利用同轴3D打印技术构建促内皮细胞生长类血管组织工程支架

体外构建血管网络对组织工程领域厚组织与器官再生至关重要。利用同轴3D打印技术,以海藻酸钠/丝素蛋白为生物墨水,可快速制备含人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的类血管组织工程支架。首先通过材料压缩模量和可打印性测试,优化适用于同轴系统的材料浓度;然后通过光学相干层析成像技术,研究打印参数对中空纤维丝形状的影响,优化同轴打印参数;结合模拟灌流实验,对支架内部类血管结构进行表征;最后通过细胞活、死染色和Alamar Blue法,检测支架中HUVECs生长情况。结果表明,经优化的生物墨水及打印参数能顺利制备具有内部联通性完整的类血管组织工程支架;HUVECs在体外培养时存在团聚生长现象,类血管通道的存在有利于维持组织整体活性,一周存活率在97%以上,且相比对照组能够维持较高的增殖速率。研究证明,利用同轴3D打印技术能成功构建促内皮细胞生长的类血管组织工程支架,可为厚组织及器官再生提供新的可能。     

3D打印明胶/海藻酸钠/58S生物玻璃骨缺损修复支架的生物安全性评价北大核心

背景:在组织工程开发的多种生物材料中,明胶、海藻酸钠和58S生物活性玻璃在骨缺损修复中具有良好的生物相容性、适宜的降解性及较佳的成骨诱导性。目的:通过3D打印技术制备明胶/海藻酸钠/58S生物活性玻璃支架,研究其体外性能及生物安全性。方法:将明胶、海藻酸钠和58S生物活性玻璃与去离子水混合并搅拌均匀作为打印墨水,通过3D打印技术完成支架的制备,交联后冻干。(1)体外实验:采用扫描电镜和万能材料试验机检测支架的形态特征和抗压强度;将支架浸入模拟体液中16周,观察其降解速率;采用支架浸提液培养L929细胞3 d,观察细胞形态与生长状况;将支架与大鼠骨髓间充质干细胞共培养0,7,14,21 d,利用CCK-8法检测细胞增殖,DAPI染色观察细胞的黏附与存活,RT-PCR检测成骨相关基因的表达;(2)体内实验:在10只SD大鼠右下颌骨制备直径5 mm的全层骨缺损,实验组5只植入支架,空白组5只未植入支架,术后4周进行肝、肾功能检测、肝肾脑组织学与骨缺损区组织学观察。结果与结论:(1)体外实验:扫描电镜显示支架表面粗糙,呈蜂窝状结构;支架的平均杨氏模量为272.33 MPa;浸泡于模拟体液中前6周时,支架降解较快且速度均匀,第6周后降解速率减慢,仍大致保持均一的降解速率,在16周时降解率达18%;倒置显微镜显示,L929细胞在支架浸提液中生长良好,形态结构完好;随着培养时间的延长,骨髓间充质干细胞的增殖率增加;DAPI染色显示,骨髓间充质干细胞黏附于支架表面生长,由开始的堆积生长逐渐爬行及向四周扩展;RT-PCR检测显示,支架可促进骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2、骨钙素、RUNX2 mRNA的表达;(2)体内实验:实验组支架植入后未影响大鼠肝、肾功能,未造成肝、肾和脑组织的病理损害;下颌骨骨缺损标本苏木精-伊红染色显示,实验组支架未完全降解,新生骨连接宿主骨与余留支架,新生骨组织周围可见少量成骨细胞浸润及炎性细胞浸润,空白组宿主骨边缘见少量新生骨及大量纤维组织;(3)结果表明,3D打印明胶/海藻酸钠/58S生物活性玻璃骨缺损修复支架的细胞相容性良好,无明显细胞毒性及组织毒性,具有良好的生物安全性。     

3D打印生物墨水在组织修复与再生医学中的应用

背景：通过选用合适的生物墨水，3D打印技术可用以制造人体组织和器官的代替物，并在人体内发挥作用。近些年来3D打印技术发展迅速，在再生医学中有着巨大的应用潜力。目的：介绍3D打印用生物墨水的类型，并综述生物墨水的分类、应用、优缺点及未来愿景。方法：以“3D printing,Biological ink,Tissue engineering,hydrogel,Synthetic material,Cytoactive factor,3D打印、生物墨水、组织工程”为检索词，运用计算机检索2000-2022年以来发表在PubMed、CNKI数据库中的相关文献，最终纳入83篇进行综述。结果与结论：在过去的几十年里，生物3D打印技术发展迅速，在组织工程和生物医学等各个领域都受到了极大的关注。相对于传统生物支架制造方法在功能性及结构方面受到的限制，3D打印可以更好地模拟生物组织复杂的结构，并且具有合适的力学、流变学和生物学特性。生物墨水是3D打印中必不可少的一部分，通过生物材料制备的生物墨水，经打印后产生的生物支架在组织修复和再生医学等方面有着巨大的科研潜力及临床意义，其材料的研究本身也越来越受到...     

