDNA,并与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒.对pEGFP-N1-Bex2重组质粒的菌液行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定.在U251细胞中用脂质体转染法转染pEGFP-N1-Bex2真核表达载体过表达Bex2,分别于转染后12、24、48、72 h收集细胞,用Western blot检测Bex2基因的表达情况.结果 真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2经PCR及双酶切鉴定,均可见387 bp的目的基因条带,并单倍正向克隆至质粒中.转染质粒pEGFP-N1-Bex2后荧光显微镜下观察U251细胞内有绿色荧光蛋白表达,Western blot检测见47 KD和26 KD分别有清晰的外源性Bex2-GFP融合蛋白和GFP蛋白的表达.pEGFP-N1-Bex2在转染U251细胞后12h即有表达,48 h达到高峰.结论 成功构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,瞬时转染后在U251细胞中顺利表达.     

UNC5B基因靶向shRNA表达质粒的构建及体外RNA干扰

目的：探讨人UNC5B基因的双链RNA在体外对UNC5B表达的干扰作用及其规律。方法：构建两个能产生UNC5B的发夹状RNA（shRNA）的质粒载体Pgenesil—UNC581及Pgenesil—UNC582作为实验组，并构建无关序列shRNA表达质粒Pgenesil—NC作为阴性对照，将3种质粒分别转染脐静脉内皮细胞（HUVEC）。转染24h后，荧光倒置显微镜下观察质粒转染效率，用G418筛选得到稳定转染的细胞，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测UNC5B在HUVECs中的表达情况。结果：转染24h后，在荧光显微镜下可见绿色荧光，转染效率约为40％～50％。实验组经G418筛选后稳定转染的细胞UNC5BmRNA均受到抑制。两种UNC5B基因靶向shRNA表达质粒对HUVECs中UNC5B抑制率分别为88％和52％。结论：本研究所构建的UNC5BshRNA表达质粒可在体外高效特异地抑制UNC5B的表达，为进一步实验奠定了基础。     

肝细胞生长因子在LO2细胞表达的实验研究

目的 将肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)真核表达栽体,转染培养的LO2肝细胞,观察其表达。方法 将含肝细胞生长因子cDNA真核表达栽体PEGFP-HCF,脂质体(Lipofectauline)转染培养的LO2肝细胞;PCR鉴定外源基因的导入,绿荧光蛋白检测肝细胞生长因子的表达。结果 (1)重组质粒PEGFP-C1-HGF转染峨肝细胞,5d后,细胞内可检测到绿荧光蛋白。(2)PCR结果显示：转染PEGFP-C1-HGF质粒组可见306bp特征条带与阳性对照大小一样,假转染组与空质粒组无特征条带。结论 人肝细胞生长因子基因真核表达栽体,PEGFP-C1-HGF,能成功转染LO2细胞并获表达。     

利用Gateway技术构建重组腺病毒pAd-NK4

目的利用Gateway技术构建含人肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体。方法以含有HGF/NK4基因的质粒为模板PCR扩增NK4基因,将回收的NK4PCR产物片段克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-6获得重组质粒pYr-adshuttle-6-NK4。从该重组质粒上,利用LR同源重组将NK4-IRES-EGPF表达框转移至腺病毒骨架质粒pAD/BL-DEST,获得重组腺病毒质粒pAd-NK4-IRES-EGFP。该质粒经pacI线性化后转染293包装细胞,获得重组腺病毒rAd-NK4-IRES-EGFP。采用TCID 50(tissue cell infectiousdosage 50,TCID 50)法测定重组腺病毒滴度。重组腺病毒分别经酶切和PCR等方法进行鉴定。荧光显微镜观察转染效果。结果证实腺病毒载体中含有NK4基因的目的片段;病毒滴度为6.3×1011 PFU.L-1;荧光显微镜发现该重组腺病毒能在HEK293细胞中高效的表达。结论利用Gateway技术可以快速地构建同时表达NK4蛋白和绿色荧光的重组腺病毒,为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。     