基于同轴流技术的肝组织生物3D打印研究

生物三维打印为医疗领域提供全新的技术可能,可广泛应用于制造人工组织和器官。人工组织的功能和尺寸大小受限于组织的血管化,可利用同轴流挤出系统制造封装肝细胞的中空细丝,结合生物3D打印系统,叠层制造含微通道网络的肝组织。首先搭建集成化的同轴流生物3D打印系统,研究材料挤出速率、材料浓度等参数对中空细丝尺寸及出丝速度的影响;然后以肝细胞株C3A为材料,打印含多层管网机构的仿生肝组织;最后,对含微通道的肝组织进行分组培养,利用细胞活死染色法检测第24、48、72 h肝细胞在灌流组和非灌流组中的细胞存活率。实验表明,同轴流3D打印的组织,中空细丝之间有效融合,支架内部的立体微通道网络完整;打印过程对肝细胞损伤较小,中空细丝中的肝细胞存活率达90%以上;灌流组和非灌流组在培养72 h后,细胞存活率有显著的差异,证明对微通道灌流可以促进组织内部的物质交换,提高微通道周围肝细胞的存活率。研究提出打印方法和灌流系统,为人工组织的血管化以及培养方式提供全新的思路。     

3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合支架与骨髓间充质干细胞的体外生物相容性

文题释义： 3D打印技术：是通过计算机设计3D模型,按照某一坐标轴切成无限多个剖面,然后层层打印堆叠形成一个实体的立体模型,使用3D打印技术制备的骨组织工程支架能对支架的内部结构和外形进行自由可控的构建,在支架个性化、精确性、机械强度、孔隙调节、空间结构复杂性方面有独特优势。 纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合材料：羟基磷灰石是人体和动物骨骼的主要无机成分,具有良好的骨诱导性,纳米羟基磷灰石由于良好的生物相容性和骨整合能力被广泛用作骨缺损的修复材料;聚己内酯是一种已被FDA批准的生物材料,具有良好的机械性能、生物相容性及降解性。两种材料复合物的多孔结构能够为细胞生长、组织再生及血管化提供有利条件。 背景：聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合材料是在常用骨组织工程材料基础上结合3D打印技术制备的新型复合支架材料,目前对于该复合材料的体外生物相容性研究较少。 目的：通过体外实验探讨3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合支架材料的细胞相容性。 方法：利用3D打印技术分别制备聚己内酯及聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合支架,表征两组材料的微观结构、孔隙率及力学性能。将大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于两组支架表面,CCK-8法检测细胞增殖率,扫描电镜和Live/Dead染色观察细胞在支架上的生长情况。 结果与结论：①两组支架均呈三维网状相互连通结构,纤维呈规律有序的排列、相互交错,纤维表面无空隙,纤维间距、直径较为均一;两组支架的孔隙率比较差异无显著性意义(P > 0.05);复合支架的弹性模量高于单纯聚己内酯支架(P < 0.05);②两组支架表面培养1 d的细胞增殖比较差异无显著性意义(P > 0.05),复合支架表面培养4,7 d的细胞增殖快于单纯聚己内酯支架(P < 0.05);③Live/Dead染色结果显示,两组材料均具有良好的细胞相容性,细胞活性较高,同时复合支架上的贴壁细胞更多一些;④扫描电镜显示,细胞在两种材料上生长形态良好,并紧密黏附于支架表面及微孔附近,同时可见分泌的细胞外基质呈丝状包绕于细胞周围;⑤结果表明,3D打印技术制备的聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合支架孔隙较丰富,具备良好的力学性能,细胞相容性良好,可作为骨组织工程的支架材料。 ORCID: 0000-0002-7083-6458(胡超然) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程     

丝素蛋白/聚己内酯纳米纤维支架生物相容性评价

目的:改善再生丝素蛋白的降解性及力学性能,评价丝素蛋白/聚己内酯纳米纤维支架神经生物材料的生物相容性。方法:采用静电纺丝技术制备丝素蛋白/聚己内酯纳米纤维支架。体外培养雪旺细胞并与支架及其浸提液共培养,通过荧光染色,细胞毒性试验(MTT法)检测其细胞生物相容性。将纤维支架材料在体外置于蛋白酶ⅪV溶液评价其体外降解行为;通过皮下埋植实验观察纤维材料在体内的局部组织反应。结果:丝素蛋白/聚己内酯支架材料,呈现三维网状结构。雪旺细胞具有良好的生长形态;无细胞毒性。随着丝素蛋白比例的降低,能够显著增加混合支架的降解速度。皮下移植实验未引起明显免疫排斥反应,炎症反应轻。结论:丝素蛋白/聚己内酯支架具有良好的生物相容性和生物可降解性,有望用于神经组织工程支架材料修复神经缺损。     

喷墨打印技术同步打印细胞和生物支架材料及在组织工程中的应用

背景：喷墨打印技术是将墨滴喷射到接受体形成图像或文字的非接触性打印技术。 目的：总结并讨论喷墨打印技术的研究进展及其在组织工程中的运用。 方法：由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI：1995/2010)和PubMed数据库(1995/2010),检索词分别为“喷墨打印技术,细胞打印,生物材料,细胞因子”和“inkjet printing,cell printing,biomaterial,cytokine,organ printing”。共检索到352篇文章,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入35篇文章。从喷墨打印技术研究进展及其在组织工程中的运用2个方面进行总结,对喷墨打印技术在细胞打印、生物支架材料打印、细胞活性因子打印及细胞-生物支架材料同步打印的应用等方面进行介绍。 结果和结论：喷墨打印技术作为一种新型组织工程技术,在组织与器官打印研究中有广泛的运用前景。该技术可以打印多种细胞,打印后的细胞能够存活和保持原有生物学活性,而且喷墨打印技术通过打印水凝胶支架材料,构建具有良好的三维结构的3D水凝胶支架。此外,运用喷墨打印技术可以打印细胞活性因子,并保持其生物学活性。通过同步打印细胞和生物支架材料,喷墨打印技术有望构建3D细胞-生物支架材料复合的仿生组织和器官。     

生物打印在肌肉骨骼界面重建中的应用

文题释义：生物打印：是一种能够在数字三维模型辅助下,根据增材制造原理定位装配生物材料或细胞单元,从而制备组织工程支架和组织器官等制品的一种新兴技术。 肌肉骨骼界面：是指肌肉骨骼系统中存在的一系列结构、功能和工程相似的部位,其通过肌肉和骨骼附着实现平滑连接,通常这些界面主要包括骨-肌腱、骨-韧带和骨-软骨等。其工作原理和潜在机制使它们成为组织的独特分支,其在细胞组分上显著不同,但在结构和功能上是一致的。 背景：肌肉骨骼损伤和退行性疾病的手术治疗常涉及肌肉骨骼界面的重建,而实现肌肉骨骼界面与周围宿主组织的生物整合的关键是制造具有精确结构和不同材料的替代物。生物打印技术获得的人工组织可与天然肌肉骨骼界面组织具有相似的物理结构和生物活性。 目的：介绍肌肉骨骼界面组织的结构和生物功能特性,以及生物打印技术在肌肉骨骼界面重建中的应用。 方法：由第一作者以“bioprinting, musculoskeletal interface,生物打印,肌肉骨骼界面”为关键词,检索2005至2019年期间PubMed、Web of Science、Springerlink、Medline、万方、CNKI数据库中的相关文献。初检文章201篇,筛选后对60篇文章进行分析。 结果与结论：理想的生物打印肌肉骨骼界面移植物必须结构上与原界面组织相对应,以维持体内多变的生物力学环境;其次,植入之后必须保持这些植入物的生物活性,以开始修复和替换缺陷区域的功能。生物打印技术的发展为解决肌肉骨骼界面的重建带来了希望,但其仍然存在许多挑战：仿生功能性界面结构机械性能的提高、多个仿生结构的整合、生物打印结构的血管化,以及对力学刺激在界面组织发育和再生中的作用缺乏深入的研究。对于未来界面组织工程的研究方向,可以预料的是将种子细胞、细胞因子和基因治疗,以及生物反应器纳入界面组织工程支架中的一大热点,为解决界面组织整合这一难题提供创新性的解决方案。 ORCID: 0000-0002-6668-5036(张君伟) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程     