HPV阳性宫颈癌细胞特异性穿膜肽PTP的穿膜特性研究

目的：证实宫颈癌细胞特异性细胞膜穿透肽特异性穿膜并优化穿膜条件。方法：将编码人乳头瘤病毒（HPV）阳性宫颈癌细胞特异性穿膜肽（PTP）的cDNA片断与编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因片断融合,克隆至原核表达质粒pET15b克隆位点,构建pET15b-GFP-PTP重组原核表达载体。转化大肠杆菌BL21(DE3)并表达GFP-PTP融合蛋白,纯化后的GFP-PTP融合蛋白作用于体外培养的HPV阳性宫颈癌细胞株HeLa,Siha,肺癌细胞株A549及正常脐静脉内皮细胞ECV304。利用合成的标记短肽探讨优化穿膜条件。结果：荧光显微镜观察发现,与融合蛋白GFP-PTP共孵育后的Hela和Siha细胞胞浆及胞核内有绿色荧光均匀分布,而A549及ECV304胞内无绿色荧光。与GFP共孵育的任何细胞内均无绿色荧光。流式细胞术分析结果显示PTP对HeLa,Siha细胞的穿膜效率分别为33.2％和28.9％。10% DMSO处理细胞后可增强PTP特异性穿透HPV阳性宫颈癌细胞株的胞膜并改善胞浆内分布。结论：本研究结果为进一步探讨PTP作为宫颈癌防治的靶向导入载体奠定了基础。     

FAM3B基因cDNA克隆及其在胃癌细胞系BGC-823的表达

目的克隆FAM3B cDNA,构建FAM3B重组表达载体并在胃癌细胞系BGC-823中表达,观察其对细胞系的影响,探索新的肿瘤治疗途径。方法构建pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒,将pEGFP-N2-FAM3B转染人胃癌细胞系BGC-823,研究其对胃癌细胞产生的作用。结果重组pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒构建成功,经pEGFP-N2-FAM3B转染后,荧光显微镜下可见转染的BGC-823细胞有绿色荧光蛋白的表达,转染后的BGC-823细胞生长减慢。结论构建完成真核表达载体pEGFP-N2-FAM3B,重组pEGFP-N2-FAM3B质粒在胃癌细胞系BGC-823细胞内成功表达。     

人雌激素受体β绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人雌激素受体β(ERβ)绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体,并稳定转染乳腺癌MCF-7细胞。方法通过双酶切将pCMV5-hERβ中的人ERβcDNA克隆到pEGFP-C3中,构建并鉴定重组质粒pEGFP-hERβ,然后转染乳腺癌MCF-7细胞,采用G418(500μg/mL)筛选出稳定转染的细胞系,在荧光显微镜下观察融合蛋白质在真核细胞内的表达分布,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ERβ的mRNA转录水平。结果成功构建重组表达载体pEGFP-hERβ,有效转染并筛选出稳定转染ERβ基因的MCF-7细胞系,外源性ERβ基因在MCF-7细胞中获得了有效转录,并在细胞质和细胞核中均广泛分布。结论建立了稳定表达ERβ的MCF-7细胞系,为筛选ERβ调节剂和进一步研究ERβ在乳腺癌中的作用及其机制奠定基础。     

基因1b型不同准种株HCV核心蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的 构建基因1b型丙型肝炎病毒(HCV)不同准种株截短片段核心蛋白(CP)绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白表达质粒.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增获得等长度片段的CP基因:氨基酸(aa)长度为癌中心株(T)∶T∶1-172 aa、癌旁株(NT)∶1-172 aa及C191(HCV-J6)∶1-172 aa,扩增产物用Nhe I及EcoR I双酶切后将其插入到真核表达质粒pEGFP-N1中,转染不同细胞系,用荧光显微镜及流式细胞仪观察GFP的表达.结果 PCR扩增、序列分析验证,T、NT及C191截短片段CP基因均成功克隆到pEGFP-N1中,在转染HepG2、chang-liver 48h后,用荧光显微镜及流式细胞仪均观察到GFP的表达.结论 构建基因1b型HCV不同准种株截短片段CP的真核表达质粒获得成功,可用于不同准种株CP的功能研究.     

TIMP-1基因体外稳定转染对人卵巢癌A2780细胞周期与增殖的影响

目的:探讨正、反义基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)基因对人卵巢癌细胞周期及增殖的影响。方法:将重组质粒正、反义TIMP-1表达载体体外转染到卵巢癌A2780细胞中,用G418筛选稳定表达细胞株并扩增培养,采用MTT细胞计数法检测肿瘤细胞生长增殖率,流式细胞术检测肿瘤细胞周期的变化。结果:经15～20 dG418筛选得到稳定表达细胞株,重组质粒TIMP-1稳定转染正义(PTs)组A2780细胞的增殖可明显受到抑制,细胞周期明显改变,细胞从G1期到S期发生阻滞。而反义(PTas)组细胞与之相反。结论:提示体外转染TIMP-1基因可使A2780细胞周期阻滞于G1期,并可抑制肿瘤细胞增殖。可为临床基因治疗及相关基因药物研究提供实验依据。     