丝素蛋白材料在组织工程中的新进展

背景：丝素蛋白支架已被建议运用在组织工程骨和软骨重建、肌腱重建、血管重建,神经重建以及膀胱重建等各方面。 目的：总结丝素蛋白作为支架在生物材料和组织工程领域的应用与发展。 方法：由第一作者应用计算机检索PubMed数据库及中国期刊数据库2000年1月至2011年11月有关丝素蛋白支架制备工艺,丝素蛋白支架修饰方法及丝素蛋白在组织工程中的应用等方面的文献。 结果与结论：丝素蛋白具有机械强度高、生物降解性慢、生物相容性良好、制备工艺多样等特点,支持多种细胞黏附、分化和生长,可应用于人工韧带、血管、骨、神经组织等方面。近期以丝素蛋白支架作为载体,通过多种方式添加各种生物制剂,比如各种生长因子和细胞因子,进一步扩大丝素蛋白在组织工程中的应用范围。     

基于3D打印细胞培养支架内部血管通道的模拟与构建

传统的三维支架细胞培养技术已能较好地实现细胞在培养过程中的空间排布,但是其结构仍不具有类血管网络的通道结构,尚不能完全模仿人体内部的细胞生长环境。在3D打印生物支架的基础上,借助强制结构优化方法,利用VS平台上的C++自编译软件,在三维生物支架STL模型内部构建出模拟的三维血管通路,生成新的三维生物支架STL模型,并利用3D生物打印机打印出实物。通过对打印支架的空隙和血管大小的统计分析以及与数字模型的参数对比分析得出,打印出的实物支架孔隙(孔隙间距、线宽)的平均值及打印血管(孔隙间距、线宽)的平均数据与对应数字模型的设定数据的误差均在5%以内,符合设计要求。另外,该研究可增加细胞培养支架内部液体的流通性,使支架结构进一步接近人体内环境,为模拟人体内液体循环对于细胞生长的影响提供可能。     

Calcium alginate beads embedded in silk fibroin as 3D dual drug releasing scaffolds

3D scaffolds based on embedding drug loaded calcium alginate beads within silk fibroin protein were fabricated for investigating controlled dual drug release. The 3D matrices were evaluated for in vitro release using two different molecular weight model compounds, bovine serum albumin (66 kDa) and FITC–Inulin (3.9 kDa). The model compound release profiles revealed dependence on molecular weight of encapsulated model drugs for sustained release. Further, silk fibroin protein blended calcium alginate beads resulted in prolonged drug release without initial bursts for 35 days as compared to calcium alginate beads without silk fibroin as control. The release kinetics were further tested as a function of wt% silk content for scaffold fabrication suggesting their possible role in restricting initial burst and leading to sustainable release of compounds for prolong time. Silk coatings on calcium alginate beads provided mechanically stable shells as well as a diffusion barrier to the encapsulated protein drugs thus controlling their release. Scanning electron microscopic observations were carried out to assess cellular viability and biocompatibility of bead embedded-silk 3D scaffolds using fibroblast cells. The results highlight the versatile and tunable properties of calcium alginate embedded fibroin 3D scaffolds making them exciting candidate for the controlled release of a wide spectrum of bioactive molecules from a single delivery vehicle.     

丝素蛋白/壳聚糖三维多孔支架的构建及结构表征**

背景：丝素蛋白和壳聚糖均无毒性且具有良好的生物相容性,但是单一成分作为生物支架时都不能满足支架材料的需求。 目的：制备各种不同组分的丝素蛋白及壳聚糖复合支架材料,观察其微观结构及相关性能,筛选出适合成骨细胞生长的理想支架材料。 方法：通过CaCl2∶C2H5OH∶H2O=1∶2∶8(摩尔比)溶解体系溶解、过滤、浓缩提纯,制备出2%的丝素蛋白溶液,壳聚糖溶解于乙酸溶液配制成的3%壳聚糖溶液,将两者以不同的比例相混合,经数次冷冻干燥后,得到成品支架材料。采用电镜观察形貌,计算孔隙率并对支架的结构进行红外、X射线衍射、电子能谱分析观察。 结果与结论：将壳聚糖和丝素蛋白共混后,互为改性,制备出了结构较稳定的支架材料。其中40%丝素蛋白-60%壳聚糖组具有适合成骨细胞生长的较佳孔径,可作为细胞支架的首选配比。 关键词：丝素蛋白;壳聚糖;骨组织工程;支架;生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.12.025     

丝蛋白应用于牙周组织工程的可行性

背景：丝蛋白是有利于表皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞、血管内皮细胞、胶质细胞黏附和生长的一种新型生物材料。 目的：评估丝蛋白作为支架材料应用于牙周组织工程的可行性。 方法：采用组织块法培养人牙周膜细胞,将第5代细胞悬液以2×10⁷ L^-1的浓度接种到丝蛋白支架材料上复合培养,并以1%,10%,50%,100%的丝蛋白支架浸提液培养,观察人牙周膜细胞在丝蛋白上及在丝蛋白浸提液中生长状况,用MTT法测定浸提液培养人牙周膜细胞的活力。 结果与结论：扫描电镜可见人牙周膜细胞在丝蛋白支架上伸展充分,生长旺盛,不同浓度丝蛋白支架浸提液培养对人牙周膜细胞的增殖与碱性磷酸酶活性均无影响。说明丝蛋白材料具有良好的生物相容性、独特的力学性能,可作为人牙周膜细胞黏附生长的理想支架材料较好地应用于牙周组织工程中。     

Preparation of uniaxial multichannel silk fibroin scaffolds for guiding primary neurons

Physical guidance cues have been exploited to stimulate neuron adhesion and neurite outgrowth. In the present study, three-dimensional (3-D) silk fibroin scaffolds with uniaxial multichannels (42-142 μm in diameter) were prepared by a directional temperature field freezing technique, followed by lyophilization. By varying the initial silk fibroin concentration, the chemical potential and quantity of free water around cylindrical ice crystals could be controlled to control the cross-section morphology of the scaffold channels. Aligned ridges also formed on the inner surface of the multichannels in parallel to the direction of the channels. In vitro, primary hippocampal neurons were seeded in these 3-D silk fibroin scaffolds with uniaxial multichannels of ～120 μm in diameter. The morphology of the neurons was multipolar and alignment along the scaffold channels was observed. Cell-cell networks and cell-matrix interactions established by newly formed axons were observed after 7 days in culture. These neurons expressed β-III-tubulin, nerve filament and microtubule-associated protein, while glial fibrillary acidic protein immunofluorescence was barely above background. The ridges on the inner surface of the channels played a critical role in the adhesion and extension of neurons by providing continuous contact guidance. These new 3-D silk scaffolds with uniaxial multichannels provided a favorable microenvironment for the development of hippocampal neurons by guiding axonal elongation and cell migration.     

Silk coatings on PLGA and alginate microspheres for protein delivery

Bombyx mori silk fibroin self-assembles on surfaces to form ultrathin nanoscale coatings based on our prior studies using layer-by-layer deposition techniques driven by hydrophobic interactions between silk fibroin protein molecules. In the present study, poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) and alginate microspheres were used as substrates and coated with silk fibroin. The coatings were visualized by confocal laser scanning microscopy using fluorescein-labeled silk fibroin. On PLGA microspheres, the coating was approximately 1microm and discontinuous, reflecting the porous surface of these microspheres determined by SEM. In contrast, on alginate microspheres the coating was approximately 10microm thick and continuous. The silk fibroin penetrated into the alginate gel matrix. The silk coating on the PLGA microspheres delayed PLGA degradation. The silk coating on the alginate microspheres survived ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) treatment used to remove the Ca(2+)-cross-links in the alginate gels to solubilize the alginate. This suggests that alginate microspheres can be used as templates to form silk microcapsules. Horseradish peroxidase (HRP) and tetramethylrhodamine-conjugated bovine serum albumin (Rh-BSA) as model protein drugs were encapsulated in the PLGA and alginate microspheres with and without the silk fibroin coatings. Drug release was significantly retarded by the silk coatings when compared to uncoated microsphere controls, and was retarded further by methanol-treated silk coating when compared to silk water-based coatings on alginate microspheres. Silk coatings on PLGA and alginate microspheres provide mechanically stable shells as well as a diffusion barrier to the encapsulated protein drugs. This coating technique has potential for biosensor and drug delivery applications due to the aqueous process employed, the ability to control coating thickness and crystalline content, and the biocompatibility of the silk fibroin protein used in the process.