四环素及其衍生物诱导表达的pTet-On肺癌细胞系A549的建立

目的:构建可受四环素诱导调控的高表达外源基因的真核表达体统A549 pTet-On细胞系。用于F10基因的功能研究。方法:将pTet-On质粒用脂质体介导法转染A549细胞,利用G418的药物选择特性,对转染的A549细胞进行压力筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化,单克隆分别扩增后,瞬时转染pTRE-luc(编码荧光素酶蛋白)质粒,Dox诱导表达后,检测荧光素酶活性,逐一筛选四环素调控高表达外源基因的A549 pTet-On细胞株。结果:成功构建了一株受Dox调控的高表达低背景的A549pTet-On细胞株。结论:筛选的A549细胞为F10基因表达能被pTet-on诱导表达系统调控的细胞系,为研究F10基因功能提供了理想的细胞模型。适合在此基础上对F10基因进行深入的研究。     

腺病毒介导的TSP1f基因转移对脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的影响

目的探讨腺病毒介导的凝血酶敏感蛋白1（TSP1）抗血管新生衍生物（TSP1f）基因转移对人脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的影响。方法应用RTPCR方法从正常人外周血单个核细胞扩增TSP1f cDNA序列构建TSP1f重组腺病毒（ADV-TSP1f）;Western blot方法检测ADV-TSP1f介导TSP1f在K562细胞中的表达;台盼蓝拒染检测经ADV-TSP1f感染的K562细胞条件培养基对ECV304细胞增殖的抑制作用。结果K562细胞经ADV-TSP1f感染可高效表达／分泌TSP1f多肽;经ADV-TSP1f感染的K562细胞条件培养基可显著抑制ECV304细胞增殖,以ADV-LacZ及PBS作对照,抑制率分别为51．6％和53．8％。结论ADV-TSP1f可显著抑制人脐静脉内皮细胞株ECV304增殖,可望成为有效的恶性肿瘤血管新生抑制剂。     

人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

人脐静脉内皮细胞Caveolin-1基因沉默模型的建立

目的:利用小干扰RNA(siRNA)技术建立人脐静脉内皮细胞(ECV304)小凹蛋白(Caveolin-1)基因沉默模型,为研究Caveolin-1基因在人脐静脉内皮细胞中的作用.方法:通过Ambion专用软件对Caveolin-1基因编码区分析,设计合成短发夹RNA(shRNA)单链.通过T4连接酶将退火反应合成的shRNA双链克隆入含RNA PollII聚合酶表达元件的pENTRTM/U6入门载体,并利用Gateway技术构建相应的慢病毒RNA干扰(RNAi)表达载体.用REAL-TIME RT-PCR、蛋白印迹法分析沉默效率.结果:测序结果显示pENTRTM/U6载体插入的Cavelin-1基因shRNA序列大小及阅读框架正确.LR重组反应后成功构建了针对Caveolin-1基因的RNAi慢病毒表达系统.转染ECV-304细胞获得对Caveolin-1的沉默效率大于85%.结论:成功地构建了针对Caveolin-1基因的RNAi慢病毒表达系统,获得了长期稳定的基因剔除效应.人脐静脉内皮细胞Caveolin-1基因沉默模型能长期保种及传代,为进一步研究Cav-eolin-1基因的功能奠定了基础.     

慢病毒载体介导apelin基因转染人脐带间充质干细胞的实验研究

【摘要】目的构建带有荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和apelin基因的重组质粒pUbi-apelinFLAG-pSV40-EGFP并进行慢病毒包装,探讨其转染人脐带间充质干细胞的最佳感染复数（MOI）值及目的基因表达情况。方法化学合成目的基因片段并扩增。采用In-Fusion技术将酶切后的目的基因片段与线性质粒载体连接,转化入感受态DH5α细胞中后筛选阳性克隆并进行测序。重组质粒慢病毒载体转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度。将重组质粒慢病毒按不同MOI值转染人脐带间充质干细胞,根据转染效率得到最佳MOI值,并采用Real-timePCR及Western blot方法检测目的基因表达情况。结果通过PCR扩增获得酶切位点碱基修饰后的大小约284bp的目的基因片段,与慢病毒质粒载体连接后形成pUbi-apelin-FLAG-pSV40-EGFP重组质粒,测序结果与预期完全符合,并成功包装慢病毒颗粒。最佳MOI值为20,转染效率为（90.32±3.61）%。慢病毒载体能高效转染人脐带间充质干细胞且2周内持续稳定上调目的基因mRNA及蛋白的表达。结论重组质粒慢病毒载体pUbi-apelin-FLAGpSV40-EGFP可有效转染人脐带间充质干细胞,并可持续高表达apelin基因     

转染内皮祖细胞的脂质体与腺病毒载体的比较

目的:比较脂质体和腺病毒作为肝细胞生长因子(HGF)基因转染内皮祖细胞载体的效力.方法:分离培养大鼠骨髓血管内皮祖细胞,并通过摄取DiL-acLDL、结合FITC-UEA-1及流式细胞术检测表面抗原CD133+进行鉴定.脂质体介导细胞转染,将细胞分为HGF质粒转染组(转染pIRES2-EGFP-HGF质粒)、空载质粒转染组(转染plRES2-EGFP质粒)和空白对照组.病毒介导细胞转染,细胞分HGF病毒转染组(pAdxsi-GFP-HGF重组腺病毒转染)、空载病毒转染组(导入pAdxsi-GFP腺病毒)和空白对照组.荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,ELISA法检测HGF的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖能力.结果:脂质体和腺病毒载体均可成功将绿色荧光蛋白标记的HGF基因转入内皮祖细胞,其中腺病毒转染效率更高,最高可达80％以上,其表达HGF水平以及细胞增殖能力都明显强于脂质体转染.空载病毒转染组细胞增殖与空白对照组差异无统计学意义(P＞0.05),而空载质粒转染组细胞增殖明显少于空白对照组(P＜0.05).结论:腺病毒作为HGF基因转染内皮祖细胞的载体相对于脂质体载体具有更高效、低毒、高表达目的基因的优点.     

重组人可溶性血管内皮细胞

血管内皮细胞生长抑制因子（Vascular Endothelial GrowthInhibitor,VEGI）是从人脐静脉内皮细胞（HUVEC）cDNA文库筛选到的一个TNF超家族新成员。为研究重组可溶性人VEGI对新生血管形成抑制活性,检测了重组可溶性人VEGI对建株人脐静脉内皮细胞（ECV304）增殖抑制活性以及对兔角膜诱生血管、鸡胚尿囊膜（CAM）血管的抑制活性。表明可溶性人VEGI可以直接抑制ECV304内皮细胞的增殖,抑制兔角膜诱生血管、CAM血管形成。VEGI是一种新的血管内皮细胞生长抑制因子,强烈抑制新生血管形成,有望应用于肿瘤的治疗。     

基于报告基因和干扰素-α信号通路的药物筛选模型的建立

目的　建立基于报告基因和干扰素 α(Interferon α)信号通路的药物筛选模型,用于筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。方法　构建带有ISRE(IFN αstimulatedresponseelement)靶序列和报告基因的诱导性表达载体,并将其转染入血管内皮细胞 (ECV304 )中,筛选报告基因碱性磷酸酶(SEAP)表达受IFN α诱导的阳性克隆。选取相关的细胞因子干扰素 β、干扰素 γ和生长因子甲状旁腺素(PTH)进行模型特异性考察。结果　ECV304细胞中SEAP的表达受IFN α的诱导并呈现剂量依赖关系,IFN α的最高诱导表达率是IFN β最高诱导表达率的 9 0倍、IFN γ的 8 8倍、PTH的 9 1倍,具有相对特异性。IFN α对ECV304细胞无增殖作用。本方法的Z' 因子为 0 8,说明此模型具有很好的稳定性。结论　本模型的SEAP基因表达水平能够被其特异性配体强诱导表达,利用此模型在 96孔板上用化学发光法测定SEAP基因的诱导表达水平可筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。     

β-arrestin2基因转染对人肺腺癌细胞 A549的增殖影响

目的：观察外源性β-arrestin2基因对人肺腺癌细胞A549增殖的影响。方法利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3 c．1-β-arrestin2质粒和空载体pcDNA3．1质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,RT-PCR和Western blotting检测β-arrestin2基因表达的影响。采用MTT（四甲基偶氮唑盐）法分析转染细胞的增殖情况。结果经脂质体转染和筛选,建立了稳定表达β-arrestin2基因的A549细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较,转染β-arrestin2基因的细胞生长速度明显减慢（ P ＜0．05）。结论β-arrestin2基因可能通过抑制P65活性而抑制人肺腺癌细胞A549的生长。